Содержание к диссертации
Введение
ЧАСТЬ 1. Обзор литературы 9
1. Распространение кадмия в окружающей среде и его токсичность по отношению к человеку 9
2. Способы очистки воды от кадмия 11
3. Механизмы защиты микроорганизмов от тяжелых металлов 13
4. Токсическое действие тяжелых металлов на цианобактерии 15
4.1. Проникновение кадмия в клетку, локализация и места воздействия
4.2. Фотосинтетический аппарат цианобактерии и воздействие на него кадмия 16
4.2.1. Фотосистема 1 18
4.2.2. Электронтранспортная цепь 20
4.2.3. Фотосистема II , 21
4.2.4. Фикобилиновые пигменты 22
4.2.5. Фикобилисомы 25
4.2.6. Перенос энергии возбуждения от фикобилиновых пигментов на реакционные центры 26
4.2.7. Перераспределение энергии возбуждения между фотосистемами 29
5. Устойчивость микроорганизмов и растений к ионам кадмия и
других тяжёлых металлов 32
5.1. Полисахариды слизистых оболочек и их роль в связывании тяжелых металлов 32
5.2. Адсорбция тяжёлых металлов на поверхности клеток 36
5.3. Внутриклеточная аккумуляция кадмия 39
5.3.1. Металле вязы вающие белки 41
5.3.2. Связывание ионов Cd белками 44
5.3.3. Внедрение сульфида в Cd-белковый комплекс 45
6. Фотохимическая активность биосинтезированных кристаллитов CdS 48
ЧАСТЬ. 2. Объекты и методы 51
1. Основные объекты исследований 51
1.1. Цианобактерия N. muscorum 51
1.2. Stenotrophomonas maltophilia, один из выделенных спутников N muscorum 52
1.3. Фикобилиновый пигмент R-фикоэритрин 53
2. Условия выращивания цианобактерии 54
3. Получение бактериологически чистой (аксеничной) культуры N muscorum 55
3.1. Метод многократных пересевов 56
3.2. Метод изоляции гормогониев 57
3.3. Проверка на бактериальные загрязнения аксеничной культуры N. muscorum 58
4. Выращивание бактерии-спутников 58
5. Выделение бактерий-спутников N. muscorum 59
5.1. Отмывание клеток от среды 59
6. Выделение экзополисахаридов 60
7. Определение концентрации экзополисахаридов 60
8. Определение состава экзополисахаридов 61
9. Качественное определение сероводорода 62
9.1 Определение H2S по индикаторной бумаге с ацетатом свинца... 62
9.2. Определение Нг8 на железосодержащем агаре Клиглера 62
10. Определение концентрации хлорофилла 63
11. Определение ионов кадмия 63
11.1. Гистохимическое определение 63
11.2. Потенциометрический метод 65
11.3. Спектрофотометричесий метод 65
12. Метод определения филогенетического положения микроорганизмов, основанный на секвенировании гена 16S рРНК... 66
12.1. Выделение ДНК 66
12.2. Полимеразная цепная реакция гена 16S рРНК и секвенирование полученных продуктов 66
12.3. Анализ нуклеотидных последовательностей 16SpPHK 67
13. Синтез наночастиц CdS на R-фикоэритрине 67
14. Исследование фотохимических свойств CdS на R-фикоэритрине... 68
15. Электрофоретическая подвижность наночастиц CdS, стабилизированных R-фикоэритрином 69
16. Электронно-микроскопические исследования 69
17. Спектральные измерения 70
18. Разложение спектров поглощения и флуоресценции 71
19. Фотографирование 72
ЧАСТЬ 3. Результаты и их обсуждение 73
Глава 1. Влияние ионов кадмия на N. muscorum в зависимости от их концентрации и длительности воздействия 73
1.1. Морфология #. muscorum в отсутствие кадмия 73
1.2. Морфологические изменения N. muscorum в зависимости от концентрации Cd2"1" в среде 75
1.3. Влияние кадмия на биомассу N. muscorum 79
Глава 2. Роль внеклеточных полисахаридов N. muscorum в детоксикации ионов кадмия 80
2.1. Обнаружение ионов кадмия, связыванных полисахаридами, по окрашиванию дитизоном 80
2.2. Определение связывания ионов кадмия полисахаридами по спектрам поглощения и флуоресценции культуральной среды 82
2.3. Зависимость концентрации экзополисахаридов в среде от концентрации кадмия и длительности его воздействия на N. muscorum 83
2.4. Изменение состава экзополисахаридов после инкубирования N. muscorum с ионами кадмия 85
Глава 3. Воздействие Cd на пигментную систему N. muscorum 90
3.1. Образование кадмий-пигментных комплексов 90
3.2, Нарушения в пигмент-пигментном взаимодействии 96
Глава 4. Синтез CdS в водном растворе R-фикоэритрина *
4.1. Связывание Cd2+ R-фикоэритрином 108
4.2. Частицы CdS: размер, морфология, фазовое состояние 111
4.3. Зависимость размера частиц CdS от условий синтеза 115
4.4. Флуоресценция CdS, синтезированного на R- фикоэритрине... 119
4.5. Стабильность наночастиц CdS 125
4.6. Фотохимические свойства CdS 128
4.7. Структурная организация наночастиц CdS 133
Глава 5. Сопутствующие микроорганизмы JV. muscorum, штамм ВКМ-16 138
5.1. Описание сопутствующих микроорганизмов, выделенных из Ж muscorum 138
5.2. Образование H2S сопутствующими микроорганизмами 140
5.3. Влияние кадмия на рост сопутствующих микроорганизмов 141
5.4. Аккумуляция ионов кадмия сопутствующими микроорганизмами 143
5.5. Филогенетическое положение штамма 2В 144
5.6. Влияние кадмия на рост S. maltophilia 147
5.7. Связывание ионов кадмия продуктами метаболизма S. maltophilia 149
5.8. Детекция CdS в культуре S. maltophilia по спектрам поглощения 150
Заключение 153
Выводы 157
Литература 159
Приложение 189
- Механизмы защиты микроорганизмов от тяжелых металлов
- Адсорбция тяжёлых металлов на поверхности клеток
- Зависимость концентрации экзополисахаридов в среде от концентрации кадмия и длительности его воздействия на N. muscorum
- Описание сопутствующих микроорганизмов, выделенных из Ж muscorum
Введение к работе
В настоящее время особенно актуальна проблема загрязнения окружающей среды тяжёлыми металлами. Кадмий - один из наиболее токсичных тяжёлых металлов. Образуя прочные комплексы с аминокислотами и другими биомолекулами, содержащими тио- или ал килтио группировки (RS-), заменяя биометаллы в металлсодержащих ферментах, кадмий нарушает многие физиологические и метаболические процессы, как путем прямого ингибирования или активации, так и непрямым воздействием на регуляторные механизмы (Siedlecka, Krupa, 1999; Зеленин, 2000; Vymazal, 1987). Загрязнение окружающей среды тяжёлыми металлами привело к распространению устойчивых к металлам микроорганизмов. Во многих случаях устойчивость к тяжёлым металлам определяется плазмидами. Изучение конкретных видов, характеризующихся устойчивостью к высоким концентрациям Cd2+, представляется актуальным как в практическом, так и теоретическом аспектах. Практический интерес обусловлен использованием ряда микроорганизмов, включая цианобактерии, при разработке технологий осаждения и удаления тяжелых металлов из промышленных стоков биоаккумуляцией - более эффективным и дешевым способом удаления токсичных металлов из окружающей среды по сравнению с физико-химическими методами. Теоретический интерес обусловлен обнаружением способности у некоторых микроорганизмов, в том числе и N muscorum, к биосинтезу наночастиц CdS на поверхности или внутри клеток в процессе детоксикации ионов Cd2+. Детоксикация ионов кадмия через биосинтез CdS внутри клеток происходит в несколько этапов. Вначале происходит хелатирование и транспорт Cd глутатионом и родственными соединениями. На следующем этапе сульфид внедряется в комплексы кадмия с фитохелатинами. Именно на этом этапе формируются кластеры, а затем и кристаллиты CdS. Образование комплексов CdS-PC снижает токсичность кадмия. Механизм синтеза CdS у микроорганизмов и растений одинаковый (Pickering et al., 1999).
Способность микроорганизмов к детоксикации кадмия через образование кристаллов сульфида кадмия представляет особый интерес, так как они являются неорганическими полупроводниками и, обладая фотохимической активностью, способны фотосенсибилизировать биохимические окислительно-восстановительные реакции (Красновский и др., 1979; Никандров, 2000). Наночастицы неорганических полупроводников используются в качестве флуоресцентных меток в биологических системах (Chan, 2002; Larson, 2002). Взаимодействие металлсодержащих частиц с биополимерами - белками, полисахаридами клеток - играет роль в ферментативном катализе (Бучаченко, 2003).
В живых организмах синтезируются и другие полупроводники, например, оксид железа, магнентит, селенит. Частицы гидратированного оксида железа (гидроокись железа) образуются в результате окисления ионов двухвалентного железа внутри ферритина; процесс катализируется и регулируется металлотионеином. Кристаллы магнетита, обладающие магнитными свойствами образуются в магнитосомах магнитобактерий. Бактерия Stenotrophomonas maltophilia восстановливает селенат и селенит до селена (Dungan et al., 2003). Кристаллиты CdS образуются в слизистой оболочке фотосинтезирующей цианобактерии Nostoc muscorum (Бекасова и др., І999, 2000). Однако механизм синтеза (источник сульфида) оставался не выясненым.
Наночастицы наряду с нанотрубками и нанопроволоками представляют собой основные объекты высоких технологий, которые перспективны в создании новых материалов и миниатюризации многих элементов наноэлектроники, наномеханики, нанофизики, наноинформатики (Бучаченко, 2003; Помогайло и др., 2000). Для получения наночастиц CdS применяются также методы биосинтеза (Никандров, 2000). В настоящее время налажен промышленный способ получения наночастиц сульфида кадмия из дрожжей Shizosaccharomyces pombe. Наночастицы CdS, синтезированные дрожжами, применялись для создания элементов микроэлектроники, потому что они
обладают свойством идеального диода (Kowshik et ак, 2002). Вместе с тем на данном этапе существуют фундаментальные проблемы выяснения механизма биосинтеза полупроводников бактериями. Ведутся работы по поиску путей активации роста гетеротрофных микроорганизмов, способных к синтезу полупроводников, с перспективой технического использования (Никандров, 1994, 2000; Недолужко, 1998).
С целью получения наночастиц-полупроводников определенного размера и свойств широко развиваются методы их синтеза. Наночастицы CdS синтезированы, в различных средах, таких как полимеры, стекло, тонкие пленки, монослои, мицеллы, липосомы (Lingdong et al., 2000; Brucher et al., 1998; Wang et al., 1994; Vassiltsova, 1999). В ряде работ (Shelli et al, 2000; Green et al., 2003; Bae et al, 1998; Dameron et al, 1989; Dameron, Winge, 1990) для стабилизации наночастиц CdS в водных растворах использовались аминокислоты, пептиды и белки, обогащенные SH-группами. Из белков в качестве лигандов для стабилизации наноразмерных частиц CdS использовался бычий сывороточный альбумин (Nedoluzhko et al., 2000; Nayar et a!., 2001), ферритин (Wong et al., 1996), монослои каналообразующих белков (Wang, Uphaus, 1994; Cobbett, 2000). В качестве стабилизаторов наночастиц CdS применяются также ДНК (Shelli et al, 2000) и АТФ (Green et al., 2003). Вместе с тем проблема получения одноразмерных частиц с одинаковыми свойствами остаётся, поиск гомогенных матриц продолжается. Выяснение возможности стабилизации наночастиц сульфида кадмия фикобилиновыми пигментами представляет интерес как для выяснения механизмов биосинтеза наночастиц со свойствами неорганических полупроводников, так и в связи с актуальной проблемой их использования в качестве флуоресцентных меток в биологических системах.
Цель работы: изучить защитные механизмы цианобактерии Nostoc muscorum штамм ВКМ-16 от воздействия ионов кадмия.
Механизмы защиты микроорганизмов от тяжелых металлов
При помощи комплекса ФС I происходит восстановление НАДФ, необходимого для темновых биохимических реакций ассимиляции ССЬ Комплекс ФС I представляет собой тример с молекулярной массой более 1 млн Da, Каждый мономер в составе тримера содержит 12 белков, 96 молекул хлорофилла, 22 молекулы каротшюидов, 3[4Fe-4S] кластера, две молекулы филлохинона и 4 липида (Jordan et al., 2001). Структурная особенность комплекса ФС І в том, что апопротеин кор-антенны и белок, связывающий редокс кофакторы переноса электрона, тесно связаны. Молекулы хлорофилла, за исключением молекул в центре комплекса, расположены хаотически. Согласно данным рентгено-структурного анализа (Schubert et al., 1997) расстояние между хлорофиллами кор-антенны колеблется в пределах А (ближе к центру) до 16 А (на периферии комплекса). Энергия возбуждения передается через кор-антенну к центру комплекса, содержащему 6 молекул хлорофилла, локализованных симметрично относительно Сг оси симметрии, ориентированной в люминально стромальном направлении (перпендикулярно плоскости тилакоидной мембраны), В центре комплекса на люминальной стороне мембраны близко к Сг оси расположен реакционный центр, Р700 - специальная пара из двух молекул хлорофилла, еС1 и еС1 . Они образуют димер, первичный донор электрона. В непосредственном соседстве с Р700 расположены мономерные формы хлорофилла еС2 и еСЗ и их симметричные копии еС2 и еСЗ . Эти молекулы образуют две потенциальные ветви электронтранспортной цепи. Предполагается, что только одна ветвь участвует в переносе электрона. Роль другой — неизвестна. Расстояние между первичным донором и еС2 (еС2 ) и еСЗ(еСЗ ) около 12 и 20 А соответственно. Р700 удален от кор-антенны на 20 30 А, тогда как мономерные формы хлорофилла еС2 (еС2 ) и еСЗ(еСЗ г) расположены ближе к кор-антенне. Еще две молекулы хлорофилла (сС и сС) связывают хлорофиллы кор-антенны с еСЗ(еСЗ ). Эта структурная связь еСЗ молекулы с антенной предполагает, что мономерные формы хлорофилла еС2 и еСЗ могут участвовать в переносе энергии возбуждения от кор-антенны к первичному донору. Один из хлорофиллов (еСЗ или еСЗ ) может быть первичным акцептором электрона А0. В фотопереносе электрона в ФС I участвуют: первичный донор электрона (Р700), первичный акцептор Ао (мономерный хлорофилл), вторичный акцептор электрона (филлохинон Ai) и промежуточный акцептор электрона (4Fe-4S кластер).
Пигмент-пигментное взаимодействие приводит к образованию различных спектральных форм хлорофилла в кор-антенне с максимумами поглощения при 665-668, 672-676, 680-682, 683-686, 692, 695, 698-702, 708, 714-720 нм (положение некоторых максимумов смещается в указанных пределах в зависимости от вида цианобактерии) (Melkozernov, 2001). Полосы при 708 и 714-720 нм, возможно, относятся к двум димерам хлорофилла. Также как и Р700, они строго ориентированы вследствие консервативного взаимодействия с апопротеином. Самая длинноволновая форма хлорофилла в ФС 1 поглощает при 735 нм и флуоресценцирует при 760 нм. Эта форма возникает в результате взаимодействия молекул хлорофилла, локализованных на разных мономерных субъединицах тримера (Карапетян, 1998). Длинноволновые формы обуславливают устойчивость ФС I к фото деструкции.
Ионы кадмия наряду с другими тяжелыми металлами уменьшают фотостабильность хлорофилла (Neverov et al., 1997). Повреждающее действие Cd на ФС I проявляется в нарушении пигмент-пигментного взаимодействия, что влечет за собой обратный перенос энергии от хлорофилла ФС I к АФЦВ (Fork, Mohanty, 1986; Singh et a!., 1993). Причиной изменения взаимодействия пигментов могут быть изменения конформации белков вследствие образования Б-металл-Б мостиков при взаимодействии Cd2+ с SH-группами в клеточных мембранах (Rothstein, 1959).
Тумова и Софрова показали неодинаковое действие 0,1 и 1,0 мМ Cd на интактные клетки Synechococcus elongates и их фотосинтетический аппарат (Tumova, Sofrova, 2002). Они обнаружили стимулирующее действие 0,1 мМ Cd + на рост культуры и концентрацию хлорофилла и ингибирующее действие 1,0 мМ Cd на эти параметры. На интактных клетках и изолированных тилакоидных мембранах показано, что фотохимическая активность ФС I менее чувствительна к ионам Cd2+ по сравнению с активностью ФС II (Tumova, Sofrova, 2002). В модельных системах показано, что Cd может замещать Mg в молекуле хлорофилла. Исследование фотохимических свойств показало, что в отличие от хлорофилла: прямое взаимодействие с пластохиноном и убихиноном отсутствует и по сравнению с ХЛ скорость реакций, сенсибилизированных Cd-феофитином снижается. Замена Mg на Cd изменяет спсобность пигмента к комплексообразованию (Оловяшникова, 1979)
Электрон передается от ФС II к ФС I через пластохинон, комплекс цитохром b(f и растворимые переносчики электрона пластоцианин или цитохром Сб, которые локализованы на люминальной стороне мембраны, к ферредоксину на стромальной стороне. Далее электрон передается к ферредоксин-НАДФ+ оксидоредуктазе, которая восстанавливает НАДФ+ до НАДФН(рис.2).
При воздействии Cd2+ снижается уровень пластохинона и ферредоксина, уменьшается активность АТФазы и ферредоксин-НАДФ редуктазы (Siedlecka, Krupa, 1999; Van Duijvendik-Matteoli, 1975). Вместе с тем известны ответные «активационные механизмы» растений на Cd-стресс при низких концентрациях кадмия. В частности, низкие концентрации кадмия увеличивают эффективность процессов, ведущих к активации рибулезо-1,5-бисфосфат карбоксилазы/оксигеназы (Рубиско), что в свою очередь влияет на световую активацию фотосинтеза в течение первых двух часов освещения Phaseolus vulgaris. Активацию карбоновой ангидразы низкими концентрациями Cd подтверждает увеличение активности этого фермента при одновременном уменьшении его количества (Siedlecka et al., 1999; 1999). Поскольку известно, что ионы кадмия и железа — конкуренты за места связывания в клетках (Singh et а!., 1993), ионы Cd2+ могут замещать Fe2+ в цитохромах и ферредоксине и таким образом вызывать дисбаланс в электронтранспортной цепи (рис. 2).
Адсорбция тяжёлых металлов на поверхности клеток
Почти во всех изученных полисахаридах присутствуют сахарные кислоты, остатки различных кислот и спиртов, аминопроизводные сахаридов. Аминогруппа в полисахаридах часто встречается в виде N-ацетильных производных (в аминогруппе вместо одного атома водорода содержится ацетильный остаток СН3СО ) (Кузин, 1954; GJoaguen, 1995). Из уроновых кислот идентифицированы глюкуроновая и галактуроновая кислоты. Полисахариды большинства цианобактерий содержат две уроновые кислоты, что редко встречается в полимерах синтезированных другими бактериальными штаммами (Philippis, Vincenzini, 1998). Ранее полагали, что только эукариоты способны к синтезу полисахаридов, содержащих сульфатные группы. Позднее это мнение было опровергнуто данными о биосинтезе цианобактериальными культурами сульфатированных полисахаридов, (Philippis, Vincenzini, 1998). Содержание сульфата составляет от 14 до I % от сухой массы внеклеточных полисахаридов (Sado et al., 1995; Panaff et al., 1989). Добавление кадмия стимулирует восстановление сульфата до сульфида при участии аденозин 5-фосфосульфат сульфотрансферазы (Rauser, 1990). Кроме того кадмий стимулирует синтез экзополисахаридов и тиолов (Singh et al., 1999), а также гидроксилы (-ОН), фосфориль (-РО3Н2), амино (-NH2), карбоксиль (-СООН) (Rai et al., 1981).
Присутствие радикальных групп органического типа (ацетильные, пируватные, сукцинильные группы), так и неорганического (сульфатные или фосфатные группы), а также присутствие полипептидов и других компонентов определяют физико-химические свойства полисахаридов. Поскольку доминируют анионные группы, экзополисахариды заряжены отрицательно (Sutherland, 1994; Bellezza et al., 2003). Наличие в составе экзополисахаридов анионных групп определяет их способность связывать ионы металлов, как в искусственно созданных условиях, так и в естественных фитоценозах. Полисахариды, имеющие высокое содержание заряженных компонентов (уроновых кислот, сульфатных или фосфатных групп), обычно образуют устойчивые гели в присутствии металлических ионов и участвуют в удалении токсичных металлов в загрязнённых водоёмах. Металлсвязывающая способность полисахаридов зависит от их конформации, плотности заряда и его распределения на поверхности полисахарида (Gloaguen, 1996; Philippis et al., 2003). В связи с этим, полисахариды слизистой оболочки могут служить хелаторами железа и кальция. Полисахариды цианобактерий играют важную роль в связывании и иммобилизации токсичных ионов металлов (Bender, 1994). На слизистой оболочке. цианобактерий происходит трансформирование Cd2+ в менее токсичные частицы и кристаллиты CdS и Cd (Бекасова и др., 1999; 2000).
Способность цианобактерий к образованию слизистых чехлов благоприятствует обильному развитию в них бактерий. Из слизистых образований выделено огромное количество гетеротрофных микроорганизмов. Количественное многообразие и численность бактерий-спутников неодинакова у разных видов цианобактерий. В слизистой Nostoc sp. наиболее распространены Chromobacterium, Pseudomonas, Streptomyces (Андреюк и др., 1990; Заварзин, 2003). Спутники цианобактерий, завися от них трофически, и обладая отличным от доминанта набором ферментов, расширяют их возможности контакта со средой, уменьшают парциальное давление кислорода, удаляют продукты аутоингибирования, что приводит к симбиотическому взаимоотношению цианобактерий с другими микроорганизмами (Панкратова, 2000; Заварзин, 2003).
Сочетание микроорганизмов с коллоидными металлами приводит к бактериальному концентрированию металлов, которому предшествует их адсорбция на поверхности клетки с последующей ассимиляцией и осаждением металл-бактериальной массы. В основе всех этих явлений лежат те же коллоидно-химические взаимодействия, что и в синтетических полимерах.
Белки и полисахариды, разделяя наноразмерные частицы друг с другом и с внешней средой, выполняют функции стабилизирующего агента.
Взаимодействие ионов металлов и наноразмерных частиц с биологическими макромолекулами и клетками играет роль в ферментативном анализе и в геобиотехнологии (Войткевич, 1988). Практический интерес представляют природные и созданные методами генной инженерии микроорганизмы, жизнедеятельность которых протекает в экстремальных условиях (высокие температуры, давления, значении рН и солёности, высокое содержание металлов) (Глазовская, Добровольская, 1984). Кроме бактерий связывание металлов осуществляют дрожжи, грибы, и другие организмы, что увеличивает возможности биохимической трансформации и переноса металлов в природных условиях.
При бактериальном концентрировании металлов на поверхности клеток происходит укрупнение частиц золя. Как и в системах на основе синтетических полимеров, наиболее устойчивый золь размером — 10 нм. При этом важнейшей особенностью коллоидно-бактериального взаимодействия является многообразие сил и механизмов — электростатических, молекулярных и химических. Бактерия Bacillus subtilis способна к притяжению коллоидных частиц к своей поверхности, их прикреплению и образованию агрегатов (Овчаренко и др., 1985). Преимущественная адгезия частиц ассоциатами бактериальных клеток наблюдается в местах их соприкосновения, отдельные клетки покрываются слоем металла.
Наиболее вероятно, что электростатическое и хемосорбционное прикрепление коллоидных частиц металлов и их соединений к поверхности клетки обусловлено в основном продуктами её метаболизма, в составе которых имеются функциональные группы: -S-, -СОО-, -РО(ОН)0-, -NH3+ (Маслюков и др., 1992). В работе (Ульберг и др., 1998) установлен факт химического связывания металла с образованием связей Me—N, Ме-С, Ме-О, Me-S.
Результаты Карамушка (Карамушка и др., 1998) подтверждают специфические различия для живых и мертвых клеток в величинах биосорбции металлов, седиментационной устойчивости и эффективности гетерокоагуляции с наноразмерными частицами, в порогах электролитической коагуляции. Получены доказательства связывания металла поверхностью клеток за счет белковых, углеводных или гликопротеиновых структур.
На доверхности бактерий может существовать несколько независимых мест связывания частиц металла (Me)
Me + L «- MeL, где L - участок связывания на поверхости бактерии, MeL - комплекс «бактерия - частица золя». Общее число мест связывания (п), количество связанных частиц металла (v), а также константы ассоциации К— [MeL]/([Me][L]) могут быть вычислены по уравнению Скэтчарда (Эдсол, Гатфренд, 1986).
Изучение связывания ионов металлов зеленой водорослью Selenastrum capriconutum с использованием ЯМР и флуоресцентной микроскопии показало, что в связывании кадмия клеточными стенками участвуют главным образом -СООН группы, тогда как -ОН группы ответственны за связывание кадмия экзометаболитами (Grassi et al., 1999).
Зависимость концентрации экзополисахаридов в среде от концентрации кадмия и длительности его воздействия на N. muscorum
Концентрацию хлорофилла определяли спектре- фото метрически в 80 %-ном ацетоне, используя коэффициент поглощения є=82,04 г 1 см"1 (Wintermans, 1965), по формуле C=D/ е-1, где С - концентрация пигмента, D -поглощение в максимуме, є - удельный коэффициент экстинкции, 1 — толщина слоя.
При определении ионов кадмия по окрашиванию использовали гистохимическую реакцию с дитизоном (Серёгин, Иванов, 1997). Дифенилтиокарбазон или дитизон обладает высокой чувствительностью к кадмию и свинцу. Представляет собой черно-фиолетовые кристаллы, которые в большей или меньшей степени растворяются во многих оранических растворителях и образует в присутствии исследуемых металлов нерастворимые соли — дитизонаты. В аналитической химии рекомендуется дитизон растворять в четыреххлористом углероде или хлороформе (Щербов, Матвеец, 1973), но это вызывает сжатие клеток. Было выявлено, что наиболее подходящим в этом случае растворителем является смесь ацетона с дистиллированной водой (3:1). Окрашивание заметно при концентрации соли металла 10"5 М (Серёгин, Иванов, Ї997).
Для приготовления раствора красителя 2 мг дитизона растворяли в 4 мл ацетона, добавляли 1.3 мл дистиллированной воды и 1 каплю ледяной уксусной кислоты, так как в слабокислой среде реакция более специфична. Далее краситель фильтровали через бумажный фильтр. Краситель темно-синего цвета. Реагент готовили непосредственно перед экспериментом, так как он не подлежит хранению.
Поскольку с дитизоном могут реагировать и некоторые другие катионы, были проведены контрольные реакции с средой КМ, исходной культурой TV. muscorum и раствором экзополисахаридов. Микроскопирование показало отсутствие какого-либо окрашивания и были видны лишь черно-фиолетовые кристаллы дитизона.
Связывание Cd2+ слизистой оболочкой клеток или экзополисахаридами в культуральной среде определяли следующим образом.
Суспензию клеток или раствор экзополисахаридов объемом 1 мл с внесённым предварительно Сс1(ЫОз)г отмывали от свободных ионов кадмия центрифугированием при 4000 об/мин в течение 10 минут с 5 мл раствора ацетона и дистиллированной воды (3:1). После центрифугирования надосадочную жидкость сливали, осадок суспендировали в водном ацетоне и снова центрифугировали. Осадок отмывали таким способом трижды. Места связывания ионов кадмия обнаруживались после добавления раствора дитизона, который образует с кадмием жёлто-оранжевую соль. Окрашивание проводили двумя способами. Первый - на предметном стекле для микроскопирования: каплю суспензии, отмытой от свободного кадмия, наносили на стекло, туда же вносили каплю красителя, перемешивали кончиком пипетки и накрывали покровным стеклом. При втором -смешивали одинаковые объёмы суспензии и красителя в пробирке и из полученной смеси готовили препарат для микроскопирования. Приготовленные таким образом препараты просматривали под световым микроскопом.
При окрашивании микроорганизмов после роста на агаризованной среде на стекдо для микроскопирования наносили каплю стерильной дистилированной воды (0.02 мл). Потом микробиологической петлёй делали соскоб с поверхности чашки и клетки растворяли в капле воды. Затем в эту суспензию вносили 0.01 - 0.015 мл красителя. Готовую суспензию перемешивали и накрывали покровным стеклом.
Равновесную концентрацию Cd определяли в присутствии 0,1 М NaNC 3 при помощи рН/мВ-метра ("Эксперт-001", Россия), в котором измерительным электродом был Cd2+ -селективный электрод "Эком-Cd" (Приложение, рис. 3). Крутизна электродной функции 26,5 мВ при 20 С; диапазон линейности 0,1 мкМ - 10 мМ при рН 6,0. Чтобы исключить возможность сорбции белка фикоэритрина на поверхности электрода, образцы отделяли от электрода диализным мешком с дистиллированной водой, перемешиваемой магнитной мешалкой.
Измерение концентрации ионов кадмия в супернатанте S. maltophilia определяли на эмиссионном спектрофотометре с индуктивно-связанной плазмой "IRIS Advantage" фирмы "Thermo Jarrel Ash" (CIIIA). Длина волны измерения 228,802 нм. Скорость подачи раствора 1,85 мл/мин. Мощность плазмы 1150 Вт.
Для приготовления градуировочного раствора в качестве исходного использовали стандартный образец водного раствора ионов кадмия. Измерения проводили трижды.
Культуры клеток выращивали в пробирках в 10 мл среды. После этого клетоки осаждали на центрифуге (MPW-340, Польша) при 5000 об/мин. в течение 15 мин. Супернатант сливали в отдельную пробирку и держали в холодильнике до определения ионов кадмия. Контрольные растворы среды с кадмием тоже центрифугировали при 5000 об/мин для осаждения кадмия связанного компонентами среды.
Описание сопутствующих микроорганизмов, выделенных из Ж muscorum
С целью выяснения возможной роли бактерий-спутников в образовании кристаллитов сульфида кадмия культурой цианобактерии эти микроорганизмы были выделены из N. muscorum. В ходе исследования было выделено 29 штаммов. Можно предположить, что выделенные нами штаммы в основном относятся к роду Pseudomonas, преобладающие в слизи цианобактерии.
Наибольший интерес для данной работы представляли микроорганизмы, выделенные из культуры N. muscorum после первого этапа очистки (т.е. облигатные спутники). Из культуры N. muscorum, инкубированной в течение 2-х месяцев при комнатной температуре с 10 Ми 10 4 М Cd(N03)2, были выделены гетеротрофные микроорганизмы, которые обладали определенной устойчивостью к токсическому действию кадмия. При посеве материала из колбы с культурой цианобактерии после двухмесячной инкубации с 10"2 М Cd(NC 3)2 на чашки Петри роста колоний не было.
В 1-й чашке с посевом после инкубирования цианобактерии с 10"3 М Сс1( Юз)2 был сплошной, бесцветный, гладкий, блестящий, опалесцирующий синим газон, а во втором разведении — отдельные округлые, гладкие, выпуклые, блестящие, опалесцирующие колонии трех видов: 1) точечные, бесцветные; 2) точечные, молочные; 3) I мм, светло-бежевые. После инкубации с кадмием в концентрации 10 4 М на первой чашке Петри также был отмечен сплошной газон: светло-бежевый, блестящий, гладкий, выпуклый, опалесцирующий. В то время, как на второй чашке (второе разведение) были отдельные колонии округлые, гладкие, выпуклые следующих трех типов: 1) 1 мм, блестящие, белые; 2) точечные, блестящие, светло-бежевые; 3) 1-2 мм, блестящие, светло-бежевые, с плоским и волнистым краем.
Посев материала из исходной культуры N. muscorum и культуры после первого этапа очистки показал, что в первом случае сплошной преимущественно опалесцирующий рост был в обоих разведениях, причем наряду с обычными белыми, бежевыми и бесцветными были колонии с желтой и оранжевой пигментацией, а также колонии с различным профилем и краем. Во втором разведении на чашке Петри были отдельные колонии, в основном двух видов, как описано выше для культуры, инкубированной с 10-3MCd(NO3)2.
Микроскопирование выделенных штаммов гетеротрофных бактерий, подтверждает вышеизложенные данные. Так, для выделенных из исходной культуры микроорганизмов набор морфотипов весьма разнообразен: разной длины палочки (подвижные и неподвижные), образующие короткие цепочки, прикрепленные одним концом и вращающиеся, кокки разных размеров. Для штаммов, выделенных из предварительно очищенной культуры, все это многообразие сводилось к основным трем типам: короткие подвижные палочки (длина 1-2 мкм), длинные подвижные палочки (длина более 2 мкм) и мелкие кокки.
В задачи данной работы не входили количественный учет сопутствующих микроорганизмов, а также их детальное описание и определение. Поэтому мы ограничились этими ориентировочными данными. В ходе дальнейшей работы были отобраны чистые 14 штаммов гетеротрофных бактерий и исследована их способность к образованию H2S на жидкой среде КМсп с добавлением по 0.005% цистина и цистеина. 8 штаммов выделяли H2S с разной интенсивностью. Для дальнейшей работы отобраны штаммы 1А и 2А, выделенные из исходной культуры iV. muscorum, и штаммы 1В и 2В, выделенные из культуры цианобактерии, инкубированной с 10" М Cd(N03)2 в течение двух месяцев, которые показали наиболее интенсивное выделение H2S и хороший рост.
У 1А и 2А штаммов колонии оранжевые, круглые, выпуклые, блестящие, гладкие, диаметр 3 мм; у 1В и 2В штаммов колонии бесцветные, с синей опалесценцией, круглые, выпуклые, блестящие, гладкие, точечные, диаметр менее 1 мм. Таким образом, колонии имели одинаковый морфотип. Окрашивание по Граму и тест-метод с 3% КОН показали, что бактерии являются короткими грам-отрицательными палочками.
Интенсивность выделения H2S суточными культурами исследовали на среде КМ (40 мг/л К2НР04 и 0.1 г/л Na2EDTA), к которой было добавлено: 1) - по 0.2 г/л глюкозы и пептона, 0.01 г/л дрожжевого экстракта и по 0.01% цистина и цистеина; 2) - по 0.01% цистина и цистеина; 3) - по 0.4 г/л глюкозы и пептона, 0.01 г/л дрожжевого экстракта; 4) - по 0.4 г/л глюкозы и пептона. Уже на первые сутки после начала инкубации на всех средах, засеянных 2В штаммом, было отмечено выделение H2S. На вторые сутки отмечена реакция выделения H2S всеми штаммами, но 1А культура выделяла H2S только на одной среде - модификации 2. Для 1В, 2В, и 2А культур наиболее благоприятными для выделения газа были 1 и 2 варианты среды, а наиболее интенсивный рост наблюдался на среде в модификациях 3 и 4, в которых содержание глюкозы и пептона превышало таковое в первых двух в два раза. При выращивании бактерий на среде КМсп, содержащей по 0.0025% аминокислот, наиболее интенсивно выделял H2S 2В штамм, а у 1А образование сероводорода не наблюдалось. Следует отметить, что интенсивное выделение H2S начиналось до периода наращивания биомассы. При выращивании бактерий на Kligler агаре при хорошем росте у всех штаммов образование сульфида было отмечено только у 2В культуры (рис. 58).
