Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Литературный обзор 13
1.1. Общая характеристика соединений фенольной и полифенольной природы 13
1.1.1. Понятие «антиоксидант», принципы действия 13
1.1.2. Соотношение химическая структура - антиоксидантная активность (АА) соединений фенольной и полифенольной природы 18
1.2. Определение соединений фенольной и полифенольной природы методом ВЭЖХ 22
1.2.1.Неподвижные фазы для разделения соединений фенольной и полифенольной природы 23
1.2.2.Подвижные фазы для разделения соединений фенольной и полифенольной природы 27
1.3. Способы детектирования соединений фенольной и полифенольной природы 30
1.4. Идентификация фенольных соединений с использованием индексов удерживания в высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) 34
1.5. Определение соединений фенольной и полифенольной природы в различных объектах 41
1.5.1. Подготовка пробы к анализу 42
1.5.2. Примеры определения соединений фенольной и полифенольной природы в различных объектах 43
Экспериментальная часть 46
Глава 2. Исходные вещества, приборы, методики экспериментов 46
2.1. Растворы, реагенты, объекты исследования 46
2.2. Приборы и хроматографические системы 48
2.3. Методики экспериментов 50
Глава 3. Выбор оптимальных условий хроматографического разделения, детектирования и идентификации и создание базы данных ряда соединений фенольной и полифенольной природы 52
3.1. Выбор условий хроматографического разделения и детектирования 52
3.2. Расчет хроматографических индексов удерживания (ИУ) 59
3.3. Создание базы данных ряда соединений фенольной и полифенольной природы 63
Глава 4. Исследование методом ВЭЖХ фенольного и полифенольного состава экстрактов хмеля 70
Глава 5. Хроматографическое исследование продуктов окисления физиологически активного соединения фенольной природы — 5 -метилрезорцина 84
Выводы 100
Литература 102
Приложения 118
- Соотношение химическая структура - антиоксидантная активность (АА) соединений фенольной и полифенольной природы
- Идентификация фенольных соединений с использованием индексов удерживания в высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)
- Примеры определения соединений фенольной и полифенольной природы в различных объектах
- Расчет хроматографических индексов удерживания (ИУ)
Введение к работе
Актуальность темы. За последние годы во всем мире резко возросло количество публикаций, посвященных исследованию природных и синтезированных антиоксидантов методом ВЭЖХ. В частности, внимание ученых привлечено к изучению антиоксидантной активности соединений фенольной и полифенольной природы. Ухудшение экологической обстановки и увеличение числа стрессовых ситуаций в современном мире приводят к дисбалансу и снижению защитных сил организма человека. Это, в свою очередь, повышает риск сердечно-сосудистых заболеваний, провоцирует развитие различных воспалительных процессов, атеросклероза и других патологических состояний. Поэтому важной научной и практической задачей для сохранения здоровья человека является изучение активных форм и механизмов действия in vitro и in vivo природных и синтезированных антиоксидантов.
Фенольные и полифенольные соединения обладают широким спектром биологической активности: антиоксидантной, антирадикальной, противовирусной, противовоспалительной, антибактерицидной, антиканцерогенной, капилляроукрепляющей, гепапротекторной и др. Это обуславливает их применение в медицине, фармакологии, биохимии, пищевой промышленности. Несмотря на широкое использование полифенольных соединений в качестве антиоксидантов, все еще остаются не до конца выясненными их активные формы и механизмы действия in vitro и in vivo, что связано со сложностью их определения. Затруднение, возникающее при хроматографическом анализе этих соединений, вызвано недостатком необходимых стандартов для их идентификации вследствие существования большого количества природных производных этих соединений и многообразия их окисленных форм. Поэтому при анализе природных объектов, содержащих полифенольные соединения, актуальной проблемой является разработка способов идентификации этих соединений.
В хроматографии идентификацию компонентов в сложных объектах обычно проводят сравнением времен удерживания и спектральных характеристик исследуемых компонентов с соответствующими хроматографическими параметрами стандартов. Известно, что, как и в газовой хроматографии, в высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) при изократическом режиме элюирования возможно идентифицировать соединения путем сравнения их индексов удерживания (ИУ) относительно шкалы индексов удерживания соединений - гомологов, выбранных в качестве стандартов. Однако поскольку экстракты природных объектов в основном содержат соединения в широком диапазоне полярностей, то для их успешного хроматографического разделения используют градиентный режим элюирования. Известно, что одним из наиболее эффективных для идентификации соединений хроматографических методов является ГХ - МС. Однако этот метод не может быть использован для исследования смесей фенольных и полифенольных соединений из-за лабильности этих соединений.
Актуальным является увеличение достоверности идентификации полифенольных соединений в сложных смесях при анализе их в градиентном режиме обращенно-фазового варианта метода ВЭЖХ (ОФ-ВЭЖХ) путем сравнения их спектральных данных и индексов удерживания с соответствующими хроматографическими характеристиками стандартов. Решение этой задачи возможно при условии осуществления расчетов ИУ в градиентном режиме, выборе оптимальных условий хроматографического анализа и составления в оптимальных условиях базы данных ряда фенольных и полифенольных соединений для дальнейшего ее использования при идентификации соединений в природных объектах.
Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы являлась разработка метода исследования фенольных и полифенольных соединений и способа их идентификации, включая индексы удерживания и спектральные характеристики, при определении в сложных смесях в градиентном режиме ОФ-ВЭЖХ.
Для достижения намеченной цели необходимо было решить следующие задачи: выбрать оптимальные условия разделения и детектирования фенольных и полифенольных соединений в сложных смесях; выбрать ряд соединений-гомологов, пригодных в качестве стандартной шкалы индексов удерживания (ИУ) в жидкостной хроматографии, и исследовать возможность применения данной шкалы соединений и разработанного соответствующего программного обеспечения для расчета ИУ фенольных соединений, исследуемых в градиентном режиме элюирования методом ОФ -ВЭЖХ; в подобранных оптимальных условиях разделения и детектирования получить хроматографические характеристики ряда фенольных и полифенольных соединений и создать соответствующую базу данных этих соединений; - с использованием полученной базы данных анализировать сложные смеси полифенольных соединений, включая экстракты различных сортов хмеля и продукты окисления физиологически активного соединения фенольной природы - 5-метилрезорцина.
Научная новизна: выбраны оптимальные условия хроматографического разделения и детектирования сложных смесей, содержащих полифенольные соединения широкого диапазона полярностей; исследована возможность использования алкиларилкетонов в качестве соединений-гомологов для стандартной шкалы индексов удерживания и применения разработанного программного обеспечения для расчета ИУ соединений, исследуемых в градиентном режиме анализа методом ОФ - ВЭЖХ; измерены хроматографические параметры 42 фенольных и полифенольных соединений и на их основе составлена база данных, включающая структурные формулы, времена, индексы удерживания и спектральные характеристики соответствующих соединений; предложен способ идентификации сложных смесей соединений фенольной и полифенольной природы с использованием их индексов удерживания и спектральных характеристик; исследованы экстракты различных сортов хмеля; показано, что наибольшее число фенольных соединений и максимальную устойчивость при хранении имеет экстракт, полученный из прессованных шишек; проведено хроматографическое исследование продуктов смоделированной реакции радиационного окисления физиологически активного соединения - 5-метилрезорцина; - установлено, что в водных растворах алкилрезорцинов действием ионизирующего излучения инициируются сложные окислительно-восстановительные процессы, продолжающиеся в пострадиационный период и приводящие к образованию разнообразного набора конечных продуктов как в результате деструкции, так и агрегации промежуточных продуктов окисления.
Практическая значимость: - предложен метод определения качественного состава сложных смесей, содержащих соединения фенольной и полифенольной природы, основанный на использовании их индексов, времен удерживания и спектральных характеристик; - создана база данных, включающая хроматографические и спектральные характеристики 42 фенольных и полифенольных соединений; - проведен хроматографический анализ экстрактов хмеля широко используемых в настоящее время в российском производстве пива сортов: немецкий Spalter Select, польский Lublin и чувашские Подвязный и Ранний. Показано, что чувашский сорт Ранний по своему полифенольному составу практически не уступает считающемуся одному из лучших в мире немецкому сорту хмеля Spalter Select. Исследовано влияние первичной обработки шишек хмеля на полифенольный состав экстрактов и их устойчивость при хранении. Показано, что наибольшее число фенольных соединений и максимальную устойчивость при хранении имеет экстракт, полученный из прессованных и подвергнутых серной обработке шишек. Полученные данные могут быть использованы в дальнейшем в технологии промышленного производства; установлено образование физиологически активных полифенольных продуктов окисления в водном растворе 5-метилрезорцина.
На защиту выносятся следующие положения: - выбор оптимальных условий разделения и детектирования и создание базы данных, включающей хроматографические характеристики 42 соединений фенольной и полифенольной природы; - использование алкиларилкетонов в качестве стандартной шкалы гомологов для расчета индексов удерживания фенольных соединений, исследуемых в градиентном режиме анализа методом ОФ - ВЭЖХ; - способ идентификации сложных смесей фенольных и полифенольных соединений с использованием их индексов удерживания и спектральных характеристик; - изучение методом ОФ - ВЭЖХ экстрактов различных сортов хмеля и продуктов окисления физиологически активного соединения - 5-метилрезорцина.
Апробация работы и публикации. Основные результаты диссертации изложены в 17 публикациях и доложены на научно-технической конференции «Молодые ученые - пищевым и перерабатывающим отраслям АПК (технологические аспекты производства)» (Москва, 13 - 14 декабря 2000 г.); на VI, VII конференциях молодых ученых «Некоторые проблемы физической химии» (Москва, 18-20 февраля 2001 - 2002 гг.); на международной конференции молодых ученых «От фундаментальной науки - к новым технологиям» (Москва - Тверь, 25 - 28 сентября 2001 г.); на VIII Всероссийском симпозиуме по молекулярной жидкостной хроматографии и капиллярному электрофорезу (Москва, 15 - 19 октября 2001 г.); на I Всероссийской конференции «Прикладные аспекты химии высоких энергий» (Москва, 30 октября - 2 ноября 2001 г.); на Всероссийском симпозиуме «Современные проблемы хроматографии» (Москва, 18-22 марта 2002 г.); на 3rd Intern. Conference on Protein Stabilization «Biocatalyst stability - different levels of observation» (Тулуза, Франция, 21-24 апреля 2002 г.); на 7th Intern. Symposium «Metal ions in Biology and Medicine» (Санкт-Петербург, 5 -9 мая 2002 г.); на "100 years of chromatography" 3rd Intern. Symposium on Separations in BioSciencies SBS 2003 (Москва, 13-18 мая 2003 г.), на XVII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии «Достижения и перспективы химической науки» (Казань, 21 - 26 сентября 2003 г.), на Всероссийской научно-технической конференции - выставке «Высокоэффективные пищевые технологии и технические средства для их реализации» (Москва, 21-22 октября 2003 г.)-
Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях:
Кочетова М.В., Ревина А.А., Ларионов О.Г. Относительные индексы удерживания в ВЭЖХ некоторых полифенольных веществ. // Сорбционные и хроматографические процессы. 2003. T.3.N.1.C.12-18.
Горячева Н.Г., Кочетова М.В., Шаненко Е.Ф., Ревина А.А., Ларионов О.Г. Исследование фенольных соединений экстракта хмеля с помощью спектрофотометрического метода и ВЭЖХ. // Пиво и жизнь. 2003. Т.37. N.2. С.27-34.
Ревина А.А., Ларионов О.Г., Кочетова М.В., Луцик Т.К., Эль-Регистан Г.И. Спектрофотометрическое и хроматографическое исследование продуктов радиолиза аэрированных водных растворов алкилрезорцинов. // Известия РАН, сер. Химическая. 2003. в печати (ноябрьский номер).
Полунин К.Е., Кочетова М.В., Ларин А.В., Полунина И.А. Удерживание /яранс-резвератрола в прямофазной хроматографии в зависимости от содержания полярных растворителей. // Сорбционные и хроматографические процессы. 2002 Т.2 N.4 С.406-410.
5. Горячева Н.Г., Ревина А.А., Шаненко Е.Ф., Кочетова М.В., Ларионов О.Г. Идентификация и изучение свойств флавонол- гликозидов, выделенных из хмеля «Magnum», «Подвязный». //
Тезисы научно-технической конференции «Молодые ученые -пищевым и перерабатывающим отраслям АПК (технологические аспекты производства)». Москва. 13 - 14 декабря 2000. С.69-71.
Кочетова М.В. Хроматографическое и спектроскопическое исследование флавоноидов хмеля. // Сборник статей «Некоторые проблемы физической химии». / Под ред. Чалых А.Е. М.: ИФХ РАН. 2001. С.40-44.
Кочетова М.В., Ларионов О.Г. Исследование природы и антиоксидантной активности флавоноидов хмеля. // Тезисы Международной конференции молодых ученых «От фундаментальной науки - к новым технологиям». Москва - Тверь. 25 - 28 сентября 2001. С.55.
Кочетова М.В., Ларионов О.Г., Горячева Н.Г., Ревина А.А. Исследование природы и антиоксидантной активности флавоноидов хмеля. // Тезисы VIII Всероссийского симпозиума по молекулярной жидкостной хроматографии и капиллярному электрофорезу. Москва. 15-19 октября 2001. С.48.
Кочетова М.В., Ларионов О.Г., Ревина А.А., Луцик Т.К. Хроматографический анализ продуктов радиолиза алкилоксибензолов. // Тезисы I Всероссийской конференции «Прикладные аспекты химии высоких энергий». Москва. 30 октября - 2 ноября 2001. С.28-29.
10. Кочетова М.В., Ревина А.А., Ларионов О.Г. Использование относительных индексов удерживания в ВЭЖХ для идентификации веществ в многокомпонентных природных системах. // Тезисы Всероссийского симпозиума «Современные проблемы хроматографии». Москва. 18-22 марта 2002. С.131.
П. Кочетова М.В., Полунин К.Е., Татаурова О.Г., Ларин А.В. Удерживание транс-резвератрола в прямофазной хроматографии в зависимости от содержания полярных растворителей. // Тезисы Всероссийского симпозиума «Современные проблемы хроматографии». Москва. 18-22 марта 2002. С. 103. Revina А.А., Kochetova M.V., Larionov O.G., Lutsik Т.К., Karpekina T.A., Mulyukin A.L., Boudrant J., El-Registan G.I. Study of alkylhydroxybenzene oxidation products. II Abstr. 3rd Intern. Conference on Protein Stabilization «Biocatalyst stability - different levels of observation». Тулуза. Франция. 21-24 апреля 2002. P.39. Revina A.A., Stepanenko I. Yu., Kochetova M.V., Larionov O.G., Lutsik Т.К., Karpekina T.A., Boudrant J., El-Registan G.L Radioprotection of trypsin by alkylhydroxybenzenes. II Abstr. 3rd Intern. Conference on Protein Stabilization «Biocatalyst stability -different levels of observation». Тулуза. Франция. 21-24 апреля 2002. P.68. Kochetova M.V., Revina A.A., Tataurova O.G., Lutsik Т.К., Haylova E.B., Larionov O.G. Interaction of metal ions and nanoparticles of silver with different biological active flavonoids. II Metal ions in Biology and Medicine. / Ed. by Khassanova L., Collery P., Maymard I., Khassanova Z., Etienne J.-C. Avril 2002. V.7. P.82. Revina A.A., Kochetova M.V., Larionov O.G., Tataurova O.G. The radiation-chemical contribution to the study of oxidation of natural biological active substances by HPLC. II Abstr. "100 years of chromatography" 3rd Intern. Symposium on Separations in BioSciencies - SBS 2003. Москва. 13 - 18 мая 2003. P.97.
Ревина A.A., Ларионов О.Г., Кочетова М.В., Зимина Г.М., Эль-Регистан Г.И. Ралиационно - инициированное окисление дигидрокситолуола в водных растворах. // Тезисы XVII Менделеевского съезда по общей и прикладной химии «Достижения и перспективы химической науки». Казань. 21-26 сентября 2003. С.207. 17. Горячева Н.Г., Шаненко Е.Ф., Ревина А.А., Кочетова М.В., Ларионов О.Г. Влияние активной кислотности экстрагента на состав хмелевых экстрактов. // Сб. науч. тр. Всероссийской научно-технической конференции-выставки «Высокоэффективные пищевые технологии и технические средства для их реализации». М.: МГУПП. 21 - 22 октября 2003. С. 110-114.
Соотношение химическая структура - антиоксидантная активность (АА) соединений фенольной и полифенольной природы
В настоящее время соотношения между АА и химической структурой полифенольных соединений еще не до конца выяснены. Однако на данный момент уже определено [12], что значение величины АА полифенолов возрастает: а) при наличии 2, 3 - двойной связи в ароматическом С-кольце поскольку, видимо, в этом случае возможна делокализация электронов между А - и В - кольцами (см. табл. 1, катехины) и, следовательно, стабилизация образующегося арилоксильного радикала; б) при наличии в орто - или пара - положениях ОН - групп, связанных с В - бензольным кольцом - поскольку, это также, видимо, способствует стабилизации образующегося радикала; в) в случае присутствия полифенольных соединений в форме агликонов - так как наличие сахарных остатков в гликозидах существенно снижает значение величины АА последних. В работе [13] при оценке ингибирующего влияния полифенолов на рост голубо-зеленых водорослей показано, что самым сильным эффектом обладала кофейная кислота, имеющая две ОН - группы в орто-положении. Также отмечено, что только аутоокисляющиеся полифенолы проявляют значительные ингибирующие эффекты по отношению к росту водорослей. Это вызвало предположение [13], что ингибирование происходит за счет образования полифенольных аутоокисляемых продуктов, таких, как свободные радикалы. Показано [14], что наличие 3 , 4 - дигидрокси-групп в В - кольце (см. табл. 1, катехины) существенно влияет на АА флавоноидов, способствуя образованию их хелатных комплексов с ионами металлов. В работе [15] было продемонстрировано, что антоцианы являются эффективными агентами против цитотоксичности и липидного пероксидного окисления, благодаря способности поглощать свободные радикалы и хелатировать ионы металлов. Однако антоцианы не защищают ДНК против образования окисленных оснований. Показано, что наличие сахарного остатка у производных антоцианов - антоцианидинов - значительно снижает защитные свойства последних. Известно [1, 5 - 12], что благодаря регулярному употреблению в пищу продуктов, богатых содержанием полифенольных соединений, -овощей, фруктов, красного вина, шоколада и др. - наблюдается значительное снижение риска сердечно-сосудистых заболеваний. Одним из интересных полифенольных антиоксидантов, которому в последние годы посвящено много исследований, является входящий в состав красного вина 3, 4 , 5 - тригидроксистильбен {транс-резвератрол). Обнаружено [16], что тиранс-резвератрол защищает липиды мембран от перекисного окисления, при этом он менее эффективно, чем флавоноиды, поглощает свободные радикалы, но является самым сильным хелатирующим агентом по отношению к ионам меди - катализаторам свободно - радикальных процессов. Таким образом, wpawc-резвератрол может способствовать усилению защитных свойств флавоноидов, содержащихся в красном вине, благодаря уменьшению расходования последних на хелатирование ионов меди. Также отмечено [17, 18], что в отличие от других полифенольных антиоксидантов транорезвератрол не хелатирует ионы железа. Это интересное его свойство может быть использовано при дальнейших изучениях процессов его абсорбции и метаболизма in vitro и in vivo. Известно [19], что иногда из-за недостаточных имеющихся сведений об абсорбции и фармакокинетики антиоксидантов возникают расхождения при определении их концентраций и биологического воздействия in vitro и in vivo. Предложено [20] при оценке действия антиоксидантов in vivo учитывать следующие моменты: 1. Какую биомолекулу предполагаемый антиоксидант защищает? Достаточно антиоксидант реакционноспособен для его действия in vivo? 2. Как он действует при защите субстрата от окисления -путем поглощения активных форм кислорода (АФК), предотвращения их образования или устраняя повреждения? 3. Если антиоксидант действует путем поглощения АФК, то возможно, что образовавшиеся радикалы в свою очередь сами будут инициировать реакции окисления? 4. Может антиоксидант инициировать реакции окисления в других биологических системах? Ранее считалось [21], что гликозиды полифенолов остаются в организме в неактивных формах до тех пор, пока не достигнут клеток печени, где под действием ферментов они подвергаются процессам дегликолиза и превращаются в активные производные, участвующие в дальнейших процессах метаболизма. Однако недавно [22] было показано, что первичным центром абсорбции многих гликозидов флавоноидов является тонкий кишечник, а неабсорбирующиеся здесь и оставшиеся в неактивных формах гликозиды флавоноидов направляются далее к клеткам печени. Это открытие является важным для дальнейших фармакокинетических исследований биодоступности полифенольных соединений, содержащихся в различных пищевых продуктах и в лекарственных препаратах.
Поскольку радикалы полифенольных соединений имеют более низкие значения потенциалов восстановления, чем алкилпероксидные и супероксидные радикалы, следовательно, полифенольные соединения способны поглощать свободные радикалы [12]. Однако арилоксильный радикал полифенольных соединений не всегда является устойчивым, и это может приводить к наблюдающимся иногда прооксидантным эффектам. Было предположено [12], что на значение потенциала восстановления оказывают влияние две особенности структурного строения полифенолов: катехольная группа В - кольца и 2,3 - двойная связь С - кольца (см. табл. 1, катехины). Таким образом, вещества, имеющие эти структурные особенности, обладают более высокими значениями потенциала восстановления, чем аскорбат, и способны окислять его до аскорбатного радикала.
Идентификация фенольных соединений с использованием индексов удерживания в высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)
Существует большое количество методик по изучению сложных смесей методом ВЭЖХ. Однако на практике они обычно трудно воспроизводимы. Хроматографические параметры - времена удерживания, факторы емкости - являются весьма чувствительными к различию марок сорбентов от разных фирм-производителей, к разнице температур и скорости подачи подвижной фазы.
Известно [78], что и в газовой (ГХ), и в высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) наиболее воспроизводимыми и, следовательно, наиболее надежными хроматографическими параметрами, используемыми для идентификации разделяемых веществ, являются индексы удерживания. Варианты использования ИУ в ВЭЖХ во многом похожи на их применения в ГХ: (а) идентификация аналитов; (б) характеристика разделяющей системы (подвижной и неподвижной фаз); (в) определение липофильности и ее соотношения с биологической активностью аналитов; (г) исследование соотношений структура-удерживание. Принципиальные различия при использовании ИУ в ВЭЖХ по сравнению с ГХ заключаются в их особенном значении, главным образом потому, что на жидкостную хроматографическую разделяющую систему оказывают влияние и подвижная, и неподвижная фазы. Широкий диапазон режимов элюирования в ВЭЖХ также приводит к широкому диапазону шкал ИУ с небольшой абсолютной корреляцией. Р. Смитом [78, 79] были определены следующие свойства стандартных серий гомологов, обладая которыми, последние могут быть использованы в качестве шкалы ИУ в ЖХ: (1) они должны иметь сильную хромофорную группу при 254 нм для того, чтобы их можно было в малых количествах добавлять к образцам неизвестного состава и использовать в качестве внутреннего стандарта; (2) они не должны легко ионизироваться, чтобы не возникали изменения в их удерживаниях при варьировании рН элюентов или при наличии ион - парных реагентов; (3) диапазон всех стандартных веществ серии должен быть коммерчески доступен по разумной цене; (4) удерживание большинства полярных членов серии должно быть аналогично удерживанию гидрофильных лекарственных веществ; (5) стандарты должны быть нереакционноспособными и устойчивыми к обычным для ЖХ реакциям; (6) должно существовать линейное соотношение между log к и числом углеродных атомов или характерных функциональных групп в молекулах гомологов. Таким образом, исходя из этих критериев, подходящими стандартами в ВЭЖХ могут служить ароматические соединения (предпочтительно - сопряженные - для увеличения интенсивности поглощения хромофорной группы, за исключением относительно неполярных углеводородов), эфиры, галогены или нитросоединения. Полярные соединения, такие как, амины, фенолы или кислоты, не могут быть использованы из-за их чувствительности к изменениям рН. Таким образом, пригодными к использованию в качестве стандартов в ВЭЖХ, остаются спирты, бензоатные и фенилалканоатные сложные эфиры, амиды и алкиларилкетоны. Однако только некоторые из этих соединений являются коммерчески доступными, хотя многие из них могут быть легко синтезированы.
Очевидно, что ИУ имеют гораздо более высокую воспроизводимость, чем времена удерживания, поскольку ИУ менее зависят от температуры и природы неподвижной фазы. Однако даже ИУ не могут полностью скомпенсировать различия в разделяющих способностях хроматографических систем, и это необходимо учитывать при проведении совместных межлабораторных исследований. Иногда различие ИУ на разных хроматографических колонках используется для определений различий в свойствах сорбентов, по аналогии с константами Роршнайдера в ГХ [79-81].
Были описаны методы [80] по исправлению ИУ на разных хроматографических сорбентах с помощью внутренних реперных стандартов. Эти методы наиболее ценны при исследовании групп родственных соединений, но оказываются менее пригодными, в том случае, когда изменение неподвижной фазы вызывает изменение порядка элюирования соединений.
В ранних работах [78, 81] описаны наблюдаемые отклонения ИУ при варьировании в широких диапазонах состава элюента. Более подробные изучения предсказаний удерживания, а также воспроизводимости и устойчивости ИУ к небольшим изменениям состава элюента в изократическом режиме представлены [79, 80].
При исследовании влияния элюентов и неподвижных фаз колонки на значения ИУ тестируемых соединений в изократическом режиме, было обнаружено, что разные растворители вызывали гораздо более сильные изменения значений ИУ, чем разные неподвижные фазы [82].
Было изучено [79] на основе шкалы алкан-2-онов влияние состава элюента на значения ИУ. Показано, что при использовании ИУ трех маркерных соединений: нитробензола, бензальдегида и толуола возможно компенсировать различия в свойствах широкого круга элюентов.
В качестве стандартов ИУ в ЖХ был выбран [79] ряд серий гомологов. Обычно используемые в ГХ, н-алканы имеют ограниченное применение в ВЭЖХ, поэтому в данном методе анализа используются в качестве стандартных шкал полярные и содержащие легко детектируемые хромофорные группы соединения. Стандартными сериями гомологов в ВЭЖХ, используемыми для идентификации и для предсказания удерживания широкого круга соединений, являются алкиларилкетоны, нитроалканы и алкан-2-оны [79].
В 1982 году Р. Смитом [78] была предложена шкала стандартов алкиларилкетонов, как предпочтительная для идентификации широкого круга соединений в ЖХ. В это же время Куроненом [80] также было предложено использовать ИУ алкиларилкетонов в качестве маркеров для идентификации компонентов химического оружия. Было показано [79], что существует линейное соотношение между log к и числом углеродных атомов алкиларилкетонов - от ацетофенона (1=800) до октанофенона (1=1400) - при соотношениях элюента метанол - вода от (30:70) до (80:20) объемных процентов. Широкий диапазон алкиларилкетонов является также коммерчески доступным, и эти стандарты находят широкое применение во многих лабораториях мира для идентификации лекарственных средств, микотоксинов, полихлорированных бифенилов и других соединений, для предсказания параметров удерживания и сравнения характеристик подвижной и неподвижной фаз в изократическом режиме элюирования методом ВЭЖХ.
Примеры определения соединений фенольной и полифенольной природы в различных объектах
Известно [38-42], что разделение фенольных соединений чаще всего проводят на модифицированных октадецильных сорбентах. Поэтому для работы нами были выбраны сорбенты Диасорб С18 и Hypersil ODS (на хроматографах Милихром А-02 и Agilent 1100, соответственно).
В качестве подвижной фазы использовали элюенты: А - вода, В -ацетонитрил, с добавлением в них до рН 3 фосфорной кислоты. Выбор ацетонитрила в качестве органического модификатора подвижной фазы обусловлен рядом причин. Ацетонитрил доступен в чистом виде, не поглощает в УФ - ВИД области, начиная от 205 нм (рис. 1), обладает большой элюирующей способностью, малой вязкостью, полностью смешивается с водой. В нем растворяются фенольные соединения. Кроме того, ацетонитрил не модифицирует поверхность привитых силикагелей, что характерно для некоторых других органических растворителей, например, ацетона. В работе были использованы подкисленные элюенты с целью улучшения хроматографического разделения пиков и продления сроков службы хроматографических колонок при анализе сложных смесей фенольных соединений.
Известно, что для каждой группы исследуемых фенольных соединений необходимо подобрать свои условия хроматографического разделения. Поскольку в нашей работе предполагалось изучать смеси фенольных соединений с широким диапазоном полярностей и в разных областях, таких как соединения хмеля, продукты радиационного окисления орцина, - то необходимо было выбрать оптимальный градиентный режим элюирования, позволяющий за сравнительно небольшой промежуток времени получать достаточное хроматографическое разделение изучаемых соединений. Была составлена модельная смесь из наиболее часто встречающихся в природных объектах представителей различных классов (табл. 1) фенольных соединений с широким диапазоном полярностей: двухатомные фенолы - гидрохинон, резорцин, пирокатехин, 5 - метилрезорцин; фенолокислоты - кофейная и бензойная кислоты; пропилгалат; флавонолы — морин, кверцетин, рутин; флавононол - дигидрокверцетин; флаванон - нарингин. Для выбора оптимальных условий элюирования были изучены хроматографические параметры модельной смеси фенольных соединений, полученные при их разделении в нескольких градиентных режимах. На рис. 2 (а, Ь, с) показана зависимость времен удерживания фенольных соединений от градиентного профиля на примере сорбента Hypersil ODS. С использованием градиента В наблюдаемые различия во временах удерживания достаточно велики, а время анализа не превышает 25 минут (табл 6). К нм детект. - выбранная длина волны детектирования соединения; 334 - регистрировался отрицательный пик кверцетина на хроматограмме, поскольку в рабочем состоянии находилась только дейтериевая лампа (УФ - детектор); tR, мин - время удерживания; W, мин - ширина пика при выбранной длине волны детектирования; S, mAu - площадь хроматографического пика; N - число теоретических тарелок; а - селективность разделения; Rs - разрешение; As - коэффициент ассимметрии. Сравнение эффективности разделения модельной смеси, полученной на данном сорбенте при разных градиентах, подтверждает преимущества градиента В (табл. 6). В данном случае число теоретических тарелок достигает значения более 141 тыс. на метр для самого сильно удерживаемого соединения в модельной смеси -нарингина. Именно в этом градиентном режиме получена наилучшая эффективность разделения для большинства фенольных соединений модельной смеси. Это обусловило выбор данного градиентного режима элюирования для использования его в дальнейшей работе. Аналогичным образом были выбраны оптимальные условия (табл. 7) градиентного элюирования на сорбенте Диасорб С18.
Идентификацию пиков компонентов в модельной смеси проводили по временам удерживания и спектрам оптического поглощения индивидуальных фенольных соединений.
Для определения всех компонентов в различных объектах необходимо было также оптимизировать условия детектирования фенольных соединений, для каждого из которых существуют оптимальные длины волн детектирования. Для получения наивысшей чувствительности детектирования индивидуальные фенольные соединения должны регистрироваться по наиболее оптимальным длинам волн. Для работы были выбраны пять длин волн детектирования: 240, 264, 280, 334 и 513 нм. Выбор длин волн 280, 334 и 513 нм обусловлен тем, что в спектре оптического поглощения флавоноидов длина 280 нм связана с поглощением ультрафиолетового света кольцом А (см. табл. 1, катехины), наличие поглощения при Х= 334 нм обусловлено поглощением света кольцом В, длина волны 513 нм характерна для антоцианов, имеющих в своей структуре пирилиевое кольцо [65, 67, 69, 70]. Длины волн 240, 264, 280 и 334 нм являются характерными для определения стильбенов [42, 44], и 240, 264, 280 нм являются также одними из длин волн максимума поглощения простых производных бензола, фенольных кислот и альдегидов [42, 44, 70]. Использование ДАД позволяло получать УФ -ВИД спектры разделяемых соединений в диапазоне 200 - 700 нм, независимо от выбранных длин волн детектирования.
Таким образом, на основании проведенного исследования и литературных данных были выбраны оптимальные условия хроматографического разделения и детектирования сложных смесей фенольных соединений (табл. 7), которые в дальнейшем использовали в работе.
Расчет хроматографических индексов удерживания (ИУ)
Известно [115, 116], что шишки хмеля содержат большое число биологически активных соединений, обладающих разными фармакологическими свойствами. К этим веществам относятся специфические, нигде более не встречающиеся горькие соединения (хмелевые смолы), полифенольные соединения, эфирные масла, витамины и гормоны. Хмель относят к числу растений наиболее богатых эстрогенными фитогормонами: от 2 до 30 мг на 100 г хмеля. По содержанию токоферолов (витамин Е) хмель превосходит зародыши пшеницы, служащие сырьем для получения токоферолов. Если в зародышах пшеницы их содержание составляет примерно 30 мг %, то в зависимости от сорта хмеля, их количество варьируется от 18 до 70 мг %. В настоящее время хмель сравнительно мало используется в парфюмерной и фармацевтической промышленности. Хотя, в частности, полифенольные соединения хмеля являются весьма перспективной группой лекарственных веществ. Эфирное масло ароматных сортов хмеля, обладающее нежным, тонким и приятным ароматом, а также успокаивающим физиологическим действием, может успешно использоваться в косметологии и в медицине. Главной областью использования хмеля является пищевая промышленность.
Известно [115 - 117], что в хмеле содержатся следующие фенольные и полифенольные соединения: флавоноиды (кверцетин, дигидрокверцетин, рутин, катехины, лейкоантоцианидины), оксикоричные и фенолкарбоновые кислоты. Наименее окисленными из них являются катехины и лейкоантоцианидины. Эти соединения обладают наиболее ярко выраженным антиоксидантным действием. Это является важным, в частности, для защиты различных компонентов хмеля (и впоследствии компонентов пива) от окисления.
В работе мы исследовали экстракты различных сортов хмеля с целью идентификации фенольных соединений экстрактов по их индексам и/или временам удерживания и спектральным данным с использованием созданной нами хроматографической базы данных (табл. 10). Было изучено влияние рН экстрагента и первичной обработки шишек хмеля на фенольный состав полученных экстрактов и их устойчивость при хранении. Для решения этих задач нами был выбран обращенно-фазовый вариант высокоэффективной жидкостной хроматографии. В качестве сравнительного метода для общей характеристики и оценки экстрактов исследуемых сортов хмеля был использован спектрофотометрический метод анализа.
Поскольку общепризнанно одними из лучших в мире считаются немецкие сорта пива, было интересно исследовать и сравнить экстракты сортов хмеля, широко используемые в настоящее время в российском производстве пива: чувашские - Подвязный и Ранний, польский - Lublin и немецкий - Spalter Select. Хроматографический анализ индивидуальных фенольных соединений и исследуемых экстрактов различных сортов хмеля осуществляли в выбранных ранее оптимальных условиях разделения и детектирования (табл. 7).
Были получены хроматограммы водных и 70 % водно -спиртовых [111] экстрактов всех сортов хмеля. Из сравнения хроматограмм водного и водно - спиртового экстрактов хмеля на примере сорта Spalter Select (рис. 4) видно, что максимальное количество соединений извлекается в 70 % водно - спиртовом экстракте хмеля. Поэтому в дальнейшей работе были исследованы водно - спиртовые экстракты хмеля.
Поскольку хмель является сложным природным объектом, то для идентификации входящих в его состав фенольных соединений был использован «метод отпечатков пальцев» («fmgersprint»). Из-за сложности состава экстрактов хмеля даже в выбранных нами оптимальных условиях хроматографического разделения и детектирования некоторые из веществ полностью разделить не удалось. На хроматограммах (рис. 5) экстрактов четырех сортов хмеля видно, что некоторые соединения, элюируемые одним пиком при 280 Из полученных хроматограмм (рис. 5) видно, что в состав всех экстрактов хмеля входят также соединения, имеющие более высокие времена удерживания, чем агликоны и гликозиды флавоноидов, приведенные в таблице (табл. 11). По-видимому, эти более сильно удерживаемые вещества обладают более высокой молекулярной массой и являются близкими по структуре к производным ксантогумола и его аналогов [118 - 120]. Из-за отсутствия соответствующих стандартов провести анализ этих соединений не представлялось возможным. Поэтому они были охарактеризованы с использованием времен удерживания и спектральных отношений (табл. 12).
На примере сорта Spalter Select было изучено влияние товарной формы на содержание полифенольных веществ в полученном водно -спиртовом экстракте хмеля. С этой целью были получены хроматограммы и спектры оптического поглощения водно -спиртовых экстрактов, приготовленных из необработанных, прессованных и гранулированных шишек хмеля сорта Spalter Select (рис. 6, 7, табл. 12).
