Содержание к диссертации
Введение
1. Принципы селективности в методах выявления точечных мутаций в НК (обзор литературы) 8
1.1. Детекция известных мутаций 8
1.1.1. Рестрикционный анализ 8
1.1.2. Аллель специфичная гибридизация 9
1.1.3. Методы выявления мисматчей в дуплексе олигонуклеотид/ДНК 13
1.1.3.1. Химическая реакция 13
1.1.3.2. ДНКзимы 14
1.1.3.3. Flap-эндонуклеазы 15
1.1.3.4. Методы лигирования 15
1.1.3.5. Методы, основанные на использовании ДНК-полимераз 19
1.2 Детекция новых мутаций 22
1.2.1. Конформационный анализ
1.2.1 Л. Конформационный полиморфизм одноцепочечной ДНК 22
1.2.1.2. Полиморфизм длин фрагментов при действии эндонуклеазой Cleavase I 22
1.2.2. Гетеродуплексный анализ фрагментов ДНК 23
1.2.2.1 Физико-химические методы 23
1.2.2.2. Методы химического расщепления гетеродуплексов 24
1.2.2.3. Методы детекции, основанные на использование мисматч узнающих белков 25
1.3 Методы секвенирования 28
1.3.1. Секвенирование при синтезе 28
1.3.1.1. Секвенирование по Сэнгеру 28
1.3.1.2. Секвенирование при полимеризации 31
1.3.2. Секвенирование при расщеплении 36
1.3.2.1. Химическое расщепление 36
1.3.2.2. Экзонуклеазное расщепление 36
1.4. Заключение 38
2. Экспериментальная часть 39
2.1. Исходные материалы 39
2.1.1. Реактивы и препараты 39
2.1.2. Буферы и растворы 39
2.1.3. Праймеры 40
2.2. Основные методы 40
2.2.1 Синтез и выделение олигонуклеотидов 40
2.2.2. Получение и выделение ПЦР-фрагментов 41
2.2.3. Метод лигирования олигонуклеотидов 42
2.2.4. УФ-иммобилизация и колориметрическое выявление на капроне 43
2.2.5 Исследование термической денатурации 44
2.2.6. Расчет термодинамических параметров комплексообразования 44
3. Выявления точечных мутаций в днк методом лигирования олигонуклеотидов: селективность этапов гибридизации и лигирования (результаты и обсуждение) 46
3.1. Разработка подхода к выявлению точечных мутаций 46
3.1.1. Концепция метода 46
3.1.2. Оптимизация условий анализа 49
3.1.2.1. Подбор концентрационных условий 49
3.1.2.2. Влияние дозы УФ-облучения на эффективность выявления ДНК 51
3.1.2.3. Эффективность лигирования тандемов олигонуклеотидов на различных ДНК-матрицах 52
3.1.2.4. Влияние длины ПЦР-фрагмента на эффективность его колориметрического выявления 60
3.1.3. Колориметрическое выявление точечных мутаций 62
3.1.3.1. Детекция тринуклеотидной делеции и вставки (модель CFTR) 62
3.1.3.2. Детекция однонуклеотидных замен (модель ВИЧ-1) 63
3.2.Селективность гибридизации 65
3.2.1. Описание модели 65
3.2.2. Анализ функции селективности 66
3.2.3. Изменение селективности при варьировании концентрации зонда 71
3.2.4. Изменение селективности при варьировании структуры зонда 73
3.2.5. Изменение селективности при выявлении различных мисматчеи 77
3.2.6. Анализ полученных результатов 81 33. Селективность лигирования 86
3.3.1. Дизайн модельной системы $6
3.3.2. Термическая стабильность модельных дуплексов 87
3.3.3. Лигирование комплементарных комплексов 90
3.3.4. Дискриминация одиночных мисматчеи вблизи одноцепочечного разрыва 93
3.4. Программа для выбора максимально селективных зондов 98
Выводы 103
Список литературы 104
Приложение 114
- Методы, основанные на использовании ДНК-полимераз
- Методы детекции, основанные на использование мисматч узнающих белков
- Эффективность лигирования тандемов олигонуклеотидов на различных ДНК-матрицах
- Изменение селективности при варьировании структуры зонда
Введение к работе
Развитие методов секвенирования ДНК привело к накоплению колоссального объёма информации, как о первичной структуре нуклеиновых кислот различных биологических объектов, так и о полиморфизмах в генетическом материале [1]. Наличие точечных мутаций позволяет судить о предрасположенности или присутствии генетических заболеваний, как моногенной, так и полигенной природы [2]. Мутации подобного типа часто являются причинами лекарственной устойчивости различных патогенных микроорганизмов и вирусов [3, 4], вызывающих, например, такие социально-значимые заболевания как туберкулез, гепатиты, СПИД и др. Все это свидетельствует о необходимости развития технологий достоверного выявления точечных мутаций, что позволит приблизиться к реализации персонифицированного подхода в профилактике и лечении различных заболеваний.
Описаны различные подходы выявления точечных мутаций в генетическом материале. Наиболее распространенными среди них являются аллель-специфичная ПЦР, TaqMan [5-7], минисеквенирование [8] и лигирование набора олигонуклеотидов [9,10]. Во всех этих подходах селективность выявления обеспечивается за счет ферментов, обладающих способностью различать полностью комплементарный комплекс и комплекс, содержащий мисматч. Так, ДНК-лигазы способны дискриминировать наличие некомплементарной пары вблизи одноцепочечного разрыва в ДНК-дуплексе, что нашло применение в подходе OLA (oligonucleotide ligation assay). Наличие мисматча существенно снижает эффективность формирования фосфодиэфирной связи, т.е. образование продукта лигирования позволяет судить о присутствии специфической последовательности ДНК. Однако в литературе отсутствует систематическая информация об эффективности дискриминации мисматчей в нике в зависимости от типа нуклеотидов.
С другой стороны большинство методов выявления точечных мутаций [5, 7, 9, 11-14] содержит этап гибридизации олигонуклеотидных зондов с НК-мишенью, который может быть использован для обеспечения дополнительной селективности выявления. Тем не менее формальное определение селективности гибридизации как количественного параметра до сих пор не нашло широкого применения.
Цели и задачи исследования:
Целью данной работы являлось систематическое исследование селективности метода ферментативного лигирования олигонуклеотидов и разработка на основе метода нового подхода к выявлению точечных мутаций в ДНК.
7 В ходе исследования решались следующие задачи:
разработка нового подхода к выявлению точечных мутаций в ДНК;
анализ влияния различных параметров на селективность гибридизации зонда с анализируемой ДНК при выявлении в ней точечных мутаций;
создание систематической базы данных, описывающей эффективность дискриминации ДНК-лигазой фага Т4 любых одиночных мисматчей вблизи сайта лигирова-ния;
разработка программного обеспечения для выбора олигонуклеотидных зондов, обеспечивающих наибольшую селективность выявления точечных мутаций методом ферментативного лигирования.
8 1. ПРИНЦИПЫ СЕЛЕКТИВНОСТИ В МЕТОДАХ ВЫЯВЛЕНИЯ ТОЧЕЧНЫХ МУТАЦИЙ В НК (обзор литературы)
Большинство методов выявления точечных мутаций включают несколько этапов: амплификацию, селективное получение специфического продукта и его детекцию. Первый этап - это амплификация исходного нуклеотидного материала (геномной ДНК или РЖ), количества которого, как правило, не хватает для анализа из-за недостаточной чувствительности большинства методов. На втором этапе проводят селективную реакцию, продукт которой позволяет судить о том содержит ли последовательность точечную мутацию или нет. И последний этап - это детекция специфического сигнала от продукта, полученного в результате селективной реакции, при его отделении, если необходимо, от исходной метки. Следует отметить, что возможны как совмещения некоторых этапов, например амплификации и селективной реакции, так и отсутствиенеко-торых из них, кроме второго этапа, который присутствует во всех случаях.
Данный обзор посвящен рассмотрению принципов, используемых в различных методах выявления точечных мутаций в НК, на основе которых происходит образование специфического продукта, свидетельствующего о наличии или наоборот отсутствии замены. Под селективностью понимается способность различения схожих нуклео-тидных последовательности, отличающихся друг от друга точечной мутацией. Селективная реакция может иметь совершенно разную природу, например, физико-химическую, ферментативную или химическую, при этом может происходить изменение массы, конформации, флуоресценции и т.д.
1Л. Детекция известных мутаций
Представленные в этой части литературного обзора методы применяются в случае, когда известна первичная последовательность анализируемого сайта, тип и локализация выявляемой точечной мутации.
1.1.1. Рестрнкционный анализ - (RFLP - Restriction Fragment Length Polymorphism)
Открытие рестриктаз позволило применить эти секвинс-специфичные эндонук-леазы для детекции точечных мутаций в ДНК. В случае, если мутация приводит к появлению или исчезновению определенного сайта рестрикции, обработка анализируемого ДНК-фрагмента рестриктазой и разделение получившихся продуктов специфического расщепления гель-электрофорезом позволяет судить о наличии или отсутствии мутации [15]. На настоящий момент известны десятки различных рестриктаз, но, несмотря
на это, ограничением метода остается возможность того, что мутация не затронет ни один из возможных сайтов рестрикции.
Решением этой проблемы стал подход, в котором такой сайт создается искусственно (PCR-mediated site-directed mutagenesis - ПЦР-опосредованный сайт направленный мутагенез) (Рис. 1). Для этого при амплификации ДНК используют праймер, который располагается в непосредственной близости от сайта мутации и в районе 3'-конца содержит нуклеотид, некомплементарный ни нормальной, ни мутантной ДНК. В том случае, если исходная ДНК содержит мутацию, в результате ПЦР образуется фрагмент, содержащий сайт рестрикции [16, 17]. Рестриктаза обычно подбирается так, чтобы сайт рестрикции содержал мутацию (т.к. обычно нужно доказать наличие мутации, а не отсутствие нормы), т.е. метод способен выявлять лишь заранее известные мутации. В случае нормальной ДНК сайт рестрикции не образуется и расщепление соответствующей рестриктазой не происходит.
1.1.2. Аллель специфичная гибридизация
Гибридизация ДНК (РНК) с радиоактивно меченными протяженными зондами (сотни нуклеотидов) стала активно использоваться с разработкой методов Southern и Nothern блот-гибридизации [15,18]. Разделенные в геле электрофорезом фрагменты НК переносят на мембрану (капрон, нитроцеллюлоза) и после их иммобилизации (УФ-свет, вакуум) проводят инкубацию в денатурирующих условиях с протяженным зондом, полученным путем клонирования или ПЦР. Данный метод используется для детекции определенных нуклеотидных последовательностей.
Применение синтетических олигонуклеотидных зондов (~20 нт.) позволило не только выявлять интересующую последовательность, но и детектировать присутствие в ней мутаций [19], т.к. наличие некомплементарности дестабилизирует комплекс ДНК-зонд. Подбор условий, при которых бы происходило образование полностью комплементарного комплекса, а образование комплекса, содержащего мисматч, протекало бы на низком уровне, является непростой задачей.
Гибридизацию зонда с ДНК-мишенью проводят либо в растворе, либо на твердой фазе. Гибридизация в растворе протекает с большей скоростью, но при этом возникает необходимость отделения гибридизационного комплекса от несвязавшегося зонда, несущего метку для детекции. Подход, позволяющий в реальном времени наблюдать образование специфичного гибридизационного комплекса в растворе, основан на введение пары флуорофоров -донора и акцептора, по концам олигонуклеотида (FRET -
нормальная ДНК
мутантная ДНК
мутация
/
праймер
XXX-
Х'Х'~
/
мисматч
X X У-
Х'Х'""
пц
X X X х-Z Х'Х'Х'-
/
рестриктаза сайт рестрикции
X X X 7
Z X'X'Y
рестриктаза
X X X X-
Z Х'Х'Х'-
-X X X
zi——'ї-
Х'Х'Ї'-
Рис. 1. ПЦР-опосредованный сайт направленный мутагенез.
голубой
оранжевый
донор
акцептор
500 JS0 600 650
Длина волны (Нм)
Рис. 2. (А) Условная схема переноса энергии от флуоресцеина (F) к родамину (R).
(Б) Спектры испускания флуоресцеина (—) и поглащения родамина ( ).
&
(Ш(р))Ш?1@11Ш)11@
Рис. 3. Подходы использования FRET для детекции гибридизационных комплексов: (А) каждый из олигонуклеотидов, входящих в состав дуплекса, несет репортерную группу (D - донорную, А - акцепторную); (Б) метятся олигомеры, образующие комплекс с мишенью; (С) акцепторную группу несет зонд. В образовавшийся дуплекс встраивается интеркалятор, обладающий свойствами донора.
Fluorescence Resonanse Energy Transfer). Примером такой пары являются флуоресцеин и родамин (Рис. 2). Флуоресцирующие группировки подбираются так, чтобы происходило частичное перекрывание спектра испускания одной группировки со спектром возбуждения другой. Эффективность переноса энергии обратно пропорциональна шестой степени расстояния (R) между донором и акцептором (где Ro const). Максимальный перенос происходит на расстоянии 20-80 А [20].
На первых этапах использования FRET для детекции гибридизации применяли модели, в которых перенос энергии регистрировался при образовании гибридизацион-ного комплекса (Рис. 3) [21], например, при гибридизации двух меченых олигонуклео-тидов рядом друг с другом. Следующим шагом в дизайне флуоресцентных зондов стало создание бнконов или молекулярных маячков (molecular beacons). Такие олиго-нуклеотиды образуют шпилечную структуру и несут по концам остатки красителей, между которыми возможен перенос энергии. В случае пары красителей флуорофор-флуорофор обеспечивается эффективное "свечение" акцепторной группировки, а в случае пары флуорофор-тушитель "свечение" зонда в свободном состоянии не регистрируется (Рис. 4). При образовании комплекса ДНК/зонд происходит увеличение расстояния между парой красителей и наблюдается, соответственно, либо снижение, либо возрастание флуоресценции [22]. Следует отметить, что взаимодействие молекулярных маячков с ДНК характеризуется повышенной (относительно обычных олигонуклеотидных зондов) чувствительностью к нуклеотидным несоответствиям. Это реализуется именно из-за способности маячков формировать внутримолекулярную структуру, частично препятствующую их связыванию даже с комплементарной и тем более с мутированной ДНК-матрицей (Рис. 5) [23].
Подходы, основанные на гибридизации олигонуклеотидных зондов, для получения достоверного ответа требуют точного соблюдения оптимальных условий проведения анализа из-за пониженной чувствительности протяженных олигонуклеотидных зондов к однонуклеотидным заменам в последовательностях анализируемой ДНК.
В настоящее время можно выделить несколько стратегий, направленных на увеличение селективности гибридизации олигонуклеотидов с НК. Во-первых, это изменение условий гибридизации: температуры анализа, концентрации зонда и буферных условий [24-26]. Ко второй группе подходов можно отнести использование конкурентного ингибирования - триплексы (stringency clamping) [27] и молекулярные маячки [28, 29].
Тушитель (акцептор)
Флюорофорі (донор)
А Флюорофор
(донор)
/ Флюорофор (акцептор)
Рис. 4. Детекция образования гибридизационого комплекса с использованием биконов. Вторичная структура бикона в свободном состоянии такова, что репортерные группы сближены. Образование гибридизационного комплекса резко понижает эффективность переноса энергии. (А) Зонд с двумя флюорофорами. (Б) Зонд с флюорофором и тушителем флуоресценции.
10 20 30 40 »0 00 70 00
темепература (С)
Рис. 5. Сравнение уровня дискриминации мисматча молекулярным биконом и линейным
олигонуклеотидным зондом при плавлении их комплексов. (—) - плавление комплекса,
содержащего мисматч, ( ) - плавление совещенного комплекса.
13 Также стоит отметить подход повышения селективности, основанный на использовании различий в кинетике (в скоростях) образования комплементарных комплексов и комплексов, содержащих мисматч. Возможность использования подхода была продемонстрирована на примере олигонуклеотидных чипов, которые отмывали после гибридизации с анализируемой мишенью [30,31]. Еще одним направлением является уменьшение длины зонда и использование стэкинг-гибридизации [32-40].
К отдельному направлению повышения селективности гибридизации стоит отнести использование модифицированных олигонуклеотидных зондов. Условно модификации можно поделить на две группы, а именно на модификации, увеличивающие температуру плавления комплекса зонд/НК: PNA [41], LNA [42], кольцевые [43], кросс-сшитые и бициклические [44], зонды с 3'- малобороздочным лигандом [45] и др. и модификации, понижающие её, например, при введении искусственных мисматчей [46, 47] или ненуклеотидной вставки [48,49].
1.1.3. Методы выявления мисматчей в дуплексе олигонуклеотид/ДНК
В ряде подходов гибридизация олигонуклеотидного зонда с анализируемой ДНК используется главным образом для адресного формирования дуплексных структур, а селективность анализа достигается за счет мисматч-зависимого ингибирования различных ферментативных и химических реакций. 1.1.3.1. Химическая реакция
Оригинальным решением стало использование в качестве ДНК-збндов конъюга-тов олигонуклеотидов, несущих остаток интеркалятора акридина, содержащий сложно-эфирную связь (НРА - Hybrydization Protection Assay) (Рис. 7). При гибридизации с таким зондом в случае формирования правильного комплекса остаток акридина встраивается в формируемую двуцепочную структуру ДНК/зонд. При образовании комплекса с мисматчем интеркаляция акридина становится менее вероятной. Изменение условий после проведения гибридизации на слабощелочные ведет к гидролизу сложноэфирной связи, но только в составе тех зондов, которые не связались с ДНК-мишенью или у которых в комплексе с ДНК-мишенью есть мисматч с 5'- или 3'-стороны от акридина, т.е. акридин остается только в совершенном комплексе. На следующем этапе проводят гидролиз оставшегося эфира акридина при добавлении Н2О2 с НС1 и фиксируют хемилюминееценцию [11]. Данный метод позволяет достоверно дискриминировать присутствие любого из мисматчей вблизи остатка акридина, т.е. с по-
мисматч
/
зонд
акридин
гидролиз
сайт расщепления рибонуклеотиды і
*
NNN>^NR*y|nNNNNN NNNNNNN NNNNNNN
GA GG
С Т
гидролиз
С А
CATCG
R=A,G Y=U,C
Рис 7. Дискриминация точечных мутаций в по- Рис. 7. Структура "10-23" ДНКзима. следовательности ДНК при гибридизации с оли-гонуклеотидным зондом, несущим производное акридина.
мощью набора из двух олигонуклеотидов можно определить наличие или отсутствие
мутации.
1.1.3.2. ДНКзимы
В последние несколько лет были разработаны методы, которые позволяют отбирать последовательности ДНК и РНК, обладающие заданными каталитическими активностями (SELEX). Одними из первых были обнаружены рибозимы, обладающие РНК-эндонуклеазной активностью. Но использование рибозимов осложнено их относительной неустойчивостью и дороговизной синтеза по сравнению с ДНК [50].
Использование олигодезоксирибонуклеотида-ДНКзима "10-23", состоящего из двух функциональных частей (Рис. 7): каталитического домена, являющегося сиквенс-специфичной РНК-эндонуклеазой, и фланкирующих его последовательностей, обеспечивающих комплементарное связывание, позволило выявить точечные замены в анализируемой ДНК. При ПЦР использовался праймер, содержащий в своей последовательности три рибонуклеотида. ДНКзим после гибридизации с анализируемым фрагментом вносил разрыв между двумя рибонуклеотидами только в случае отсутствия мисматчей вблизи гидролизуемого сайта [51].
15 1.1.3.3. Flap-эндонуклеазы
Ряд ферментов (flap-эндонуклеазы) обладает эндонуклеазной активностью по отношению к нависающему нуклеотидному концу, образующемуся на стыке двух оли-гонуклеотидных зондов (1 и 2) на общей матрице ДНК (Рис. 8). В результате ферментативного расщепления нависающего конца зонда (2) формируется двуцепочечная ДНК с одноцепочечным разрывом. Оказалось, что замена в зонде (2) нуклеотида, который бы при отщеплении нависающей части оказался в нике, ведет к тому, что данная структура перестает быть субстратом для flap-эндонуклеазы [52]. Данное свойство позволяет использовать фермент для анализа точечных мутаций.
1.13.4. Методы лигирования
В эту группу попали методы, в основе которых лежит образование ковалентной связи между олигонуклеотидами, гибридизующимися встык на общей ДНК-матрице. Суть подхода заключается в том, что при наличии мисматча в точке лигирования образование фосфодиэфирной связи происходит с меньшей эффективностью или не идет вовсе. Проведение лигирования возможно с помощью ферментов, либо химическим путем. 1). Химическое лигирование
Методы химического лигирования условно можно поделить на две группы. В первую - входят те, подходы которые предполагают использование конденсирующих агентов, таких например, как бромциан (BrCN) или производные карбодиимида [53]. Во вторую группу можно отнести методы, использующие модифицированные концевые нуклеотиды в зондах. Модификация состоит во введении предактивированных ре-акционноспособных группировок, способных к образованию ковалентной связи в составе формируемых тандемных комплексов. Примером этого может служить использование пары олигонуклеотидов, один из которых несет 5'-йод отими дин, а другой 3'-фосфоротиат. Лигирование этих производных (нетребующее никаких дополнительных агентов) проходит лишь при отсутствии мисматчей вблизи ника [54]. К недостаткам химического лигирования можно отнести низкую скорость и невысокую селективность в сравнении ДНК-лигазами.
участок расщепления Flap-эндонуклеазы
5'
зонд 1
^N зонд 2 3*
анализируемая ДНК
5'
Рис. 8. Принцип действия Flap-эндонуклеазы.
ДНК-лигаза \
~~Z53P~
мисматч
Рис. 9. Схема дискриминации однобуквенных замен в последовательности ДНК путем лигирования пары олигонуклеотидов.
\
/G
полимеоаза
dATP
dCTP
лигаза \
лигаза \
Рис. 10. Схема детекции точечных мутаций методом GAP-лигирования.
17 2) Ферментативное лигирование (ДНК-лигазы)
Возможность выявления в ДНК однонуклеотидных замен с помощью ДНК-лигазы обеспечивается снижением эффективности лигирования на ней двух олигонук-леотидов при наличии в комплексе некомплементарной пары оснований в непосредственной близости от сайта лигирования (Рис. 9) [55, 56]. Избирательность ДНК-лигазы зависит от типа и положения однобуквенной замены по отношению к месту образования фосфодиэфирной связи между олигонуклеотидами. Однако в случае протяженных зондов субстратная специфичность фермента не может обеспечить однозначность образования продуктов лигирования зондов только в правильном комплексе с ДНК [57-60].
Одним из подходов к усовершенствованию метода лигирования с целью выявления однонуклеотидных замен в последовательности ДНК-матрицы является уменьшение длины одного из двух литеруемых олигонуклеотидных зондов [56, 57]. Это может быть связано с тем, что, обладая относительно слабыми гибридизационными свойствами, короткие олигонуклеотиды (6-Ю звеньев) образуют существенно менее стабильные комплексы, содержащие хотя бы одну некомплементарную пару. Однако и в этих случаях наличие однонуклеотидного несоответствия в последовательности лиги-руемых олигонуклеотидов и ДНК-матрицы не во всех случаях обеспечивает полное отсутствие продукта лигирования.
Было показано [61], что практически полностью исключить образование "неправильного" продукта удается при литеровании на ДНК-матрице трех коротких олигонуклеотидов октамер-тетрамер-октамер, если мисматч находится в комплексе центрального тетрануклеотида. Высокая специфичность лигирования таких тандемов обусловлена как высокой селективностью связывания тетрануклеотида с матрицей в присутствии фланкирующих его октамеров, так и повьппенной избирательностью действия фермента, поскольку любой мисматч в тетрануклеотидном дуплексе при литеровании тандема pNs+pfy+pNe находится вблизи литеруемых сайтов [61].
По аналогии с использованием фрагмента Кленова в ПЦР лигаза может использоваться для амплификации специфического продукта лигирования путем многократного проведения температурных циклов (денатурация, отжиг, температура лигирования) с добавлением ДНК-лигазы на каждый цикл [56]. Открытие термостабильной ли-газы дало возможность упростить метод, избавившись от необходимости добавлять ли-газу после каждого этапа денатурации [62]. Использование флуоресцентно меченых
18 олигонуклеотидов позволяет детектировать продукт лигирования в реальном времени [63, 64].
GAP-ligation ("заполнение бреши" и лигирование) - метод, объединивший в себе ферментативное лигирование и полимеризацию [65]. Селективный отбор происходит на двух этапах: сначала ДНК-полимераза встраивает между двумя олигонуклеотидами соответствующий комплементарный мономер напротив неспаренного нуклеотида ("gap''-гэп), а на втором этапе лигаза соединяет два олигонуклеотида, если был встроен правильный нуклеотид (Рис. 10).
Сочетание гэп-лигирования, как метода, обеспечивающего селективность, и RCA (Rolling-Circle Amplification) (Рис. 11) - амплификации по модели катящегося кольца, позволяет детектировать точечные мутации при наличии всего лишь нескольких молекул ДНК. Гэп-лигирование обеспечивает селективность, но в процессе заполнения гэпа и лигирования ника образуется кольцевой олигонуклеотидный зонд. При добавлении праймера термостабильная ДНК-полимераза, лишенная 5'-3' экзонуклеаз-ной активности, использует получившийся кольцевой зонд в качестве матрицы. После того, как полимераза достраивает цепь до 5'-конца праймера, т.е. замкнет кольцо, она начинает вытеснять синтезированную цепь и продолжает полимеризацию [65]. Получение высокополимерного одноцепочечного ДНК-продукта, состоящего из повторяющейся последовательности, свидетельствует о прохождении первоначального этапа -гэп-лигирования.
Заполнение полимеразой гэпа и последующее
лигирование образующегося ника
ДНК-матрица
^Ч / тЛпраймер
Рис. 11. Схема амплификации по модели катящегося кольца -Rolling-Circle Amplification.
1.1.3.5. Методы, основанные на использовании ДНК-полимераз
Практически во всех методах первоначально анализируемая ДНК-матрица ам-плифицируется обычно с помощью ПНР. Поэтому использование для детекции мутаций свойств ДНК-полимераз обладает явным преимуществом, т.к. один и тот же фермент отвечает и за амплификацию, и за селективность. Известно, что ДНК-полимеразы могут обладать различными активностями, которые нашли применение в методах выявления мутаций, например, 5'-3' ДНК полимеризующая, 3'-5' экзонуклеазная и 5'-3' экзонуклеазная.
1) Аллель-специфичный ПЦР (ARMS - Amplification Refractory Mutation System, PASA - PCR Amplification of Specific Alleles)
-t
D PCR
АВ(мутант)
Метод аллель-специфичного ПЦР основан на чувствительности полимеразы к наличию несоответствия между матричной ДНК и З'-концом одного из праймеров, ПЦР в этом случае протекает с меньшей эффективностью. Данное свойство фермента используют, например, для определения разных аллелей гена [5]. В качестве аллель-специфичных праймеров используют два олигомера, последовательность которых отличается одним нуклеотидным звеном вблизи 3'-конца (чаще всего в предпоследней позиции). В качестве парного им праймера используют одну и ту же олигонуклеотидную последовательность. Далее на образце ДНК проводят параллельно две ПЦР с двумя парами подобранных праймеров: один и тот же на одну цепь и два аллель-специфичных праймера на другую. В зависимости от того, как прошли ПЦР, можно судить гетерозигота
Рис. 12. Схема аллель-специфичной ПЦР ли это *"* гомозигота как по норме, так и по с использованием четырех прай-меров, мутации для детекции гетерозиготы.
20 Возможность выявления гетерозиготной мутации в анализируемом генетическом материале в ходе одной полимеразной цепной реакции реализуется в подходе, основанном на одновременном использовании четырех праймеров (Рис. 12). ПЦР-продукт праймеров А и В содержит исследуемый сайт, который может содержать точечную мутацию. Праймеры С и D состоят из аллель-специфичной части (~10 нуклеотидов) и GC-богатого "хвоста" на 5'-концах (~10 нуклеотидов) [66]. "Хвост" не дает фрагментам AD и СВ служить затравками друг для друга. АВ-фрагмент, как и исходная ДНК, может выступать матрицей для амплификации фрагментов AD и СВ, а также служить дополнительным маркером.
ДНК-матрица
праимер
* !?'
праймер \^J
первый цикл
ДНК-матрица
^Ъ
второй цикл
ffMM »»#»! #»»**#»#»»»»*»#*#»#*
[ЦИКЛ
продукт
>.с
Рис 13. Схема метода детекции ПЦР-продукта по мере его накопления с использованием биконов (о-флуорофор, -тушитель)
21 Основным методом детекции ПЦР-продуктов до недавнего времени оставалось электрофоретическое разделение реакционных смесей. Одним из интересных подходов к детекции ПЦР-продукта по мере его накопления является использование молекулярных маячков. На 5'-конце одного из праймеров находится шпилечная структура, несущая флуорофор, сближенный с тушителем, введенным в противоположную цепь стебля шпильки (Рис. 13). Излучение флуорофора, поглощается в закрытом состоянии шпильки, но в результате прохождения ПЦР шпилька раскрывается, пара флуорофор-тушитель разносится в пространстве и наблюдается флуоресценция [67].
2) Ник-трансляция
Еще одним подходом, позволяющим детектировать протекание ПЦР непосредственно по ходу реакции в реальном времени, является использование 5'-3' экзонукле-азной активности Taq полимеразы. Метод основан на способности полимеразы в процессе элонгации праймера гидролизовать олигонуклеотидный зонд, комплементарный внутреннему участку амплифицируемого фрагмента ДНК (Рис. 14) [68]. 3'- Конец зонда при этом блокирован, что исключает возможность его использования в качестве праймера.
Однако данный метод позволяет не только следить за накоплением продукта ПЦР, но и выявлять мутации. В том случае, если амплифицируемая ДНК содержит мутацию в сайте связывания меченного флуорофорами зонда, то подбираются условия, в которых комплексообразования зонда не будет протекать. Если же зонд полностью ко-плементарен матрице, то полимераза расщепляет зонд за тушителем, т.е. пара флуоро-фор-тушитель разносится и наблюдается флуоресценция [69]. Метод позволяет проводить детекцию в режиме реального времени и в масштабах нескольких нанолитров [12]. В настоящее время используются олигонуклеотиды, несущие на 5'-конце флуорофор, а на З'-конце тушитель (технология TaqMan [70]). Флуорофор начинает флуоресцировать, если Taq полимераза отщепляет его вместе с 5'-концевым нуклеотидом зонда, что говорит о прохождении ПЦР.
сайт расщепления
Элонгация праймера
гт ' | '
3' ДНК-матрица
ДНК-полимераза
Рис. 14. 5-3' экзонуклеазная активность Taq полимеразы.
22 1.2. Методы выявления новых мутаций
В данный раздел обзора литературы вошло описание методов, которые используют для детекции новых мутаций. В их основе лежит сравнение анализируемого фрагмента НК с аналогичным контрольным фрагментом известной нуклеотидной последовательности. Методы, как правило, позволяют говорить о присутствии мутации, но в некоторых случаях можно судить о типе мутации и/или об её локализации.
1.2.1. Конформационный анализ
1.2.1.1. Конформационный полиморфизм одноцепочечной ДНК (SSCP - Single Strand Conformation Polymorphism) Метод основан на регистрации различий в электрофоретической подвижности
одноцепочечных ДНК-фрагментов, одинаковых по длине, но различающихся по пространственной структуре. Замена даже одного нуклеотида в последовательности анализируемого фрагмента приводит к некоторому изменению вторичной и третичной структуры одноцепочечной ДНК.
Исследуемый участок ДНК амплифицируют, получившиеся продукты полиме-разной цепной реакции (ПЦР) подвергают денатурации и анализируют в нативном ПААГ. После тепловой денатурации анализируемого ДНК-фрагмента его цепи в результате самоотжига образуют уникальную (для каждого фрагмента) пространственную структуру (шпильки, петли и т.д.). Метод позволяет выявлять до 80% всевозможных мутации, не локализуя их положение в последовательности анализируемого ДНК-фрагмента [71].
1.2.1.2. Полиморфизм длин фрагментов при действии эндонуклеазой Cleavase I (CFLP - Cleavase Fragment Length Polymorphism) В некотором смысле метод аналогичен предыдущему, т.к. тоже определяет различия в структуре одноцепочечной ДНК. При формировании пространственной структуры одноцепочечной фрагмента образуются шпильки, являющиеся субстратами для эндонуклеазы Cleavase I, которая специфично носит разрыв в последовательность ДНК с 5' конца основания стебля шпильки. При разделении электрофорезом ДНК, обработанную Cleavase I, регистрируется определенный набор фрагментов, который для ана-лизирумой и контрольной ДНК может отличаться, что говорит о различиях в их первичной структуре, т.е. о присутствии мутаций [72,73].
анализируемая
"эталонная"
ДНК
Y*
денатурация, отжиг
v
Y Рис. 15. Получение гетеродуплекса при гибридизация "эталонной" с анализируемой ДНК, несущей точечную мутацию.
1.2.2. Гетеродуплексный анализ фрагментов ДНК
Этот анализ основывается на обнаружении нуклеотидных несоответствий в дуплексах, образованных анализируемой и "эталонной" (например, не содержащей мутаций) ДНК (Рис. 15). После совместной термической денатурации в процессе отжига при температуре близкой к температуре плавления формируется дуплекс. В том случае, если анализируемая ДНК отличается от "эталонной", образуется так называемый гете-родуплекс, в котором присутствуют содержащие несовершенные пары оснований. В ситуации полной комплементарности идет формирование гомодуплекса. В зависимости от принципов, на которых построен анализ гетеродуплекса, можно выделить следующие подходы:
физико-химические [74-79];
химического расщепления [80-851:
основанные на действие ферментов Г86-101").
1.2.2.1 Физико-химические методы
1) Электрофоретический анализ
Гетеродуплексный анализ - НА (Heteroduplex Analysis) [74]:
Гетеродуплексные молекулы ДНК имеют иную электрофоретическую подвижность по сравнению с гомодуплексами за счет конформационных изменений в сайтах нуклеотидных несовпадений. Электрофоретический анализ фрагментов ДНК в натив-ных условиях позволяют выявить наличие мутации.
24 Метод денатурирующего градиентного гель электрофореза - DGGE (Denaturation Gradient Gel Electrophoresis) [75] и метод температурного градиентного гель электрофореза - TGGE (Temperature Gradient Gel Electrophoresis) [76,77].
При проведении гель-электрофореза создаётся горизонтальный или вертикальный градиент концентрации денатурирующего агента (мочевины или формамида) в первом случае, и температуры во втором. По мере продвижения ДНК-фрагмента в денатурирующем геле происходит его плавление и образующиеся при этом одноцепочеч-ные участки снижают скорость его движения. Плавление гомо- и гетеродуплексов отличается, что приводит к отличаям и в их подвижности. В результате электрофоретиче-ского разделения наблюдается уникальный профиль полос (бэндов), позволяющий различить мутантный вариант ДНК-фрагмента от нормального.
2) Хроматографические подходы
Денатурирующая высокоэффективная жидкостная хроматография - DHPLC (De-
naturating High Performance Liquid Chromatography):
Проведение ион-парной обращенно-фазовой хроматографии в подобранных денатурирующих (температурных) условиях, аналогично гель-электрофорезу, позволяет выявлять точечные мутации [78, 79]. Для хроматографического разделения дуплексов используется сорбенты с привитой гидрофобной фазой. Эмпирически подбирается температура, при которой наблюдаются наилучшее отличие между гомо- и гетеродуп-лексом. Изменение профиля хроматограммы, наличие двух или трех пиков, вместо одного свидетельствует о присутствии мутации.
1.2.2.2. Методы химического расщепления гетеродуплексов (ССМ -Chemical
Cleavage Mismatch)
Методы, входящие в данный раздел, основаны на специфической модификации химическими агентами двуцепочечного гетеродуплекса по некомплементарным сайтам, Основания, не участвующие в формировании канонических водородных связей в дуплексе ДНК, способны эффективно реагировать с различными НК модифицирующими агентами.
Один из первых химических реагентов, который использовался при детекции мутаций, был водорастворимый карбодиимид. Под действием карбодиимида G и Т, входящие в состав мисматчей, подвергаются модифицикации, что приводит к сниже-
25 нию подвижности такого гетеродуплекса в геле при разделении электрофорезом [80]. В настоящее время метод практически не применяется.
Пиримидиновые основания С или Т в мисматчах могут быть специфически модифицированы гидроксиламином (NHiOH) и тетраоксидом осмия (OsO,*) соответственно. А при последующей обработке пиперидином происходит расщепление таких сайтов ДНК. По длине получаемых фрагментов судят о местонахождении мутации. В том случае, если мисматчи в гетеродуплексе не содержат Т или С, всегда существует возможность проанализировать гетеродуплекс, образуемый второй комплементарной цепью анализируемого фрагмента. В этом случае мисматч уже будет содержать детектируемое пиримидиновое основание. Изначально в подходе применялись радиоактивно меченые ДНК-фрагменты, разделяемые гель-электрофорезом [81]; более удачным вариантом, на настоящий момент, можно считать использование флуоресцентного мече-ния и разделение фрагментов как обычным [82], так и капиллярным электрофорезом [83].
Явным преимуществом данного метода является возможность выявления всех
типов мисматчей, а недостатком высокая токсичность ДНК-модифицирующих агентов,
Os04hNH2OH.
Существуют и другие подходы, например, основанные на использовании вместо
Os04 перманганата калия (КМпО.<) в присутствии тетраалкиламмонийных солей.
Этот реагент в присутствии этих солей в основном модифицирует остаток тимидина в
составе несовершенных пар оснований [84,85].
1.2.2.3. Методы детекции, основанные на использование мисматч узнающих белков
В данных методах для детекции мисматчей в гетеродуплексах используются два типа белков - мисматч связывающиеся и мисматч расщепяющие (эндонуклеазы). 1) Детекция мутаций с участием белков системы репарации:
Подход использует уникальное свойство некоторых белков системы репарации образовывать комплексы с участками ДНК, содержащими мисматчи, причем некоторые из них проявляют при этом эндонуклеазную активность.
Примером могут служить белки системы мисматч-репарации E.coli (MutS, MutL и MutH). Белок MutS способен узнавать в структуре дуплекса мисматчи (кроме CIC), 1-4-х нуклеотидные вставки, делеции и образовывать прочный комплекс с таким районом ДНК. Это свойство было использовано для выявления гетеродуплексов за счет
26
MutS задержки их комплексов с MutS при раз-
5'
экзонуклеаза
делении гель-электрофорезом в нативных
условиях [86]. Также выявлять гетеродуп-
лесы с помощью MutS можно иммобили
зовав последний на нитроцеллюлозу [87].
В таких вариантах детекции можно гово
рить лишь о присутствии мутации, но не о
типе и не её локализации.
с> Определить положение мисматча в
составе гетеродуплекса с точностью до 20
Рис. 16. Локализация мисматча при действии нуклеотидов возможно в том случае, если
3'-5' экзонуклеаз на комплекс MutS с гетероду-
плексом образовавшийся комплекс MutS с ДНК
обработать 3'-5' экзонуклеазой (Рис. 16). Результатом ферментативного гидролиза будет образование двух одноцепочечных фрагментов ДНК, комплементарных друг к другу с 3' концов (этот дуплекс - участок связывания MutS). Если полученные фрагменты мечены, то при сопоставлении их длины (после разделении в геле) можно локализовать участок ДНК, содержащий мутацию [88].
Остальные белки мисматч-репарационной системы MutL и MutH также применяются для детекции мутации [89, 90]. С комплексом MutS-мисматч связывается MutL, далее этот комплекс, в присутствии АТР, активирует латентную эндонуклеазу MutH. Последняя вносит разрыв в ДНК, причем по сайту GATC ближайшему к мутации. При этом мисматч и сайт рестрикции могут быть разнесены более чем на 1000 н.п. Ограничения метода заключаются в том, что длина амплифицируемого фрагмента в среднем должна быть не меньше 300 н.п. для того, чтобы с высокой вероятностью в нем присутствовал сайт GATC. Результаты такого анализа не позволяют судить о том, где находится мутация, а свидетельствует лишь о её наличии.
Ещё одним примером применения белков, участвующих в репарационных процессах, для поиска мутаций является использование ДНК-гликозилазы E.coli - MutY. Этот фермент выщепляет аденин из пар G/A и С/А (из последней пары с меньшей эффективностью), при этом образуется апуриновый сайт [91]. Образование такого сайта, в результате активности ДНК-гликозилазы, регистрируется за счет взаимодействия био-тинилированного гидроксиламина с остатком дезоксирибозы в составе АР-сайта. Полученная таким образом биотинилированная ДНК может быть отделена, например, с помощью покрытых стрептавидином магнитных шариков [92, 93]. Ограниченность ис-
27 пользования ДНК-гликозилаз связана с небольшим количеством типов мисматчей, выявляемых данными ферментами.
2) Рибонуклеаза А:
Субстратами для РНКазы А являются пиримидиновые основания, расположенные в одноцепочечных участках РНК в гетеродуплексах ДНК/РНК [94] и РНК/РНК [95]. Метод мало используется, т.к. позволяет выявлять только порядка 30-40% точечных мутации, РНКаза А имеет сиквенс-специфичность (расщепление подвергается главным образом сайт Ру-А [96]).
3) ДНК-эндонуклеазы (Рис. 17):
эндонуклеаза VII бактериофага Т4 [97,9$] и эндонуклеаза I бактериофага Т7 [99]. Их также называют "резолвазы", эти ферменты участвуют в таких процессах как разрешение перекреста Холидея, репликация и упаковка фаговой ДНК. Данные эндонук-леазы также способны узнавать мисматч в ДНК и вносить разрывы с 5'-сторон от него (это относится и ко всем следующим эндонуклеазам).
S1 нуклеаза из Aspergillus oryzae в настоящее время практически не используется для детекции из-за невысокой специфичности. Оптимум работы S1 нуклеазы находится в области рН 4.2, а это приводит к частичной денатурации дуплекса (А/Т участков), т.е. образованию одноцепочечных участков, которые и являются субстратом для фермента [100].
CEL I нуклеаза (растительного происхождения) оказалась в этом плане более удобной, потому что её оптимум работы находится в нейтральном рН, что снижает неспецифическое расщепление гетеродуплекса [101].
эндонуклеаза
5'
^\—?
эндонуклеаза Рис. 17. Ферментативный гидролиз гетеродуплекса
28 1.3. Методы секвенирования
Наиболее полным и прямым методом определения полиморфизма генетического материала является секвенирование de novo. Методы определения нуклеотидной последовательности условно можно поделить на три группы. К первой группе относятся методы, основанные на определение сиквенса при или в результате синтеза ДНК, ко вторым - методы,, в основе которых лежит расщепление анализируемой молекулы биополимера.
В ряде случаев в исчерпывающем секвенировании нет необходимости, поскольку известен изменяемый участок генома, и вопрос сводится к установлению первичной структуры лишь определенного сайта. При однонуклеотидном полиморфизме (SNP -Single Nucleotide Polymorphism), достаточно лишь определить какой из двух нуклеоти-дов, соответствующих определенному аллелю гена, находится в анализируемом положении в последовательности ДНК. Для методов, позволяющих детектировать один или несколько нуклеотидов в определенной позиции, используют термин - минисеквени-рование.
1J.1 Секвенирование при синтезе
В первой группе методов определение нуклеотидной последовательности происходит в результате синтеза ДНК. В настоящее время существует несколько таких подходов.
1.3.1.1. Секвенирование по Сэнгеру
Наиболее часто используемым в настоящее время методом секвенирования протяженных полинуклеотидов является секвенирование по Сэнгеру [102]. Суть метода заключается в получении статистического набора продуктов при терминации дидезок-синуклеотидами синтеза растущей цепи ДНК в ходе полимеразной реакции на матрице анализируемого фрагмента ДНК. Нуклеотидная последовательность восстанавливается в результате анализа полученных продуктов терминации.
С момента реализации Сэнгером этого метода, его эволюция шла в направлении развития подходов разделения полученных фрагментов ДНК и улучшения способов их детекции.
В первоначальном варианте разделение набора фрагментов проводилось электрофорезом в денатурирующем ПААГ (Рис. 18А). Для этого проводили четыре параллельные реакции, в каждой из которых присутствовала исследуемая матричная ДНК,
З'
5'
Полимераза
+
dNTP
З'
5"
ddGTP ddATP ddTTP ddCTP
(665) Primer + С
ddGTP ddATP ddTTP ddCTP
I I I I
ddGTP ddATP ddTTP ddCTP
(285) С
AATGCT ATAATTCAA
(311) A
(312) n,5>
A G (3M G
m/z -
B. MALDI-TOF
А. гель-электрофорез Б. автоматический секвенатор
Рис. 18. Методы детекции при секвенировании по Сэнгеру.
праймер, ДНК-полимераза и дезоксинуклеозидтрифосфаты - dATP, dTTP, dGTP, dCTP, один из которых был радиоактивно мечен. В каждую из четырех реакционных смесей добавляли один из дидезоксинуклеозидтрифосфатов, статистическое встраивание которого в растущую цепь вело к её терминации. В результате получали четыре набора продуктов полимеразной реакции, каждый из которых содержал меченые ДНК-фрагменты разной длины и со строго детерминированной "буквой" на конце. После одновременного электрофоретического разделения таких смесей (на соседних дорожках) и радиоавтографии могла быть определена последовательность нуклеотидов в ДНК, так как длина каждого фрагмента соответствовала номеру нуклеотида, а дорожка, в которой он находится, его типу.
Автоматизация метода позволила выйти на принципиально новый уровень сек-венирования [103]. Это стало возможно благодаря применению сразу нескольких технологий. Во-первых, с началом применения термостабильных полимераз упростилось проведение самой реакции элонгации. Во вторых, использование флуоресцентных меток: четырех флуорофоров, каждый из которых присоединен к одному определенному дидезоксинуклеотиду, вследствие чего отпадает необходимость вести четыре параллельные реакции. И, в третьих, разделение реакционной смеси проходит при проведении электрофореза в капилляре с линейным полиакриламидом, с детекцией флуорес-
циирующих продуктов реакции, возбужденных с помощью лазера. По очередности флуоресцентных сигналов, каждому из которых соответствует нуклеотид, выстраивается последовательность ДНК. (Рис. 18Б) Длина "читаемой" последовательности, как правило, варьирует между 500 и 1000 нт. Ограничения по длине являются следствием того, что синтез вновь растущей цепи ДНК вдет в направлении 5'-3' и обрьш роста цепи чаще происходит на ранних этапах, что приводит к падению интенсивности сигнала при увеличении фрагментов разной длины.
Меченые флуорофорами дидезокситрифосфаты могут использоваться и для ми-нисеквенирования. Примером может служить работа [8], в которой специфический, меченный флуорофором олигонуклеотидный праймер выбран так, что в непосредственной близости от 3'-концевого участка его связывания находится полиморфный нуклеотид. Интересующая "буква" в анализируемой ДНК может быть установлена по типу встроенного полимеразой флуоресцентно меченного дидезоксинуклеотида. В результате проведения температурных циклов (денатурация, отжиг и элонгация) происходит накопление конечного зонда (удлиненного на один нуклеотид праймера). Детекция встроившегося дидезоксинуклеотида осуществляется по излучаемому свету определенной длины волны, возникающей в результате переноса энергии между флуорофорами зонда.
Использование электрофоретического разделения в геле при секвенированию по Сэнгеру имеет ряд ограничений. Для некоторых анализируемых последовательностей наблюдается сжатие сигнала в результате наличия или специфических мотивов, или палиндромов, которые приводят к образованию шпилек [104, 105]. Также стоит отметить, что первые 10-20 нуклеотидов как правило невозможно идентифицировать в следствии высокого уровня сигнала.
Альтернативным подходом, позволяющим разделять продукты терминирования для секвенирования, является MALDI-TOF MS (Matrix-assisted laser desorp-tion/ionization time-of-flight mass spectrometry) [106]. Суть подхода заключается в том, что ДНК-фрагменты, смешанные с матрицей после кристаллизации на подложке ионизуются под действием лазера и разделяются в электрическом поле, исходя из соотношения массы к заряду. По времени пролета молекулы до детектора высчитывается её молекулярная масса (Рис. 18В).
По сравнению с электрофоретическим разделением ДНК-фрагментов MALDI-TOF MS обладает теоретической разрешающей способность 1 Дальтон. При масс-спектрометрическом анализе уменьшается время необходимое для получения результа-
31 та. Также можно отметить отсутствие необходимости использования при секвенирова-нии флуоресцентно меченных дидезоксинуклеотидов, т.к. происходит детекция непосредственно молекулярных масс набора НК-фрагментов.
С другой стороны длина "читаемой" последовательности при MALDI-TOF MS анализе обычно не превышает 100 нт. Одной из проблем данного метода можно считать возникновение ложных пиков из-за присутствия в реакционной смеси продуктов, образующихся в результате обрыва роста цепи или при встраивании не терминирующего нуклеотида, а обычного. Также возможно появление неспецифических продуктов в результате димеризации праймеров. Одним из решений этих проблем является использование меченых биотином дидезоксинуклеотидов. После инкубирования реакционной смеси с иммобилизованным на подложке стрептавидином, на последней остаются только те ДНК-фрагменты, синтез которых оборвался при включении биотинилирован-ных дидезоксинуклеотид трифосфатов [107].
1.3.1.2. Секвенирование при полимеризации (Sequencing by synthesis)
К следующей группе относятся методы секвенирования, также использующие полимеризацию, но детекция происходит непосредственно при встраивании нуклеотида в растущую цепь.
1) Пиросеквенирование
Впервые методология пиросеквенирования была реализована в 1988 г. Hyman E.D. [108]. К настоящему времени метод уже позволяет в реальном времени определять какой нуклеотид встраивается при полимеразнои реакции в растущую цепь (Рис. 19А) [109]. К одноцепочечному амплифицированному фрагменту после гибридизации с праймером в присутствии фрагмента Кленова последовательно добавляют по одному нуклеотиду. В том случае, если нуклеозидтрифосфат не встроился, фермент апираза расщепляет его до нуклеозиддифосфата. Элонгация цепи на одно звено сопровождается выделением пирофосфата, который сульфурилазой переносится на аденозин 5'-фосфосульфат (ASP) с образованием АТР. В результате АТР-зависимого перехода люциферина в оксилюцеферин происходит излучение света. По сопоставлению интенсивности сигнала с типом добавленного нуклеотида выстраивается последовательность ДНК.
геномная ДНК
ентация
І фрагм
-\
ДНК фрагменты
\
иммобилизация
на микрочастица
С^=
создание эммульсии
каждая микрочастица с
^^ \ одним фрагментом ДНК
пираза
dNTP
>. dNDP + фосфат
нуклеотидная последовательность
G С - A GG СС Т
добавляемые нуклеотиды
ІПЦР в эммульсии
денатурация, перенос микрочастиц в эммульсии в яейки
пиросеквенирование
оптоволоконный слайд
Рис. 19. Пиросеквенирование: (А) основные стадии подхода и (Б) метод параллельного пиросек-венирования.
Одним из примеров использования данного метода является секвенирование эк-
зонов гена р53 [ПО]. С помощью пиросеквенирования также можно анализировать од-нонуклеотидный полиморфизм на амплифицированном фрагменте (минипиросеквени-рование) [111]. Все методы минисеквенирования в растворе требуют отделения ампли-кона от праймеров, так как последние могут служить затравками наряду со специфическими зондами, что может приводить к появлению неспецифического сигнала.
Не смотря на относительную простоту пиросеквенирования, подход имеет ряд ограничений. Например, "читаемая" последовательность обычно не превышает 100 нт. Второй проблемой является секвенирование гомоповторов, превышающих 5 нуклеоти-дов, т.к. добавляется ограниченная концентрация dNTP для исключения возможности ошибочного встраивания нуклеотида.
33 Одним из активно развивающихся направлений в настоящее время это создание систем параллельного секвенирования, которые позволяют резко увеличить скорость чтения нуклеотидной последовательности и снизить стоимость процесса. Компания 454 Life Science разработала систему на основе пиросеквенирования, которая позволяет за 4 часа прочитывать до 25000000 нт. с точностью 99% [112], что фактически соответствует масштабам прокариотического генома.
На Рис. 19Б приведена схема параллельного пиросеквенирования. К ДНК-фрагментам, полученным в результате случайной фрагментации геномной ДНК, присоединяют адаптерные последовательности и иммобилизуют на микрочастицы, так, чтобы к каждой был присоединен один ДНК-фрагмент. Раствор переводят в эмульсию и создают вокруг каждой микрочастицы изолирующий липидный слой, который позволяет при проведении ПЦР амплифицировать на частице только один тип фрагмента, вторую цепь которого в конце удаляют при денатурации. Далее каждая из частиц помещается в одну из 1.6 миллионов ячеек, расположенных в оптоволоконном слайде. Через слайд пропускают по очереди каждую из четырех букв, детектируя испускание света в тех ячейках, где произошло встраивание. Из полученных сигналов с каждой ячейки с помощью программного обеспечения выстраивается нуклеотидная последовательность в среднем длиной около ПО нт. 40 кратное перекрывание по каждой позиции позволяет с одной стороны резко повысить точность секвенирования, а с другой провести полную реконструкцию генома [112].
2) Секвенирование в геле
Метод состоит из двух частей (Рис. 20): первая - это получение в геле индивидуальных колоний ДНК-фрагментов (polony = PCR colony) [113], а вторая их непосредственное секвенирование FISSEQ (Fluorescent In Situ Sequential Quantitation) [114].
В начале с помощью SELEX создается библиотека одноцепочечных фрагментов ДНК, в которых анализируемая неизвестная последовательность фланкирована двумя константными регионами. Далее происходит амплификация библиотеки с помощью ПЦР в полиакриламидном геле, который нанесен на покровное стекло. В результате копийность изолированных друг от друга ДНК-фрагментов увеличивается, и образуются их отдельные колонии. Один из праймеров, содержащихся в геле, ковалентно иммобилизован за 5'-конец, что позволяет амплифицированному ДНК-фрагменту оставаться в геле при отмывках.
AT-SS-Cy5
POLONY амплификация
//V^_
неизвестная последовательность
праймер 1
праймер 2
!
ДНК фрагменты акриламидный гель праймеры, Taq рої, ПЦР буфер
FISSEQ
G А Т
ПЦР амплификация в геле
G А Т
Cy5-SS-CG А Т
dATP-SS-Cy5
dTTP-SS-Cy5
После получения колоний ДНК-фрагментов в гель добавляется универсальный праймер, с которого идет полимеризация. Нуклеозид трифосфаты, меченные флуорофорами, по очереди добавляют в гель. В случае встраивания нуклеотида, после отмывок регистрируют сигнал от колонии сканирующим флуоресцентным микроскопом. Флуоресцентная метка присоединена к нуклеотиду через лабильный линкер (дисульфидный мостик), что позволяет удалить её после считывания сигнала и начать новый цикл, встраивая следующую "букву".
Авторам удалось достигнуть 99.8% эффективности встраивания нуклеотида. Среди ограничений данного подхода стоит отметить небольшую длину (34 нт.) читаемой без ошибок последовательности и вероятность неоднократного встраивания буквы при гомоповторах.
3) Секвенирование на чипе
Еще один подход, основанный на определение первичной последовательности в процессе встраивания нуклеотидов в растущую цепь, реализован на стеклянной поверхности (Рис. 21) [ 115].
Использование в ПЦР праймера, несущего азидную группировку, позволяет иммобилизовать полученный ДНК-фрагмент на стеклянную поверхность чипа. После отмывок щелочью на чипе остается только одна из цепей фрагмента, к которой
Рис. 20. Секвенирование в геле (POLONY и FISSEQ).
35 с помощью ДНК-лигазы присоединяют праймер, образующий шпильку. После таких предварительных процедур пробоподготовки ДНК-матриц на поверхность добавляют один меченный флуорофором нуклеозидтрифосфат и термостабильную ДНК-полимеразу. Нуклеотид в случае комплементарности встраивается ферментом в цепь ДНК, а в точках, содержащих соответствующие матрицы, после отмывок регистрируют при возбуждении его флуоресценцию. Флуорофоры присоединены по С5 положению в случае пиримидинов и по N7 положению у пуринов через фотолабильный линкер, что позволяет при облучении лазером (355 нм) их удалять. Таким образом, после встраивания нуклеотида и считывания сигнала флуорофор удаляют, и цикл встраивания начинается заново. Данным способом авторам удалось прочитать матричную цепь длиной 12 нуклеотидов.
Стоит отметить, что в представленной группе методов секвенирования, основанных на детекции при синтезе, на настоящий момент только технология пиросекве-нирования уже используется в широкой исследовательской практике.
N,
Flu-NTP
ligase
NaOH
Flu~N-
scan
*-
laser 355 Nm
FIu~NTP
N-
Рис. 21. Секвенирование на стеклянной поверхности.
36 1.3.2. Секвенирование при расщеплении
В этой части представлены методы секвенирования, которые основаны на расщепление анализируемой молекулы ДНК.
1.3.2.1. Химическое расщепление
Основным примером определения нуклеотидной последовательности путем сайт-специфического химического расщепления может служить секвенирование по Максаму-Гилберту [116]. В основе метода лежит использование 4 типов реакций химической модификации ДНК с дальнейшей расщеплением цепи по модифицированным нуклеотидам. Условия химических реакции подбирают так, чтобы расщепление ДНК проходило равномерно по длине. Для модификации пуринов (метилирование) было предложено использовать диметилсульфат. В зависимости от последующей обработки расщепление происходит либо по А (фосфатный буфер рН 7.0, далее NaOH), либо по A+G (инкубация с НС1). Для модификации пиримидинов С+Т применяется гидразин, использование же гидразина в присутствии 1М NaCl приводит к реакции только с С.
Методы, основанные на использовании ДНК-полимераз
Пиримидиновые основания С или Т в мисматчах могут быть специфически модифицированы гидроксиламином (NHiOH) и тетраоксидом осмия (OsO, ) соответственно. А при последующей обработке пиперидином происходит расщепление таких сайтов ДНК. По длине получаемых фрагментов судят о местонахождении мутации. В том случае, если мисматчи в гетеродуплексе не содержат Т или С, всегда существует возможность проанализировать гетеродуплекс, образуемый второй комплементарной цепью анализируемого фрагмента. В этом случае мисматч уже будет содержать детектируемое пиримидиновое основание. Изначально в подходе применялись радиоактивно меченые ДНК-фрагменты, разделяемые гель-электрофорезом [81]; более удачным вариантом, на настоящий момент, можно считать использование флуоресцентного мече-ния и разделение фрагментов как обычным [82], так и капиллярным электрофорезом [83].
Явным преимуществом данного метода является возможность выявления всех типов мисматчей, а недостатком высокая токсичность ДНК-модифицирующих агентов, Существуют и другие подходы, например, основанные на использовании вместо Os04 перманганата калия (КМпО. ) в присутствии тетраалкиламмонийных солей. Этот реагент в присутствии этих солей в основном модифицирует остаток тимидина в составе несовершенных пар оснований [84,85]. В данных методах для детекции мисматчей в гетеродуплексах используются два типа белков - мисматч связывающиеся и мисматч расщепяющие (эндонуклеазы). 1) Детекция мутаций с участием белков системы репарации: Подход использует уникальное свойство некоторых белков системы репарации образовывать комплексы с участками ДНК, содержащими мисматчи, причем некоторые из них проявляют при этом эндонуклеазную активность. Примером могут служить белки системы мисматч-репарации E.coli (MutS, MutL и MutH). Белок MutS способен узнавать в структуре дуплекса мисматчи (кроме CIC), 1-4-х нуклеотидные вставки, делеции и образовывать прочный комплекс с таким районом ДНК. Это свойство было использовано для выявления гетеродуплексов за счет обработать 3 -5 экзонуклеазой (Рис. 16). Результатом ферментативного гидролиза будет образование двух одноцепочечных фрагментов ДНК, комплементарных друг к другу с 3 концов (этот дуплекс - участок связывания MutS). Если полученные фрагменты мечены, то при сопоставлении их длины (после разделении в геле) можно локализовать участок ДНК, содержащий мутацию [88]. Остальные белки мисматч-репарационной системы MutL и MutH также применяются для детекции мутации [89, 90]. С комплексом MutS-мисматч связывается MutL, далее этот комплекс, в присутствии АТР, активирует латентную эндонуклеазу MutH. Последняя вносит разрыв в ДНК, причем по сайту GATC ближайшему к мутации. При этом мисматч и сайт рестрикции могут быть разнесены более чем на 1000 н.п. Ограничения метода заключаются в том, что длина амплифицируемого фрагмента в среднем должна быть не меньше 300 н.п. для того, чтобы с высокой вероятностью в нем присутствовал сайт GATC. Результаты такого анализа не позволяют судить о том, где находится мутация, а свидетельствует лишь о её наличии. Ещё одним примером применения белков, участвующих в репарационных процессах, для поиска мутаций является использование ДНК-гликозилазы E.coli - MutY. Этот фермент выщепляет аденин из пар G/A и С/А (из последней пары с меньшей эффективностью), при этом образуется апуриновый сайт [91]. Образование такого сайта, в результате активности ДНК-гликозилазы, регистрируется за счет взаимодействия био-тинилированного гидроксиламина с остатком дезоксирибозы в составе АР-сайта. Полученная таким образом биотинилированная ДНК может быть отделена, например, с помощью покрытых стрептавидином магнитных шариков [92, 93]. Ограниченность ис 27 пользования ДНК-гликозилаз связана с небольшим количеством типов мисматчей, выявляемых данными ферментами. 2) Рибонуклеаза А: Субстратами для РНКазы А являются пиримидиновые основания, расположенные в одноцепочечных участках РНК в гетеродуплексах ДНК/РНК [94] и РНК/РНК [95]. Метод мало используется, т.к. позволяет выявлять только порядка 30-40% точечных мутации, РНКаза А имеет сиквенс-специфичность (расщепление подвергается главным образом сайт Ру-А [96]). 3) ДНК-эндонуклеазы (Рис. 17): - эндонуклеаза VII бактериофага Т4 [97,9$] и эндонуклеаза I бактериофага Т7 [99]. Их также называют "резолвазы", эти ферменты участвуют в таких процессах как разрешение перекреста Холидея, репликация и упаковка фаговой ДНК. Данные эндонук-леазы также способны узнавать мисматч в ДНК и вносить разрывы с 5 -сторон от него (это относится и ко всем следующим эндонуклеазам). - S1 нуклеаза из Aspergillus oryzae в настоящее время практически не используется для детекции из-за невысокой специфичности. Оптимум работы S1 нуклеазы находится в области рН 4.2, а это приводит к частичной денатурации дуплекса (А/Т участков), т.е. образованию одноцепочечных участков, которые и являются субстратом для фермента [100]. - CEL I нуклеаза (растительного происхождения) оказалась в этом плане более удобной, потому что её оптимум работы находится в нейтральном рН, что снижает неспецифическое расщепление гетеродуплекса [101]. Наиболее полным и прямым методом определения полиморфизма генетического материала является секвенирование de novo. Методы определения нуклеотидной последовательности условно можно поделить на три группы. К первой группе относятся методы, основанные на определение сиквенса при или в результате синтеза ДНК, ко вторым - методы,, в основе которых лежит расщепление анализируемой молекулы биополимера. В ряде случаев в исчерпывающем секвенировании нет необходимости, поскольку известен изменяемый участок генома, и вопрос сводится к установлению первичной структуры лишь определенного сайта. При однонуклеотидном полиморфизме (SNP -Single Nucleotide Polymorphism), достаточно лишь определить какой из двух нуклеоти-дов, соответствующих определенному аллелю гена, находится в анализируемом положении в последовательности ДНК. Для методов, позволяющих детектировать один или несколько нуклеотидов в определенной позиции, используют термин - минисеквени-рование.
Методы детекции, основанные на использование мисматч узнающих белков
Одним из подходов к выявлению точечных замен в генетическом материале является метод ферментативного лигирования олигонуклеотидов. В основе метода лежит способность ДНК-лигазы дискриминировать несовершенные пары оснований (мисмат-чи) в составе комплекса анализируемой ДНК с литеруемым тандемом олигонуклеотидов.
Разработка тест-системы на основе метода лигирования олигонуклеотидов требует проведения предварительных экспериментов, связанных с подбором зондов, выбором относительного расположения мисматча, условий проведения реакции и др. Наличие систематизированной информации, характеризующей селективность ДНК-лигазы при дискриминации различных мисматчей, позволит существенно сократить трудозатраты при разработке новых тест-систем для анализа полиморфных сайтов в ДНК. Такая информация будет чрезвычайно важна для понимания фундаментальных принципов белково-нуклеинового распознавания, поскольку ДНК-лигазы являются участниками таких внутриклеточных процессов как репликация, репарация и рекомбинация.
Одним из способов повышения селективности метода лигирования олигонуклеотидов является использование этапа гибридизации зонда с анализируемой ДНК-матрицей. Разработка математического аппарата для оценки селективности гибридизации зонда при выявлении точечной замены позволит перейти с качественного уровня описания на количественный, что может быть использовано не только в методе лигирования, но и в других подходах, использующих гибридизацию.
Реализация подхода к анализу точечных мутаций в ДНК, основанного на лиги-ровании олигонуклеотидов возможна как в гомофазном, так и в гетерофазном варианте, причем каждый из них имеет свои преимущества и недостатки. Известно, что эффективность гибридизации и ферментативных реакций в растворе выше, чем в гетерофазном варианте [14]. С другой стороны для детекции продукта лигирования в общем случае необходимо удаление избытка меченого зонда из реакционной смеси. При гетерофазном лигировании олигонуклеотидных зондов, один из которых иммобилизован, а второй несет метку, возможно провести разделение с помощью отмывочных процедур [14, 133, 134]. Использование пары репортерных флуоресцентных группировок, изменяющих свои физико-химические свойства в результате комплексообразования соответствующих зондов с ДНК (например, FRET [63, 64]), позволяет детектировать сигнальный продукт в растворе (без разделения), но, как правило, это требует использования дорогостоящего оборудования.
Одной из задач данной работы является разработка нового подхода к детекции точечных мутаций в рамках метода ферментативного лигирования олигонуклеотидов, которой бы сочетал в себе преимущества как гомофазного, так и гетерофазного вариантов проведения реакции. Анализ различных вариантов выявления ДНК привел к созданию принципиального нового подхода к отделению продукта лигирования от меченого зонда после проведения ферментативного лигирования в растворе.
Известно, что с помощью УФ-облучения возможно ковалентно иммобилизовать ДНК на различных носителях, таких, как капрон, нитроцеллюлоза и др. [135]. Также существуют данные о том, что эффективность иммобилизации нуклеиновой кислоты растет с увеличением её длины [135]. В качестве анализируемой матрицы при лигиро-вании, как правило, используют ПЦР-фрагмент, поэтому мы предположили, что при УФ-облучении реакционной смеси, нанесенной на подложку, в основном будет происходить иммобилизация более длинной ДНК-матрицы и в меньшей степени олигонукле-отидных зондов. Проведение отмывок подложки приведет к удалению с её поверхности меченого зонда, комплекс которого с ДНК-матрицей является менее стабильным, чем комплекс матрицы с протяженным продуктом лигирования. Для того чтобы эффективность отделения при отмывках была высокой необходимо, чтобы стабильности комплексов максимально отличались, что равнозначно максимальному отличию в длинах исходного меченого зонда и продукта лигирования. Ранее Пышным Д.В. и соавторами было предложено использование в методе лигирования тандема трех коротких олиго-меров [10, 136, 137], что позволило существенно увеличить селективность метода. Таким образом, лигирование коротких олигонуклеотидов позволило бы увеличить разницу в длинах продукта лигирования и исходного меченого компонента составного зонда. Кроме того, мы учитывали, что одним из требований к современным методам анализа ДНК является использование нерадиоактивных репортерных групп. В нашем случае была использована получившая широкое распространение система колориметрического выявления биотин, конъюгат стрептавидин-щелочная фосфатаза.
Схема нового варианта выявления специфической последовательности ДНК представлена на лее реакционную смесь наносят на капроновую мембрану и подвергают УФ-облучению. Мы предполагали, что при этом, в основном, будет происходить иммобилизация протяженной ДНК-матрицы, которая, удерживает в комплексе продукт лиги-рования. На стадии отмьшки мембраны должно происходить удаление всех коротких олигонуклеотидов, в том числе меченного биотипом, а продукт лигирования должен удерживаться на капроне в результате прочного комплексообразования с иммобилизованной матрицей. Колориметрическое выявление продукта лигирования, несущего биотин, после инкубации с конъюгатом стрептавидин-щелочная фосфатаза, будет происходить после добавления хромогенных субстратов (например, ВСІР и NBT).
Для того чтобы показать возможность выявления ДНК с помощью предложенного метода необходимо было проведения ряда предварительных экспериментов. Первоначально было необходимо получить максимально специфический сигнал при наличии продукта лигирования и минимальный неспецифический сигнал при его отсутствии. Уровень неспецифического сигнала определяется эффективностью иммобилизации короткого биотинилированного олигонуклеотида при УФ-облучении реакционной смеси и зависит от таких параметров как концентрация биотинилированного олигонуклеотида и его нуклеотидный состав. Уровень специфического сигнала зависит как от эффективности иммобилизации ПЦР-фрагмента (т.е. от его концентрации и длины) так и от стабильности комплекса продукта лигирования и ДНК при проведении этапов им тандем олигонуклеотидов биотин мобилизации, отмывок и проявления метки. Уровень выявляемых сигналов, несомненно, будет зависеть от дозы УФ-облучения и от эффективности лигирования тандема.
Эффективность лигирования тандемов олигонуклеотидов на различных ДНК-матрицах
Применение ДНК-лигаз в ДНК-диагностиках, связано со способностью этих ферментов дискриминировать наличие мисматча в точке лигирования. В нашей лаборатории (неопубликованные данные) для ряда комплексов, содержащих одиночный мис-матч в нике, при дотировании было показано, что константы Михаэлиса мало отличаются от соответствующих констант для комплементарных комплексов (10 8 - 10 7, но при этом происходит снижение максимальной скорости лигирования. Также была исследована кинетика лигирования комплексов, содержащих мисматч, и было показано, что выходы лигирования, за используемые нами времена, находятся на линейных участках. Всё это позволило использовать те же самые рассуждения при лигировании комплексов, содержащих мисматч, что и при лигировании комплементарных комплексов.
Было исследовано лигарование всех 96 комплексов, содержащих одиночный мисматч в нике, т.е. 48 комплексов, имеющих несовершенную пару в структуре "ОН"-и "Р"-компонентов субстрата ("ОН"- и "Р"-мисматчи соответственно). Как известно из литературных данных, ДНК-лигаза с большей эффективностью дискриминирует наличие "ОН"-мисматча, чем "Р". Аналогичные результаты были получены нами, но это приводит к невозможности сравнения эффективностей лигирования несовершенных комплексов, содержащих "ОН"- и "Р"-мисматчи в одних условиях. Комплексы с "Р"-мисматчами лигировали как и комплементарные в течение 10 мин, в то время как для комплексов с "ОН"-мисматчами время лигирования было увеличено до 30 мин, а концентрации фермента в 5 раз. На Рис. 47 приведены результаты лигирования различных комплексов матриц mTG и mAG в течение 30 мин при повьппенной концентрации Т4 ДНК-лигазы. В этих условиях значения выходов реакции лигирования комплементарных и несовершенных комплексов ("Р"-мисматчи) были близки к предельным (плато) значениям, в то время как лигарование комплексов с "ОН"-мисматчами происходило с намного меньшей эффективностью, что позволило сравнивать их между собой.
Для оценки селективности ДНК-лигазы по отношению к тому или иному мис-матчу обычно используют такой параметр как фактор дискриминации, который является отношением выхода продуктов лигирования в составе комплементарного комплекса к выходу продуктов лигирования комплекса, содержащего мисматч. Стоит отметить, что в нашем случае это параметр фактически представляет собой соотношение скоростей лигирования полностью комплементарного и несовершенного комплекса. Таким образом, в результате сравнительного анализа эффективностей лигирования 96 несовершенных комплексов для каждого типа мисматча был получен соответствующий фактор дискриминации (Таблица 8). В среднем "ОН"-мисматчи дискриминируются в 23 раза лучше, чем "Р"-мисматчи. В некоторых случаях несовершенные комплексы лиги-руются даже лучше, чем соответствующие комплементарные комплексы, например, "Р"-мисматч T/G.
Чтобы получить общую картину эффективности дискриминации различных мисматчей мы проанализировали усредненные факторы дискриминации. На Рис. 48 приведены соответствующие характеристики факторов дискриминации для "ОН"- и "Р"-мисматчей, которые были получены при усреднении четырех значений, соответствующих типу соседней комплементарной пары по нику (например, значение для "Р"-мисматча Т/Т получено при усреднение 3.5, 1.0, 2.6 и 6.8 (Таблица 8). Анализ диаграммы показывает, что между значениями факторов дискриминации "ОН"- и "Р"-мисматчей наблюдается линейная зависимость, которая нарушается только в случае 5 типов "ОН" мисматчей. Это GIG, G/A, A/G, А/А (четыре Pu/Pu) и С/С мисматчи, факторы дискриминации для которых в среднем в 3.5 раза выше. Наличие линейной зависимости между факторами дискриминации было сложно предположить, т.к. "ОН"- и "Р" 95 мисматчи, скорее всего, должны влиять на разные этапы ферментативного катализа. Возможным объяснением всплеска эффективности дискриминации Pu/Pu и С/С "ОН" мисматчей может являться то, что пространственная структура дуплекса с несовершенными парами оснований такого типа наиболее сильно отклоняется от канонической структуры двойной спирали, т.е. комплементарной пары типа Ри/Ру, что и "чувствует" ДНК-лигаза. В общем же мисматчи типа Pu/Pu и гомо Ру/Ру максимально дискриминируются как случае "ОН"-, так и в случае "Р"-мисматчей.
Как уже отмечалось, факторы дискриминации, приведенные на Рис. 48, являются усредненными по четырём возможным соседним комплементарным парам по нику. Необходимо было оценить, вносит ли этот "сосед" вклад в эффективность дискриминации мисматча ферментом. На Рис. 49 представлены коэффициенты, характеризующие изменение средней эффективности дискриминации "ОН"-или "Р"-мисматчей (Рис. 48) при расположении рядом с ним конкретной комплементарной пары. В двуцепочечной ДНК возможны две канонические комплементарные пары, а именно А/Т и G/C, но так как в нашем случае они располагаются в нике, то возможны две ориентации каждой пары. Например, для G/C пары это mG/C (G в матрице, С в зонде) и mC/G (С в матрице, G в зонде). Интересно отметить следующую закономерность: G/C пара в среднем или не изменяет эффективность дискриминации, или увеличивает её примерно в 1.4 раза. При этом наблюдается обратная зависимость для "ОН"- и "Р"-мисматчей, т.е. если mC/G не влияет на дискриминацию "Р"-мисматча и увеличивает её для "ОН"-мисматча, то mG/C оказывает обратное влияние. С другой стороны, А/Т пара не изменяет эффективность дискриминации или уменьшает её примерно в 1.7 раз. При этом наблюдается картина аналогичная для G/C пары, когда тА/Т не влияет на дискриминацию "ОН"-мисматча при уменьшении дискриминации "Р"- мисматча, а тТ/А наоборот не влияет на дискриминацию "Р"-мисматч при уменьшении дискриминации "ОН"-мисматча. Все это свидетельствует о том, что на эффективность дискриминации одиночного мисматча существенное влияние может оказывать соседняя по нику комплементарная пара. Также следует обратить внимание на то, что отклонение от среднего для разных "соседей" отличается и показывает, что в зависимости от конкретного типа мисматча значение коэффициента может существенно меняться.
Проведенные исследования показали, что эффективность дискрими-нации мисматча ДНК-лигазой фага Т4 существенно зависит от нуклеотидного состава в одноце-почечном разрыве. Полученные результаты были использованы для формирования базы данных факторов дискриминации мисматчей, которая может быть использована при выборе зондов для метода лигирования олигонуклеотидов. Это позволяет выбрать наиболее выгодные структуры совершенного и несовершенного ников, обеспечивающие максимально возможный фактор дискриминации при лигировании. Для выбора длины олигонуклеотидов и концентрационных условий, в которых бы наблюдалась наибольшая селективность при гибридизации, необходимо использовать результаты, полученные в разделе 3.2. Таким образом, получены все данные, необходимые для создания программного обеспечения, производящего выбор тандемов олигонуклеотидов, которые бы обеспечивали максимальную селективность при их использовании в качестве зондов при анализе полиморфных сайтов в ДНК методом лигирования олигонуклеотидов.
Изменение селективности при варьировании структуры зонда
Как уже говорилось выше, селективность метода дотирования олигонуклеотидов зависит от особенностей протекания двух основных этапов - этапа гибридизации, т.е. образования субстратного ДНК-комплекса, и этапа ферментативного образования фос-фодиэфирной связи. Поэтому наибольшей дискриминационной способностью будет обладать тот тандем олигонуклеотидов, для которого будет обеспечена наибольшая селективность, как на уровне гибридизации, так и на уровне лигирования.
Выбор структуры высокоселективных олигонуклеотидных зондов, является многопараметрической задачей и требует строгого согласования экспериментальных ограничений и гибридизационных свойств олигонуклеотидных зондов, определяющих их поведение в системе. Решение задач такого рода весьма затруднено в отсутствие программного обеспечения, позволяющего провести исчерпывающий анализ особенностей тестируемой последовательности ДНК и получить количественные характеристики выбираемых зондов, основанные на четких критериях.
В ходе выполнения работы был разработан алгоритм выбора структуры тандемов олигонуклеотидов, который был реализован в Microsoft Office Excel с помощью Visual Basic for Application. Программа позволяет производить расчет термодинамических характеристик различных вариантов тандемов, соответствующих анализируемому образцу ДНК, и отбирать те из них, которые обладают высокими значениями селективности гибридизации (анализ функции селективности ) для заданных концентрационных и температурных условий. Далее для выбранных тандемов можно рассчитать величины факторов дискриминации лигирования, соответствующее отношению скоростей ферментативного лигирования в составе комплементарных комплексов и комплексов, содержащих мисматч.
Производимые с помощью программы количественные оценки выполняются с использованием сформированной базы данных, включающей, во-первых, термодинамические характеристики формирования отдельных элементов структуры совершенных и несовершенных тандемных комплексов [144, 175, 176] и, во-вторых, накопленную нами систематическую информацию о субстратных характеристиках совершенных и несовершенных тандемных комплексах в реакции ферментативного лигирования Т4 ДНК-лигазой (Таблица 8).
На Рис. 50 приведена блок-схема алгоритма выбора двухкомпонентного тандема олигонуклеотидов. Исходными данными, являются последовательности нормальной и мутантной матрицы, их концентрации, концентрации компонентов тандема - зонда, в сайте связывания которого располагается предполагаемая замена, и эффектора, оли-гонуклеотида с повышенной относительно зонда гибридизационной способностью. Также необходима информация о возможном диапазоне температур гибридизации и о минимально допустимых степенях ассоциации зонда и эффектора с матрицей.
Рассмотрим более подробно этапы работы программы при выборе двухкомпо-нентного тандема олигонуклеотидов. Первоначально анализируется тандем, который комплементарен "нормальной" матрице, но образует несовершенный комплекс, содержащий мисматч в З -положении ника, с "мутантной" матрицей, при этом длина компонентов тандема берется равной четырем нуклеотидам. Компоненты тандема при этом осуществляют различные функции, если один должен обеспечивать селективность при связывании с матрицей, то второй (эффектор) используется только для формирования ника в случае посадки первого. Поэтому степень ассоциации первого зонда с комплементарной матрицей в идеале должна быть близка к 0.5, т.к. максимум селективности, наблюдается при температуре близкой к температуре плавления. При этом степень ассоциации для эффектора должна быть достаточно высокой, чтобы обеспечить высокую эффективность связывания с анализируемым сайтом на матрице ДНК (например, степень ассоциации соответствующего сайта матрицы 0.9).
На следующем этапе происходит удлинение эффектора, причем оно продолжается до тех пор, пока степень его ассоциации не превысит 0.9 при заданной концентрации и температурном режиме. Для этого программа производит расчет термодинамических параметров дЯид5 для комплекса эффектора с матрицей, используя параметры SantaLucia J. для модели ближайших соседей [127] и параметры, полученные Пышным Д.В. и соавторами, для комплементарного стэкинга [39]. Зная эти параметры и температуру гибридизации, можно найти энергию Гиббса, с использованием которой рассчитывается равновесная константа ассоциации. После этого, используя концентрации эффектора и матрицы, можно найти искомую степень ассоциации. В том случае, если её значение оказывается недостаточно высоким, цикл повторяется.
Удлинение олигонуклеотидного зонда, отвечающего за селективность, происходит примерно по той же схеме, но с некоторыми отличиями. Расчет термодинамических параметров ведется для двух комплексов, комплементарного и несовершенного. Для последнего используются полученные Пышным Д.В. термодинамические параметры, характеризующие эффективность коаксиального стэкинга пар оснований в точке одноцепочечного разрыва ДНК при наличии всех возможных одиночный мисматчей (данные неопубликованы). Увеличение длины олигонуклеотида происходит до тех пор, пока степень ассоциации его комплекса с комплементарной матрицей не превысит заданный уровень (например, 0.5). После этого происходит выбор концентрации зонда и температуры гибридизации для заданных ранее граничных условий, при которых бы наблюдался максимум функции селективности гибридизации. Поиск оптимальной температуры и концентрации осуществляется с помощью метода Нелдера-Мида [177].
