Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА1 CLASS . Обзор литературы CLASS 10
1.1 Внутренние стандарты 10
1.1.1 Амплификационные методы определения вирусных нуклеиновых кислот 10
1.1.2 Количественное определение нуклеиновых кислот 10
1.1.3 Метод лимитирующих разведений 11
] .1.4 Конкурентная ПЦР 12
1.1.5 Real-time ПЦР 13
1.1.6 Внутренние стандарты 15
1.1.7 Свободные РНК и ДНК-стандарты 16
1.1.8 Биологические стандарты 17
1.1.9 Генноинженерные стандарты 18
1.1.10 Армированные РНК-стандарты 18
1.1.11 Стандарты для мутационного анализа 21
1.1.12 Скрининг продуктов крови 21
1.1.13 Стандарты для множественных методов 22
1.2 Ретровирусы 22
1.2.1 Структура генома и жизненный цикл ретровирусов группы MuLV 23
1.2.2 Принципы конструирования ретровирусных векторов 25
1.2.3 Упаковывающие клетки 27
1.3 Природа вируса гепатита С 30
1.3.1 Организация генома HCV.. 30
1.3.2 Вариабельность генома HCV и его генотипы 32
1.3.3 Клиническое значение генотипов НСV 33
1.3.4 Вакцина против НСV 36
1.3.5 Вирусная репликация 37
1.3.6 Решшкационный цикл 38
1.3.7 Динамика репликации 39
1.3.8 Определение РНК НС V при остром и хроническом гепатите С.. 40
1.3.9 Мониторинг уровня РНК HCV в течение терапии 42
ГЛАВА 2. Материалы и методы 47
2.1 Образцы сывороток 47
2.2 Определение РНК HCV в сыворотке крови 47
2.3 Выделение РНК HCV из сыворотки крови 47
2.4 Обратная транскрипция и «nestecb-ПЦР 48
2.5 Детекция продуктов амплификации 48
2.6 Праймеры 49
2.7 Конструирование внутреннего стандарта 49
2.8 Получение пакующей клеточной линии 56
2.9 Использование внутреннего стандарта для качественного определения и генотипирования РНК HCV 59
2.10 Использование внутреннего стандарта для количественного определения РНК HCV 59
2.11 Использование внутреннего стандарта в экспериментах с разведенными сыворотками 60
ГЛАВА 3. Результаты 61
3.1 Конструирование внутреннего стандарта 61
3.2 Получение пакующей линии клеток 62
3.3 Определение титра ретровирусных частиц 63
3.4 Чувствительность метода 63
3.5 Использование внутреннего стандарта при качественном определении и генотипировании РНК HCV 64
3.6 Использование внутреннего стандарта для количественного определения РНК HCV 65
3.7 Статистическая обработка количественных измерений 68
3.8 Анализ динамики вирусной концентрации на примере разведенных сывороток 70
ГЛАВА 4. Обсуждение 73
4.1 Преимущества внутреннего стандарта на основе ретровирусного вектора 73
4.2 Сравнение эффективности амплификации двух матриц разного размера 76
4.3 Полуколичественное определение 78
4.4 Использование внутреннего стандарта для сывороток разных генотипов 79
4.5 Использование внутреннего стандарта при качественном и количественном определении PHKHCV 80
Заключение 81
Выводы 82
Список публикаций по теме диссертации 82
Список литературы 84
- Real-time ПЦР
- Определение РНК НС V при остром и хроническом гепатите С..
- Использование внутреннего стандарта для качественного определения и генотипирования РНК HCV
- Использование внутреннего стандарта при качественном определении и генотипировании РНК HCV
Введение к работе
В последние годы одним из основных методов молекулярной диагностики вирусных инфекций стала полимеразная цепная реакция. Это высокочувствительный и высокоспецифичный метод. Введение внутреннего стандарта, который амплифицируется с теми же праймерами, что и исследуемая мишень, делает реакцию амплификации конкурентной, позволяя проводить количественные оценки концентрации исследуемой мишени по известной концентрации внутреннего стандарта. Кроме того, внутренний стандарт играет роль контроля прохождения реакции в отдельной пробирке.
Широкое распространение конкурентная ОТ-ПЦР с использованием внутреннего стандарта получила при анализе экспрессии генов и при диагностике вирусных инфекций-
Особые проблемы возникают при разработке РНК-внутренних стандартов. Во-первых, в отличие от ДНК молекулы РНК нестабильны, легко подвергаются рибонуклеазному расщеплению. Упаковка РНК в белковую оболочку позволяет решить эту проблему. Кроме того, упакованная РНК, в отличие от свободной, имитирует по строению исследуемый вирус, что позволяет контролировать все стадии процесса выделения РНК и ОТ-ПЦР. Во-вторых, существует проблема подсчета концентрации внутреннего стандарта. Еще не предложено внутреннего РНК- стандарта, для которого эти проблемы были бы решены в полной мере, и который удовлетворял бы всем теоретическим требованиям. В связи с этим, предлагаемый в работе новый тип внутреннего РНК-стандарта - на основе ретровирусного вектора - является весьма актуальным.
Нами разработан внутренний РНК-стандарт на основе ретровирусного вектора для определения вируса гепатита С. Это рекомбинантный ретровирус, содержащий модифицированную последовательность РНК HCV, используемую для амплификации в ПНР, и селективный маркер — ген устойчивости к ггуромицину. Наличие последнего позволяет определять титр ретровирусных частиц стандарта в экспериментах по инфицированию клеточных культур. Предлагаемый ретровирусный стандарт получают из культуры пакующих клеток, просто собирая среду культивирования, в которой росли клетки.
Особое значение ПЦР-диагностика HCV имеет для скрининга донорской крови и ее компонентов, которые являются основными источниками вируса для лиц, получающих множественные трансфузии. Введение в диагностические тест-системы внутреннего стандарта позволяет выявлять ложноотрицательные результаты и становится, следовательно, острой необходимостью. Кроме того, введение внутреннего стандарта дает возможность проводить количественные оценки изменения концентрации HCV, что представляет несомненный клинический интерес, так как основными прогностическими факторами интерфероновой терапии являются генотип вируса и динамика изменения концентрации вируса в течение первых недель лечения.
В работе продемонстрировано применение внутреннего стандарта для качественных и количественных определений РНК HCV.
Использование рекомбинантного ретровирусного вектора - это новый подход в получении внутренних стандартов для конкурентной ОТ-ПЦР, а также для нового количественного метода определения нуклеиновых кислот - real-time ПЦР.
ЦЕЛЬ РАБОТЫ.
Разработка РНК-внутреннего стандарта на основе ретровирусного вектора для конкурентной ОТ-ПЦР, который позволяет оценивать количественные изменения концентрации РНК HCV в сыворотке крови больных в ходе терапии и контролировать прохождение реакции в каждой пробирке при качественном определении и генотипировании РНК вируса гепатита С.
ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.
Создание генно-инженерной конструкции, представляющей собой ретровирусный вектор с клонированной в него модифицированной вирусной последовательностью, используемой для амплификации в полимеразной цепной реакции;
получение пакующей линии клеток, культуральныи супернатант которой содержит ретровирусные частицы с модифицированным фрагментом вирусного генома;
использование полученного внутреннего стандарта в качестве контроля прохождения реакции при качественном определении и генотипировании РНК HCV;
применение полученного внутреннего стандарта для количественного определения изменения концентрации РНК HCV.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ. Предложен новый тип внутреннего стандарта для конкурентной ОТ-ПЦР - это РНК-стандарт на основе ретровирусного вектора. Внутренний стандарт разработан для качественного и количественного определения РНК HCV в сыворотке крови больных. Предлагаемый внутренний стандарт представляет собой рекомбинантные ретровирусные частицы в культуральной среде пакующих клеток. Концентрация внутреннего
стандарта измеряется в экспериментах по инфицированию клеток-мишеней.
ЗНАЧЕНИЕ ДЛЯ ТЕОРИИ И ПРАКТИКИ.
Предложенный в работе подход может быть использован при получении внутренних РНК- стандартов для конкурентной ОТ-ПЦР и real-time ПЦР. В ходе исследования получен внутренний РНК- стандарт для конкурентной ПЦР для определения и генотипирования РНК HCV.
ПУБЛИКАЦИИ.
По материалам диссертации опубликованы 6 работ. Материалы диссертации доложены на 3-й Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика в современной медицине» (2000г.Москва), на I Всероссийском съезде гематологов (2002г. Москва), и на научно-практическом симпозиуме «Технологии генодиагностики в практическом здравоохранении (2002г. Москва).
СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ.
Диссертация изложена на 96 страницах, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит 26 рисунков и 4 таблицы. Список цитированной литературы включает 108 наименований.
ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ. Разработан новый тип внутреннего стандарта для конкурентной ОТ-ПЦР - РНК-стандарт на основе ретровирусного вектора. Внутренний стандарт разработан для качественного и количественного определения РНК HCV в сыворотке крови больных.
Real-time ПЦР
Более современный и совершенный амплификационный метод количественного определения концентрации вирусных нуклеиновых кислот - это realime ПЦР - полимеразная цепная реакция в реальном времени. Сущность метода заключается в исследовании накопления продуктов амплификации с помощью специального прибора без последующего электрофореза. Так как кинетика накопления продуктов амплификации связана с исходным количеством матрицы, это дает возможность точно оценить её количество. В этом методе применяется зонд - двойная меченая флуорогенная проба. Проба содержит флюоресцентный репортер на 5 конце и гаситель на 3 конце (рис.1). Использование этой пробы и 5 -3 нуклеазной активности TAQ-полимеразы позволяет измерять количество ПЦР-продукта, определяя количество флуоресцентного репортера, образовавшегося в экспоненциальной фазе ПЦР [Екимов и др., 2002].
Этот метод также предполагает использование внутреннего стандарта. Характерными чертами данного метода, в отличие от классической ПЦР, является возможность количественного определения ДНК/РНК инфекционных агентов в исследуемом материале, отсутствие стадии электрофореза, менее строгие требования к организации ПЦР-лаборатории и автоматическая регистрация и интерпретация полученных результатов. 1.1.6 Внутренние стандарты.
В идеале количественные стандарты должны быть выделены, амплифицированы и определены в той же самой форме и тем же самым способом, что и биологический образец. В отличие от ДНК-стандартов, которые являются стабильными и могут быть добавлены непосредственно в биологический образец, РНК- стандарты чувствительны к присутствию рибонуклеаз и легко деградируют. Чтобы преодолеть трудности, возникающие при работе с РНК-стандартами, для количественных РНК-методов используют ДНК-контроль [Gilliland et al., 1990] или добавляют РНК в лизирующий раствор хаотропного агента [Mulder et at., 1994]. Однако, при этом не контролируются стадии обратной транскрипции и выделения РНК из вирусных частиц.
Идеальный стандарт для ПЦР должен удовлетворять ряду требований [Innis et al., 1999]:
1. Химическая структура та же самая, что и у исследуемых образцов.
2. Предопределенная нуклеотидная последовательность.
3. Точно измерен количественно.
4. Стабилен в клинических образцах (т.е. плазме, цельной крови и т.д.)
5. При центрифугировании и осаждении ведет себя полностью аналогично исследуемому образцу.
6. Позволяет контролировать все стадии процесса.
7. Легко модифицируется для вовлечения новых мутаций и квазивидов.
8. Неинфекционный и недорогой. 1.1.7 Свободные РНК и ДНК-стандарты.
Главное преимущество этого подхода - это относительная легкость получения определенной последовательности с помощью молекулярно-биологических методов (генно-инженерное конструирование, клонирование, сайт-направленный мутагенез и in vitro транскрипция).
На рис. 2 представлен ряд схем конструирования внутреннего стандарта pnnis et al., 1999]. Имея одинаковые с последовательностью дикого типа участки связывания праймеров, они отличаются размерами или гибридизационными характеристиками. Концентрация таких стандартов измеряется спектрофотометрически. Главный недостаток in vitro транскриптов это потенциальное загрязнение рибонуклеазами, которое в результате может привести к количественным изменениям стандарта. Вторая проблема при использовании \п vitro транскриптов состоит в том, что в результате преждевременной терминации или неправильной инициации транскрипции появляется множество фрагментов различающихся длин. Эта гетерогенность обуславливает необходимость введения дополнительных шагов (разделение в геле), в результате которых может произойти контаминация РНК-азами.
Таким образом, стандарты, которые представляют собой свободные нуклеиновые кислоты, не устойчивы к действию нуклеаз (РНК-стандарты) и не позволяют контролировать этап выделения из вирусных частиц. Биологические стандарты (культивируемые вирусы, ДНК-бактериофаги, виремичная плазма) используются как в качественных, так и в количественных ПЦР-методах.
Описан способ измерения количества вирусных нуклеиновых кислот с использованием в качестве внутреннего стандарта инфекционного мутантного вируса, который имеет последовательность-метку в районе генома, используемом для амплификации [Natarajan et aL, 2000]. Разведения мутантного вируса добавляются к равным аликвотам образцов для измерения. Нуклеиновые кислоты выделяются, амплифицируются и определяются количественно. Этот способ позволяет избежать ошибок, возникающих при выделении нуклеиновых кислот.
Главное преимущество биологических стандартов - это контроль всей процедуры обработки образцов, включая выделение матрицы. Главные недостатки — инфекционность, трудности в получении унифицированных партий стандартов, невозможность культивировать некоторые важные патогены (HCV), нарастание генетических различий при пассировании вирусных штаммов.
Генноинжееерные стандарты. Генноинженерные стандарты (рекомбинантные бактериофаги и вирусы животных) комбинируют некоторые преимущества контролей в виде свободных нуклеиновых кислот и биологических стандартов. Примером стандартов этого класса являются армированные РНК -определенные последовательности, защищенные от нуклеазного переваривания в белковую оболочку.
Определение РНК НС V при остром и хроническом гепатите С..
Вирус гепатита С может вызывать острый и хронический гепатит. При остром гепатите РНК HCV определятся в крови почти всех пациентов через 1 -2 недели после инфицирования. Уровень РНК НСV увеличивается быстро в течение нескольких недель, а затем медленнее, достигая в среднем 105-107 Ш/ml [Shimizu et al., 1990; Farci et al., 1991; Major et al., 1999; Thimme et al., 2001].
1 интернациональная единица (IU) - это 1-6 молекул РНК HCV [Saldanha et al., 1999; Pawlotsky, 2000].
Хронический гепатит С диагностируется после определения РНК HCV в крови через 6 месяцев после начала инфекции. Как показывают ретроспективные исследования, у 60-85% HCV-инфицированных пациентов развивается хроническая инфекция [NIH Consensus statement, 2002].
Ранняя фаза хронического гепатита С напоминает острую инфекцию [Hoofiiagle, 2002]. РНК HCV появляется в сыворотке крови в течение 1-2 недель, и ее титр быстро увеличивается [Alter et al., 2000; Gerlach et al., 2001]. В течение хронической инфекции уровень вирусной РНК в крови достигает значений в среднем 105-107 IU/ml, но у некоторых больных он существенно отличается от этих значений. Причем для отдельного больного уровень РНК остается относительно стабильным [NIH Consensus statement, 2002].
К сожалению, не обнаружены какие-либо факты, которые могли бы достоверно предсказывать успешное разрешение острой инфекции или ее переход в хроническую стадию. Уровень РНК HCV в крови - это вариабельная величина [Alter et al.» 1995; Major et al., 1999; Thimme et al., 2001]. Анти-HCV появляются вместе с симптомами или вскоре после них и значительно позже РНК. Обычно, анти-HCV достигают более высоких уровней при хронической инфекции, чем при острой, но эти различия проявляются уже позднее [Takaki A et al., 2000].
Как уже отмечалось выше, в крови инфицированных пациентов вирус присутствует в концентрациях от неопределяемых значений до 109 вирусных геномов в мл. Нет точных данных о том, что эта величина связана с вирусными характеристиками (например, с генотипом) или с какими-то проявлениями заболевания (степенью фиброза или цирроза печени) [Hollingsworth et al., 1996]. И хотя ряд авторов связывает величину концентрации вируса в крови до начала лечения с эффектом терапии, большинством исследователей эта величина рассматривается скорее как индивидуальная характеристика, определяемая генетическими и иммунологическими особенностями пациента. По литературным данным, концентрация вируса в крови инфицированных людей, не получающих интерфероновую терапию, остается постоянной на протяжении всего периода наблюдений. Причем, для 90% пациентов с хроническим гепатитом С эта концентрация находится в пределах от 3x104 до 3x106 IU/ml [Pawlotsky, 2002].
При хронической инфекции у некоторых пациентов бывают периоды, когда РНК HCV не определяется. То есть единичный РНК HCV -отрицательный результат не доказывает завершение инфекции, и необходимы последующие исследования через 6 и 12 месяцев, чтобы решить, завершилась ли полностью инфекция.
Спонтанного завершения после 6 или 12 месяцев инфекции, как правило, не наблюдается. Поэтому, при установленной хронической инфекции повторные тестирования РНК HCV имеют значение только перед началом терапии [Hoofiiagle, 2002].
Уровень РНК HCV в крови пациентов с хроническим гепатитом С отражает равновесие между вирусной продукцией и элиминацией вируса. Это равновесие нарушается с началом терапии альфа-интерфероном и приводит к уменьшению уровня РНК, которое происходит в два этапа [Davis, 2002].
После латентного периода в 8-10 часов, следующего за инъекцией интерферона, имеет место первоначальное быстрое падение уровня РНК, размеры которого коррелируют с дозой интерферона и генотипом вируса. Эта первая фаза обычно длится 24-48 часов, и уровень РНК за этот период падает в среднем в 10 раз [Zeuzem et al., 1996; Bekkering et al., 1997; Lam et al., 1997; Layden et al., 2001; Fukutomi et al., 2001]. Эта фаза, вероятно, отражает прямое ингибирование внутриклеточной продукции вируса [Neumann et al., 1998]. Результаты ранней фазы примерно на 50% выше для генотипов 2 и 3, чем для генотипа 1 [Neumann et al., 2000; Zeuzem et al., 2001].
Вторая фаза снижения уровня РНК HCV в крови начинается через 24-48 часов после первой инъекции интерферона и является более медленной и более вариабельной, чем первая фаза. Эта фаза отражает продолжающееся ингибирование вирусной репликации и постепенную элиминацию вирус-инфицированных клеток [Neumann et al., 1998; Layden et al., 2001]. Вторая фаза протекает быстрее при использовании пегилированного интерферона по сравнению со стандартным, и значительно быстрее для пациентов с генотипами 2 и 3, чем 1.
В ряде работ [Neumann et al., 1998; Layden et al., 2001] указывается на слабую связь между кинетикой первой фазы и ответом на терапию. Однако, если уровень РНК HCV не падает хотя бы в 10 раз в течение 24 часов после первой дозы интерферона, то это коррелирует с последующей неудачей всего лечения [Layden et al., 2001; Jessner et al., 2001; Fukutomi et al., 2001].
Наоборот, скорость второй фазы позволяет делать надежные прогнозы в отношении результатов всего лечения [Davis, 2002].
При этом существенным является установление связи между ранним и устойчивым вирусологическими ответами.
Ранний вирусологический ответ (EVR) определяется как снижение уровня РНК HCV по крайней мере на два порядка или до неопределяемых значений, измеренное чувствительным (50 Ш/мл) качественным ПНР после первых 12 недель лечения [Lindsay, 2002].
Использование внутреннего стандарта для качественного определения и генотипирования РНК HCV
Методом конечных разведений стокового раствора внутреннего стандарта известной концентрации определяли минимальную концентрацию внутреннего стандарта, при которой продукт его амплификации виден на электрофорезе.
Для использования внутреннего стандарта в качественном методе его добавляли в лизирующий буфер в минимальной концентрации. Этот лизирующий буфер использовали для выделения РНК HCV из сывороток крови больных.
Мы приготовили 5 разведений стокового раствора внутреннего стандарта с концентрацией 2x10б инф.ед./мл с шагом 5 (4x105 инф.ед/мл, 8х104инф.ед/мл, 1,6х104 инф.ед/мл, Зх103инф.ед/мл, 6х102 инф.ед/мл), добавили их в лизирующий буфер для выделения РНК из сыворотки крови. Получили набор из 6 лизирующих буферов:
№1-№5 - содержали уменьшающиеся количества внутреннего стандарта,
№6 - лизирующий буфер без стандарта.
Этот набор использовали для выделения РНК из HCV-положительных сывороток крови по стандартной методике. Таким образом, для каждого больного получили 6 образцов РНК, которые затем использовали для проведения ОТ-ПЦР по методике, описанной выше.
Использование внутреннего стандарта в экспериментах с разведенными сыворотками.
Приготовили 9 последовательных разведений сыворотки крови больного №67 (генотип lb) (рис.24А) с шагом 2. Для разведения использовали РНК HCV-отрицательную сыворотку. Получили 10 образцов сыворотки, содержащих уменьшающиеся количества вирусной РНК. Каждый образец разделили на три части. Таким образом, всего получили 30 образцов сыворотки крови. Далее эти образцы были зашифрованы, и измерение титра вирусной РНК проводилось «вслепую» описанным выше способом..
Фрагмент генома вируса гепатита С (5TJTR и часть гена Core) генотипа lb был амплифицирован методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в качестве первой стадии и клонирован в вектор pGemEasy (Promega). Затем клонированная вирусная последовательность была модифицирована введением вставки и переклонирована в ретровирусный вектор pBabe-Puro, содержащий ген устойчивости к пуромицину. Таким образом, мы получили конструкцию рВаЬе/НСУ (рис.18).
Использование внутреннего стандарта при качественном определении и генотипировании РНК HCV
Для использования в качественном методе внутренний стандарт добавляли в лизирующий буфер в минимальной концентрации (100 инф.ед./мл), видимой на электрофорезе, чтобы избежать снижения чувствительности метода.
На рис.21 приведен пример использования внутреннего стандарта при определении и генотипировании РНК HCV в сыворотке крови. Возможно несколько вариантов получаемых результатов.
1. В случае HCV-отрицательной сыворотки на форезе видна одна полоса внутреннего стандарта.
2. В случае HCV-положительной сыворотки на форезе видно две полосы: вирусная полоса и полоса внутреннего стандарта.
3. В случае HCV-положительной сыворотки с высоким титром вируса на форезе видна только одна вирусная полоса.
4. Отсутствие на форезе полос говорит об отсутствии в этой пробирке реакции.
Мы приготовили 5 разведений стокового раствора внутреннего стандарта с концентрацией 2x10s инф.ед./мл с шагом 5 (4x105 инф.ед/мл, 8х104инф.ед/мл, 1,6х104 инф.ед/мл, Зх103инф.ед/мл, 6x10 2 инф.ед/мл), добавили их в лизирующий буфер для выделения РНК из сыворотки крови. Получили набор из 6 лизирующих буферов:
№1-№5-содержали уменьшающиеся количества внутреннего стандарта, №6 - лизирующий буфер без стандарта. Этот набор использовали для выделения РНК из HCV-положительных сывороток крови по стандартной методике. Таким образом, для каждого больного получили 6 образцов РНК.
Далее с полученными образцами РНК проводили реакцию обратной транскрипции и nested-ПЦР.
Визуально на электрофорезе оценивали концентрацию вируса в образце, выбирая дорожку с одинаковой интенсивностью свечения полос (точка эквивалентности). 943н.п. ЗІЗн.п.
На электрофорезе (рис.22) виден конкурентный характер реакции. Во всех случаях концентрация сыворотки одинакова, но интенсивность свечения полос различна. На рис.22А точка эквивалентности находится на дорожке 2 и соответствует концентрации внутреннего стандарта 80 000 инф.ед/мл. На рис.22В точка эквивалентности находится на дорожке 4 и соответствует концентрации внутреннего стандарта 3 000 инф.ед/мл.
Мы проанализировали 19 HCV-положительных сывороток крови больных ГНЦ (14 сывороток с генотипом вируса lb, 1 сыворотка с генотипом 1а, 1 сыворотка с генотипом 2а, 3 сыворотки с генотипом За) (табл.4).
Для оценки эффективности предлагаемого теста было необходимо сравнить его с некоторым эталоном или эталонным тестом. В качестве эталонного материала была использована заведомо инфицированная сыворотка разной степени разведения. При этом экспериментатор, проводящий тестирование, не знал заранее степень разведения. Это позволило избежать смещения в результатах, обусловленного явным или не явным стремлением улучшить характеристики теста.
Приготовили 9 последовательных разведений РНК HCV-положительной сыворотки крови (генотип lb) с шагом 2. Для разведения использовали РНК HCV-отрицателыгую сыворотку. Получили 10 образцов сыворотки, содержащих уменьшающиеся количества вирусной РНК. Каждый образец разделили на три части. Таким образом, всего получили 30 образцов сыворотки крови. Далее эти образцы были зашифрованы, и измерение титра вирусной РНК проводилось «слепым» способом по методике, описанной выше.
Таким образом, для каждого из 30 образцов была известна объективная оценка относительной концентрации вирусного агента — это степень разведения. В результате тестирования для каждого образца были получены соответственные оценки в 3-х уровневой порядковой шкале: 0- "вирус не обнаружен", 1-"средняя концентрация вирусного агента", 2-"высокая концентрация вирусного агента". Необходимо было ответить на вопрос: насколько результаты тестирования расходятся с "истинными" оценками. Так как обе величины: "истинная" концентрация и выход теста - измерены в порядковых шкалах, для оценки эффективности был выбран ранговый коэффициент Спирмена с соответствующей оценкой его значимости.
