Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 7
1.1 Дисбактериозы кишечника, причины возникновения 7
1.2 Функциональное питание как наиболее перспективное направление в пищевой промышленности 10
1.3 Конструирование пробиотических культур в молочных продуктах, направленных на коррекцию микрофлоры желудочно-кишечного тракта 13
1.3.1 Бифидобактерии как основа пробиотиков и их биологическая роль 17
1.3.2 Биотехнологические аспекты приготовления заквасок, БАД и продуктов с использованием бифидобактерии 21
1.3.3 Основные требования, предъявляемые к бифидобактериям, используемым в качестве пробиотиков 24
1.4 Бифидогенные факторы, нормализующие микроэкологический статус толстой кишки 26
1.4.1 «In vitro» и «in vivo» бифидогенное действие пищевых волокон 29
1.4.2 Фруктоолигосахариды и гуммиарабик как физиологически функциональные ингредиенты в продуктах функционального питания 32
1.5 Синбиотики как новое поколение биопродуктов и перспективность их разработки 36
1.6 Заключение по обзору литературы. Цели и задачи исследований 39
2 Организация эксперимента, изучаемые объекты и методы исследований 41
2.1 Организация эксперимента 41
2.2 Объекты исследований 43
2.3 Материалы и питательные среды 44
2.4 Методы исследований 47
2.4.1 Физико - биохимические методы исследований 47
2.4.2 Микробиологические методы исследований 48
2.4.3 Математические методы исследования 51
2.4.4 Статистическая обработка результатов 52
3 Характеристика пробиотической биомассы синбиотических продуктов 53
3.1 Обоснование подбора бифидобактерий к составу синбиотических композиций 53
3.2 Исследование свойств новых штаммов бифидобактерий 54
3.3 Изучение сочетаемости штаммов бифидобактерий, входящих в состав консорциума 63
4 Разработка технологии синбиотических продуктов 66
4.1 Обоснование выбора бифидогенных волокон для введения в единые синбиотические системы 66
4.1.2 Разработка рациональной концентрации и способа внесения Fibregum AS в состав синбиотической композиции 67
4.1.3 Разработка способа внесения и рациональной концентрации Floracia в состав синбиотической композиции 76
4.2 Характеристики новых синбиотических продуктов с пищевыми волокнами 79
4.2.1 Исследование свойств единых биотехнологических систем бифидобактерий с пребиотиком Fibregum 79
4.2.2 Комплексные исследования показателей синбиотических продуктов с
консорциумом бифидобактерий и бифидогенными волокнами 94
4.3 Описание технологического процесса производства синбиотических продуктов 105
4.4 Улучшение органолептических свойств целевого продукта и его высушивание 108
5 Изучение показателей качества в процессе хранения синбиотических продуктов
5.1 Поведение бифидобактерий в процессе хранения синбиотического продукта
5.2 Аппроксимация результатов исследований 115
6 Изучение терапевтической эффективности готового синбиотического продукта 127
6.1 Влияние эндотоксина Е. coli 055:В5 на микрофлору кишечника крыс в
период послеоперационной эндотоксемии и оценка терапевтических свойств
синбиотического продукта 127
Выводы 137
Библиографический список 139
Приложения 161
- Функциональное питание как наиболее перспективное направление в пищевой промышленности
- Биотехнологические аспекты приготовления заквасок, БАД и продуктов с использованием бифидобактерии
- Исследование свойств новых штаммов бифидобактерий
- Разработка рациональной концентрации и способа внесения Fibregum AS в состав синбиотической композиции
Введение к работе
Одним из важнейших факторов определяющих состояние здоровья населения, является питание. Адекватное питание обеспечивает нормальный рост и развитие детей, способствует профилактике заболеваний, повышению работоспособности и продлению полноценной жизни людей.
В связи с фиксируемой тенденцией ухудшения здоровья населения проблема здорового питания в последние годы вышла на государственный уровень. Реальным решением этой проблемы является разработка новых технологий продуктов функционального назначения, удовлетворяющих не только физиологические потребности организма человека в пищевых веществах и энергии, но и выполняющих профилактические и лечебные функции [20,23, 40, 71, 88,118,108,109].
Одна из областей активных исследований в области функционального питания - поддержание микроэкологического равновесия в желудочно-кишечном тракте (ЖКТ). Следует отметить, что микробиоценоз макроорганизма представляет собой высокочувствительную индикаторную систему, которая реагирует количественными и качественными сдвигами на изменение состояния здоровья организма [24, 34, 75, 80, 113]. В этой связи весьма перспективным в настоящее время считается направление, связанное с получением продукции с пробиотическими, пребиотическими и синбиотическими свойствами. Наиболее эффективный путь нормализации дисбаланса кишечного микробиоценоза заключается в применении синбиотиков (комплекс пробиотиков и пребиотиков) и продуктов на их основе, так как при этом, не только имплантируются вводимые микроорганизмы, но и стимулируется собственная микрофлора. Значение подобной продукции весьма актуально для России, в которой значительные слои населения проживают в экологически неблагоприятных регионах, работают в условиях вредных физических, химических и прочих воздействий, недостаточно или несбалансированно питаются, что приводит к возникновению кишечных дисбактериозов.
Сегодня перспективным приемом в создании синбиотических функциональных продуктов является поиск и внедрение в производство субстанций природного происхождения, обладающих одновременно технологической и физиологической функциональностью. Такими являются пищевые волокна (ПВ), необходимость восполнения которых в рационе питания современного человека существует. Способность пищевых волокон воздействовать на полезную микрофлору кишечника, усиливать бактериальную ферментацию, проявлять адсорбирующий эффект, оказывать трофическое действие на слизистую оболочку тонкого кишечника позволяет создавать эффективные синбиотики и продукты на их основе.
Научные представления и практические основы в вышеизложенных направлениях заложены в трудах Гончаровой Г.С., Шендерова Б.А., В.Ф. Семенихиной, Храмцова А.Г., Харитонова В.Д., Шевелевой С.А., Донской Г.А., Евдокимова И.А., Рябцевой С.А., Гавриловой Н.Б., Остроумова Л.А., И.А. Рогова, Титова Е.И., Токаева Э.С., Ганиной В.И., Хорольского В.В., Sanders М.Е., Fuller R., Tannock G.W., Gibson G.R., Shin H.S., Arai S., Morinaga Y.
Продукты функционального питания (ПФП) на молочной основе с пищевыми волокнами на отечественном рынке являются востребованными. Ограниченность сведений о создании синбиотических продуктов, потребность в которых существует, затрудняет производство подобной продукции. В этой связи разработка технологий синбиотических продуктов на молочной основе является актуальной.
Цель настоящей работы - разработка технологии новых синбиотических функциональных продуктов на молочной основе путем установления рациональных концентраций и способов внесения пищевых волокон с пребиотическими свойствами в молоко, а также исследование терапевтических свойств данных продуктов.
Функциональное питание как наиболее перспективное направление в пищевой промышленности
Термин «функциональный» неразрывно связан с физиологией питания -разделом нутрициологии, изучающей пищевые вещества и компоненты пищи, их действие и взаимодействие, метаболизм и роль в поддержании здоровья или возникновении заболеваний. Впервые появление термина «функциональные» в отношении продуктов питания датируется 1984г в Японии. В 1991г. была сформулирована концепция пищевых продуктов, специально используемых для поддержания здоровья (FOSHU - Food for specified health use), которая вскоре получила активную поддержку во многих странах мира. На 2002 год в Японии было зарегистрировано около 298 наименований таких продуктов, 60% которых направлено на коррекцию расстройств ЖКТ [175,185].
Директор НИИ питания РАМН академик Тутельян В.А. назвал ПФП продуктами с заданными свойствами, обогащенными эссенциальными пищевыми веществами и микронутриентами [99]. Ученые, занимающиеся проблемами функционального питания (ФП) в Московском государственном университете пищевых производств (Тужилкин В.И, Доронин А.Ф., Кочеткова А.А., Шендеров Б.А., Нечаев А.П. и др.) трактуют ФП, как пищевые продукты, предназначеные для систематического (регулярного) употребления в составе обычных пищевых рационов всеми группами здорового населения, полезные для здоровья, т.е. сохраняющие и улучшающие его состояние, снижающие риск развития связанных с питанием (алиментарных) заболеваний, за счет наличия в их составе пищевых функциональных ингредиентов, обладающих способностью оказывать благоприятный эффект на одну или несколько физиологических функций, метаболических и\или поведенческих реакций организма человека [29,40, 57, 114,115]. На сегодняшнем этапе развития рынка эффективно используются следующие категории функциональных ингредиентов: пищевые волокна, олигосахариды, полиненасыщенные жирные кислоты, холины, сахароспирты, изопреноиды и витамины, минеральные вещества, пробиотики, аминокислоты, пептиды, протеины, нуклеиновые кислоты, гликозиды, многоатомные спирты, органические кислоты, антиоксиданты и другие фитопрепараты. [41, 47, 52, 84, 94, 98,114].
Функциональные ингредиенты должны соответствовать следующим требованиям: - они должны быть полезными для здоровья и быть натуральными; - их полезные качества должны быть научно обоснованы; - их ежедневные дозы должны быть одобрены специалистами по медицине и питанию; - они должны быть безопасными с точки зрения сбалансированного питания; - должны иметь точные физико-химические показатели и точные методики их определения; - не должны уменьшать питательную ценность пищевых продуктов; - должны употребляться перорально; - не должны изменять основные органолептические свойства обогащаемого продукта; использование функциональных ингредиентов должно быть экономически выгодным; - порция продукта должна содержать от 10 до 50% рекомендуемой нормы потребления равномерно распределенного функционального ингредиента [8, 94]. Функциональные ингредиенты обладают антиканцерогенным, антимикробным, антитромбозным, антиоксидантным, иммуномодулирующим, улучшающим пищеварение и регулирующим кровяное давление, противовоспалительным, антихолестериновым и другими полезными для здоровья действиями [107,175].
Биотехнологические аспекты приготовления заквасок, БАД и продуктов с использованием бифидобактерии
Тенденция последних лет такова, что биопродукты, имеющиеся на нашем рынке, преимущественно производят традиционными способами с последующим обогащением их лиофильно высушенными концентратами микроорганизмов [39]. В тоже время по данным литературных источников пробиотическое действие продуктов в организме обусловлено как самими клетками бактерий, так и продуктами их жизнедеятельности, которые накапливаются при непосредственном развитии микроорганизмов в питательной среде [21, 116, 117]. Первый путь наиболее прост и доступен для реализации в промышленных условиях, а второй - более сложный, поскольку бифидобактерий медленно развиваются в молоке, и поэтому создание заквасок для получения кисломолочного продукта с требуемыми органолептическими показателями и с определенным уровнем клеток в продукте является трудной задачей.
В настоящее время, при производстве бактериального концентрата и заквасок (в том числе и пробиотических), приготовляемых на основе бактериальной массы, бактериальные клетки наращиваются в периодическом режиме культивирования при поддержании температуры и рН на заданном уровне, в замкнутом объеме питательной среды - в ферментере [123]. Другой способ наращивания клеток - непрерывное культивирование предусматривает постоянный приток питательной среды и одновременное удаление продуктов жизнедеятельности. В результате этого микроорганизмы приобретают способность к продуктивному незатухающему во времени росту. Важнейшие преимущества последнего метода высокий выход продукции с существующего оборудования и возможность автоматического регулирования процесса [9, 45, 81,83].
В производстве бифидосодержащих продуктов схематично можно выделить несколько принципиально общих этапов: приготовление заквасочных культур, подготовка сырья и материалов, заквашивание питательной основы путем внесения в асептические ферментеры производственной закваски и контроль за процессом по регламентированным параметрам (количество клеток, рН, температура, содержание кислорода, время ферментации и т.д.), асептический розлив и контроль готовой продукции. Нужно отметить, что с микробиологической точки зрения наиболее целесообразно использовать в технологическом процессе стерильное сырье и материалы [113].
Согласно рекомендациям International Dairy Federation, продукт с бифидобактериями должен содержать, по крайней мере, 10 живых организмов в 1 мл или 1г во время потребления, чтобы влиять благотворно на здоровье потребителя [133, 179]. Следовательно, для сохранения функциональных свойств пробиотические культуры должны выдержать обработку и хранение пищи в промышленных условиях [33,155].
Жизнеспособность пробиотических бактерий зависит от видов или штаммов бактерий и взаимоотношений между ними, условий среды, образования перекиси водорода в процессе метаболизма, конечной кислотности продукта (концентраций уксусной и молочной кислоты), а также от наличия нутриентов, ростовых промоторов и ингибиторов, концентраций Сахаров, количества инокулята, температуры инкубации, времени ферментации, технологической обработки (центрифугирование, ультрафильтрация), замораживания, сушки, действия кислорода и увелечения осмотического давления из-за присутствия соли, температуры хранения. В пищеварительным тракте негативными факторами являются удаление влаги и длительное пребывание в кислых условиях желудка, антимикробные компоненты (в основном, продуктов), желчные кислоты и действие кислорода [91, 133, 156, 179].
Для повышения жизнеспособности в последние годы развиваются технологии по микрокапсулированию пробиотиков с целью сохранения их жизнеспособности во время прохождения через пищеварительный тракт, производства и в процессе хранения продукта. Grittenden R. и соавторы предлагают в этих новых технологиях использовать крахмал, который первую очередь утилизируется бифидобактериями, а в последствии они адгезируются на нем [126]. Из немногих литературных источников известно, что использование гуммиарабика в процессе сушки также влияет положительно на жизнеспособность пробиотиков, в частности на бифидобактерии В. longum и B.infantis [71,150, 158].
Токсикация кислородом является важной и критической проблемой для жизнеспособности бифидобактерии. Во время производства продуктов с бифидобактериями кислород может раствориться в молоке. Чтобы избежать контакта с кислородом, производство пробиотических продуктов нужно оснащать необходимым оборудованием для создания анаэробных условий. Некоторые авторы предлагают деаэрацию молока, так как в таком сырье замечен высокий уровень жизнеспособных клеток. С повышением окислительно - восстановительного потенциала, что происходит при проникновении кислорода в клетку, инактивируются некоторые ферментативные системы и снижается жизнедеятельность культуры [95, 156 179]. По результатам исследований Dave R. и Shah N. процент жизнеспособности бифидобактерии в стеклянных бутылках, по сравнению с пластиковыми, повышается от 30 до 70% [133].
Создание кисломолочных продуктов, пищевых добавок и заквасок с пробиотиками в жидком виде имеет преимущества перед сухими, что можно объяснить рядом причин, среди которых одной из главных является физиологически активное состояние бактерий. При этом они богаты белками, незаменимыми аминокислотами, ненасыщенными жирными кислотами, витаминами и, что немаловажно, более дешевы, чем сухие пробиотические препараты [31]. Есть данные, подтверждающее, что антагонистические свойства пробиотических микроорганизмов, присутствующих в свежеприготовленной жидкой форме, более выражены, чем у тех же штаммов, находящихся в лиофилизированном состоянии [26, 27]. Более того, проводились опыты по изучению антагонистического действия по отношению к Е. coll, Staph, aureus, Salm. dublin кисломолочных продуктов пробиотического назначения, полученных путём обогащения уже готовых продуктов штаммами -пробиотиками и непосредственным сквашиванием молока. Полученные результаты свидетельствовали о более сильном проявлении антагонистического действия пробиотических продуктов, полученных вторым способом [21].
Исследование свойств новых штаммов бифидобактерий
Промышленный выпуск стартовых культур бифидобактерий и их применение в производственных процессах стали возможными в результате большой работы по селекции бифидобактерий и изучению их биохимических и культуральных свойств, так как одним из важных направлений при создании продуктов с пробиотическими культурами, является поиск микроорганизмов со стабильным заданным комплексом свойств.
В этой связи исследовали физиолого-биохимические свойства (отношение к различным значениям рН и концентрациям желчи и NaCl, фенолу), которые являются косвенными показателями приживаемости исследуемых штаммов в желудочно-кишечном тракте человека. Результаты представлены в таблице 4 и 5.
При микроскопировании штаммов Bifidobacterium 667, 668, 669, 670 наблюдали неспорообразующие, грамположительные палочки, слегка изогнутыми и разветвленными формами с гантелевидными утолщениями на концах. Клетки располагались хаотично, отдельно или в скоплениях. Неразветвленные формы были более характерны для молодой культуры микроорганизмов, а ветвящиеся с утолщениями - более старых. Часто встречались скопления палочек в виде "китайских иероглифов", "римских пятерок". На среде контроля морфология колоний выглядели ракетоподобными и в виде усеченной треугольной пирамиды белого или серого цвета. Размеры колоний от 0,5 до 5мм.
Примечание «+»- наличие роста; «-»- отсутствие роста, «±» - слабый рост Штаммы бифидобактерий Bifidobacterium 667, 668, 669, 670 не образовывали каталазу, сероводород, не восстанавливали нитраты в нитриты, не разжижали желатин. Устойчивость к желчи является одним из важнейших свойств микроорганизмов, относящих к пробиотикам. Желчь поступает в дуоденальный отдел кишечника, что обусловливает отмирание большого количества бактерий, так как их клеточные мембраны, состоящие из липидов и жирных кислот, очень чувствительны к разрушению солями желчных кислот. Имеются результаты исследований по оценке транзитной выживаемости бифидобактерий в кислой среде, предпринятых Lee К. и Нео. По их же данным в модельной среде выживаемость бифидобактерий строго зависит от множества параметров: концентрации желчи, исходных клеток и видов бифидобактерий [135,157].
Штаммы бифидобактерий Bifidobacterium 667, 668, 669, 670 обладали устойчивостью к высокой концентрации (20%) и 40%) желчи; к 0,4% раствору фенола; 2, 4, 6,5%» NaCl и развивались в среде с низкими и высокими показателями рН (4,0; 4,5; 8,3; 9,2).
Полученные экспериментальные данные могут служить основой для прогнозирования способности бифидобактерий Bifidobacterium 667, 668, 669, 670 к сохранению ими ферментативной активности по мере прохождения через ЖКТ и приживаемости в кишечнике, а также прогнозирования выживаемости живых бифидобактерий в составе пищевых продуктов в процессе холодильного хранения последних, что является одним из важнейших требований, предъявляемым к пробиотическим культурам.
Разработка рациональной концентрации и способа внесения Fibregum AS в состав синбиотической композиции
Известные технические решения, относящиеся к способам производства кисломолочных продуктов, пищевых добавок и заквасок, как правило, предусматривают приготовление питательной среды, её пастеризацию или стерилизацию, добавление инокулята, заквашивание до образования сгустка, который разливают в потребительскую тару и охлаждают.
Для приготовления ферментированного продукта, заквасок и БАД с бифидобактериями, важным фактором является именно микробиологически стерильная среда обитания, так как при использовании бифидогенных факторов остаточная флора, присутствующая в молоке, активно развивается, подавляя рост бифидобактерий. Особенно это важно для слабых штаммов бифидобактерий, но обладающих выраженными пробиотическими свойствами. Подготовка стерилизованной основы в приготовлении биологически активных добавок с пробиотическими культурами имеет большое значение, поскольку молоко не всегда сохраняет термоустойчивость в процессе стерилизации или пастеризации с большинством пребиотиков, особенно с полисахаридами и олигосахаридами. Применение для определенных биоактивных компонентов новых методов термической обработки, например, омических и индуктивных, высокой инфузии теплоты до настоящего времени полностью не изучено. Известно, что для сравнительно активных штаммов бифидобактерий в приготовлении кисломолочных продуктов, БАД, заквасок пребиотики добавляют после стерилизации или пастеризации молока, в стерильном или просто в чистом виде. Предварительная стерилизация наполнителей в производстве создает лишние затраты и неудобства.
На первом этапе проведены исследования по обоснованию рациональной концентрации Fibregum AS, благотворно влияющей на развитие бифидобактерий. На основании анализа литературы и учитывая вышеизложенное, было предложено исследовать четыре концентрации гуммиарабика от 0,5% до 2%. В обезжиренное молоко добавляли 0,5%, 1%, 1,5%, 2% Fibregum AS, перемешивали и стерилизовали. Удалось получить стерильную питательную смесь при концентрации Fibregum AS 0,5%). Следует отметить, что стерилизация молока вызывает разложение лактозы с образованием углекислого газа и кислот - муравьиной, молочной, уксусной и др. При этом кислотность молока увеличивается на 2-3Т [28]. Кислотность молока увеличивалась, также при добавлении Fibregum, что привело к заметному уменьшению рН молока и дестабилизации системы, так как величина рН среды имеет место в снижении термоустойчивости молока. Для поддержания рН на оптимальном уровне, повышали буферную емкость молока с гуммиарабиком, путем добавления соли стабилизатора - лимоннокислого трехзамещенного натрия, допустимый диапазон применения которого в молочной промышленности составляет 0,01 - 0,3 %. Повышение термоустойчивости молока при внесении солей происходит вследствие снижения количества ионов кальция [28]. Наибольшая концентрация Fibregum в молоке с буферной солью, при которой оно сохраняло термоустойчивость, составляла 1,5%, при этом, была отработана и наименьшая концентрация вносимого цитрата (0,06%). Следует отметить, что стерилизация проводилась в щадящих режимах.
В обезжиренное молоко (контроль) и образцы на основе обезжиренного молока, содержащие 0,5%, 1%, 1,5% Fibregum и соль стабилизатор вносили 5 % инокулята, после чего инкубировали при температуре (37±1)С до появления сгустка. Результаты исследования влияния разных концентраций Fibregum AS на динамику роста В. adolescentis В-1(а) приведены на рис.10 (приложение 3).
Анализ полученных результатов показал, что гуммиарабик активизировал развитие бифидобактерий в процессе ферментации, доводя количество клеток до уровня 10 КОЕ/см за 18-22 часа. Более того, при высокой концентрации Fibregum (1,5%) наблюдался наибольший рост количества клеток бифидобактерий в процессе ферментации. Количество клеток B.adolescentis В-1 в присутствии 1,5% Fibregum в среднем превышало их количество в 7,5 раз в сравнении с контрольным образцом. Картина получилась более выраженной по отношению к слабым штаммам бифидобактерий Bifidobacterium 667, 668, 669, 670. Результаты приведены в таблице 8 и 9. Количество клеток Bifidobacterium 667, 668, 669, 670 в питательной среде с 1,5%» Fibregum превышало их количество в среднем в 10, 4, 10 и 15 раз соответственно в сравнении с контрольным образцом.
Это послужило основанием для проведения дальнейших исследований по увеличению концентрации волокна акации. Для повышения концентрации Fibregum на 0,5%, с целью увеличения питательного субстрата для бифидобактерий, представлялось целесообразным использовать аминокислоту с щелочной реакцией (для увеличения рН молока). В связи с этим в питательную смесь с содержанием 1,5% и 2% гуммиарабика добавляли разные массовые доли L - аргинина (от 0,05 до 1%) и отработанную концентрацию цитрата, перемешивали, стерилизовали. Образцы с содержанием 1,5% гуммиарабика исследовались для построения грамотного сравнения полученных результатов, так как известно, что аргинин тоже является питательным субстратом для некоторых видов бифидобактерий [9, 31]. Диапазон концентрации аргинина выбрали исходя из анализа литературы и с учетом экономической целесообразности.
