Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Влияние физических факторов на агрегацию тромбоцитов (обзорлитературы) 9.
1А. Биохимические механизмы функционирования тромбоцитов. 9.
1.1 А. Химическая природа активаторов...тромбоцитов 9.
1.1.2. Характеристика мембранных рецепторов. тромбоцитов. 11.
1.L3. Внутриклеточные посредники действия активаторов тром боцитов 16.
1.1.4. Стадии тромбоцитарных гемостатических превращении 22,
7.7.4. Видовые особенности агрегации тромбоцитов крыс 26.
1.1.4. Свободнорадикальный механизм регуляции агрегации тромбоцитов 32.
1.2. Сравнительная оценка влияния физических факторов на процессы агрегации ... 36.
1.2А. Физические и биохимические механизмы лазерной биости муляции клеток „ 38.
1.2.2. Акцепторы низкоинтенсивного лазерного излучения 41,
1.2.3. Зависимость биостимуляции клеток от дозы и длины волны лазерного облучения * 44.
1.2.4. Действие лазерного облучения на агрегацию тромбоцитов 46.
1.2.5. Механизмы изменения интенсивности агрегации тромбоцитов под действием НИЛИ. 48.
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования . 52.
2.1. Экспериментальные животные 52.
2.2. Методика отбора проб...крови , 52
2.3. Методика лазерного и светодиодного облучения крови 52
2.4. Методы оценки агрегационной активности тромбоцитов 53.
2.4А. Исследование агрегационной активности тромбоцитов в цельной крови крыс . 55.
2.5. Фармакологический анализ механизмов агрегации тромбоцитов крыс, индуцированный адреналином ... 57.
2.6. Протокол экспериментального введения препаратов для биохимических исследований 57.
2.7. Статистическая обработка . 58.
ГЛАВА 3. Механизмы агрегации тромбоцитов крыс подвлиянием светодиодного облучения (результа ты исследования) 59
3.1. Сравнительное исследование агрегационной активности тромбоцитов крыс в цельной крови, стабилизированной цитратом натрия и гепарином 59
3.2. Сравнительное исследование агрегационной активности тромбоцитов крыс в цельной крови и плазме после облучения красным светодио-дом ...60
ш 3.3. Исследование индуцированной адреналином агрегации тромбоцитов крыс в цельной крови ..62
3.4. Влияние светодиодного облучения на агрегацию тромбоцитов в зависимости от длины волны ~ , 64
3.5. Влияние светодиодного облучения на агрегацию тромбоцитов в зависимости от дозы * , 66
3.6. Сравнение влияния когерентного и некогерентного излучения на агрегацию тромбоцитов ...73
3.7. Исследование эффекта светодиодного облучения на тромбоциты в присутствии веществ, изменяющих концентрацию активных форм кислорода 76
3.7.1. Влияние светодиодного облучения на агрегацию тромбоцитов в присутствии морина ...77
3.7.2. Влияние светодиодного облучения на агрегацию тромбоцитов в присутствии ингибитора СОД .80
3.7.3. Влияние светодиодного облучения на агрегацию тромбоцитов в присутствии катализы , ...82.
Глава 4. Обсуждение полученных результатов 85
Выводы. 96.
Научно- практические рекомендации. 97
Литература 98
- Свободнорадикальный механизм регуляции агрегации тромбоцитов
- Фармакологический анализ механизмов агрегации тромбоцитов крыс, индуцированный адреналином
- Исследование индуцированной адреналином агрегации тромбоцитов крыс в цельной крови
- Влияние светодиодного облучения на агрегацию тромбоцитов в присутствии ингибитора СОД
Введение к работе
Актуальность проблемы. Профилактика и лечение тромботических состояний является одной го актуальных проблем современной медицины. По данным Всемирной Организации Здравоохранения, смертность от тромбоэмбо-лических заболеваний в развитых странах мира занимает первое место (Шишкова А.С.j 2000). В связи с этим в нашей стране и за рубежом проводятся многочисленные экспериментальные и клинические исследования, посвященные изучению функциональной активности тромбоцитов, а также усовершенствованию методов коррекции агрегации кровяных пластинок.
Доказано, что лазерное излучение низкой интенсивности благоприятно влияет на микроциркуляцию и реологические свойства крови. Улучшение текучести крови после облучения связывают с изменениями агрегационной активности тромбоцитов и эритроцитов (Бирюков B.C., Шингарев Г.Л., 1995; Спасов А.А. и соавт., 1998; Брилль А.Г, и соавт., 1999).
В последние годы в связи с усовершенствованием светодиодов ведутся активные работы по замене дорогостоящих лазерных излучателей источниками некогерентного света. Установлено, что светодиодное облучение в ряде случаев позволяет достигать лечебных эффектов, схожих с эффектами после лазерного воздействия - улучшается состояние микроциркуляции, текучесть крови (Сазонов A.M. и соавт., 1985; Дерябин Е.И., 1997; Пастухова Н.К. и соавт., 1997; Карандашов В.И. и соавт., 1998; Сыч В.Ф. и соавт., 1999). Однако, до настоящего времени механизмы действия светодиодного облучения в отличие от лазерного изучены недостаточно.
Центральное место в клинико-экспериментальном обосновании лазеро-и светодиодной терапии занимает вопрос от дозе воздействия, поскольку стимулирующий эффект облучения клеток происходит только в узком лозовом интервале света. Показано, что выход за пределы этого диапазона приводит к снижению стимулирующего эффекта облучения и расстройствам жиз-
недеятельности клеток (Кару Т.Й., 1983; Федосеева Г.Е. и соавт., 1986; Осин А.Я. и соавт., 1999; Козлов В.И., 1999).
До сих пор также не решен вопрос об оптимальной длине волны для лазерных и светодиодных терапевтических установок. В практической деятельности наиболее часто при лазеротерапии используется красный свет. Вопросы оптимальной длины волны для светодиодного облучения практически не изучены.
К ведущим механизмам, опосредующих биологическое действие низкоинтенсивного лазерного излучения на кровь относят изменение концентрации цитозолъного кальция, изменение количественного и качественного состава фосфолипидов мембран фотомодифицированных клеток крови, изменения активности рецепторов тромбоцитов, а также образование активных форм кислорода в клетках крови. Каковы же биохимические механизмы изменений свойств тромбоцитов после светодиодного воздействия не ясно. Можно предполагать, что эти механизмы являются универсальными и они проявляются при действии светодиодного облучения (Arora R.R. et al., 1993; Брилль А.Г.Д997; Oman М. et al., 1998; Спасов А.А. и соавт., 1998; Трофимов В.А. и соавт., 1998; BednarskaK, et al.r 2000).
Цель исследования. Выявление и сравнительная оценка механизмов изменений функциональной активности тромбоцитов при воздействии низкоинтенсивного лазерного и светодиодного излучений различных длин волн.
Задачи исследования:
Изучить изменения интенсивности агрегации тромбоцитов при действии светодиодного облучения различных длин волн в диапазоне от 430 нм до 880 нм.
Изучить влияние светодиодного облучения на процессы агрегации тромбоцитов в зависимости от дозы 0,02 +2,5 Дж/см2.
Сравнить изменения агрегационной активности тромбоцитов после лазерного и светодиодного облучения крови.
Исследовать влияние модификации уровня активных форм кислорода на эффективность светодиодного облучения в отношении тромбоцитов.
Научная новизна исследований. Усовершенствована методика оценки агрегационной активности тромбоцитов на основе импедансного метода в цельной крови экспериментальных животных. Установлено, что один из механизмов адреналининдуцированной агрегации тромбоцитов в цельной крови крыс реализуется через Ог-адренорецепторы.
На основе комплексной оценки интенсивности агрегации тромбоцитов под влиянием лазерного и светодиодного облучения выявлено, что наибольшей антиагрегантной способностью обладает светодиодное облучение длиной волны 430 нм и 660 нм. Показано, что наиболее выраженный ингиби-рующий эффект светодиодного облучения наблюдался в диапазоне доз 0,8 -^2,5 Дж/см2 (красный и инфракрасный диапазон). Обнаружено, что изменение концентрации супероксид-аниона и пероксида водорода приводит к изменению чувствительности тромбоцитов к светодиодному облучению.
Теоретическая в практическая значимость.
Показано, что светодиодное облучение эффективно влияет на интенсивность агрегации тромбоцитов, но этот эффект не идентичен лазерному. Когерентность излучения сама по себе может выступать в качестве самостоятельного физического фактора, усиливающего интенсивность агрегации тромбоцитов при облучении. Подобраны оптимальные режимы светодиодного облучения синего и красного спектра в диапазоне доз 0,26^0,39 Дж/см2 и 0,84-4,27 Дж/см2 соответственно для получения наибольшего антиагрегантного эффекта в цельной крови. Установлено, что путем изменения уровня активных форм кислорода в крови можно регулировать интенсивность антиагрегантно-
7 го действия светодиодного облучения. Результаты работы обосновывают целесообразность применения светодиодного облучения как удобного и безопасного в работе фактора физического воздействия для коррекции нарушений реологических свойств крови.
Основные положения, выносимые на защиту.
Антиагрегантный эффект облучения тромбоцитов крысы может быть модифицирован реагентами, изменяющими концентрацию активных форм кислорода.
Светодиодное облучение в диапазоне длин волн 43СИ-880нм действует од-нонаправленно, но уменьшение интенсивности агрегации зависит от длины волны. Наибольшее антиагрегантное действие оказывают синий (^,=430 нм) и красный (Х=660 нм) свет.
Наибольший эффект торможения агрегации наблюдается в интервале доз 0,8+-2,5 Дж/см2 (красный и инфракрасный диапазон).
Когерентность излучения выступает в качестве самостоятельного физического фактора, влияющего на интенсивность агрегации тромбоцитов при облучении.
Апробация работы и внедрение результатов в практику. Материалы диссертации доложены и обсуждены на заседании конференции «Молекулярные механизмы типовых патологических процессов» (г. Санкт-Петербург, 2003г.), на конференции «Актуальные проблемы патофизиологии» (г. Санкт-Петербург, 2002 г.), на кафедре патофизиологии СпбГМУ нм. акад. И.П. Павлова (2003г.), на кафедре биохимии, физиологии и патологии СПХФА (2004г.), на 10-м конгрессе Европейского общества фотобиологии (г. Вена, 2003г.), международной конференции " Радикалы кислорода и NO-соединения, антиоксидант и здоровье человека» (г. Смоленск, 2003 г.), на 10-й международной научно-практической конференции по квантовой ме-
s дицине (г. Москва, 2003г.), на 18-м международном конгрессе по лазерной медицине «Laser Florence 2003" (Флоренция, 2003г.).
Результаты исследований используются в учебном процессе и в научных исследованиях на кафедрах патологической физиологии и биохимии СПбГМУ им. акад. И.П, Павлова, на кафедре физиологии и патологии СПХФА, а также в научно-практических исследованиях «Центра лазерной медицины» СПбГМУ им. И.П. Павлова Результаты исследований позволяют рекомендовать разработать на основе светодиодного облучения медицинскую технологию коррекции нарушений реологических свойств крови при различных видах патологии человека
Структура и объем диссертации.
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, выводов и списка литературы. Изложена на 135 страницах машинописного текста, текст иллюстрирован 7 таблицами и 14 рисунками. Библиографический указатель представлен 293 источниками, из которых 109 отечественных и 184 иностранных работы.
Свободнорадикальный механизм регуляции агрегации тромбоцитов
В активации тромбоцитов важная роль принадлежит свободнорадикальным процессам, которые в норме протекают при превращении арахидоновой кислоты по липооксигеназному или циклооксигеназному путям. В результате происходит образование циклических эндопероксидов и гидропереоксидов по механизму, связанному со «взрывом» потребления кислорода, который обеспечивается митохондриальным дыханием и сопровождается появлением свободных кислородных радикалов. Стимулом для начала биосинтеза оксигенерированных метаболитов арахидоновой кислоты служит активация фосфолипазы Аз, которая приводит к освобождению арахидоновой кислоты из мембранных фосфолипидов. Нестабильный метаболит тромбоцитарной циклооксигеназы - тромбоксан ТхА2 является активным агрегирующим тромбоциты агентом, а простациклин в противоположность тромбоксану А2, обладает выраженной антиагрегационной способностью (Moncada S., Vane J,, 1979). Таким образом, активные формы кислорода (АФК), являющиеся продуктами свободнорадикальных процессов, проявляют, с одной стороны, токсическое повреждающее действие на биомембраны, а, с другой стороны -участвуют в синтезе простагландннов и тромбоксанов, регулирующих важнейшие биохимические процессы.
«Внутриклеточный» взрыв образования тромбоцитами гидроксильных радикалов (ОН) и супероксид-аниона (02" ) при постишемической реоксигенацин сопровождается значительным увеличением тромбоксана А2 (Jeroudx М., etal., 1994; Leo R., etal., 1997).
Согласно свободнорадикальному механизму регуляции агрегационной способности тромбоцитов (Шатилина Л.В., 1993), выявлена положительная связь между максимальной агрегацией и интенсивностью свободнорадикальных реакций липидов, а также отрицательная взаимосвязь между степенью агрегации кровяных пластинок и активностью фермента СОД
Наиболее подвержены свободнорадикальному окислению ненасыщенные липиды, входящие в состав биомембран клетки (Рощупкин Д. И., Мурина М.А., 1993; Leo etal, 1997). Пероксидация мембран сопровождается деформацией мембранного липопротеидного комплекса, продукты ПОД активируя тромбоциты, могут изменять интенсивность тромбогенеза (Canoso R.s etal., 1974; Ohyashiki Т., etal., 1991). Продукты липопероксидации (МДА - малоновый диальдегид, ДК - диеновй конъюгат) могут модифицировать агрегационную активность тромбоцитов опосредованно путем изменения упорядоченности тромбоцитарных мембран, повышенные концентрации ДК могут непосредственно активировать тромбоциты, приводя к повышению их агрегационной активности (Stuart М., 1979).
При респираторном взрыве лейкоцитов при фагоцитозе резко возрастает генерация АФК, что сказывается на функции тромбоцитов (Ohman В.Н., Babiuk L.A., 1984). Тромбоциты в свою очередь оказывают ингибирующее влияние на образование АФК лейкоцитами крови, перекнсное окисление л или до в (Коган АХ и соавт., 1994; Даниляк ИХ. и соавт.., 1994). Установлено, что бедная тромбоцитами плазма в большей степени стимулирует образование АФК, чем плазма, обогащенная тромбоцитами. Возможно, что тромбоциты взаимодействуют с церуллогошзмином, обладающим способностью инактивировать свободные радикалы (Kurosawa М., etal., 1991, Даншшк И.Г. и соавт., 1994).
Супероксидный анион-радикал образуется в процессе одноэлектронного восстановления кислорода вследствие «утечки» электронов с участков митохондриальных и микросомальных цепей переноса электронов при изменении условий функционирования дыхательной цепи (при гипоксии, стрессорных и воспалительных состояниях), при окислении ксантина ксантиноксидазой, при «дыхательным взрыве» фагоцитоза в нейтрофилах, фагоцитах, В результате дисмутации супероксида появляется перекись водорода (Н202). В присутствии ионов Fe2+ и супероксиданиона перекись водорода разлагается по реакции Фентона и Хабер-Вайса с образованием реакционного гидроксил - радикала (ОН) (Fridovich Ї., 1986; Meier R., 1991; Leoacini G., et.al., 1991; Leo R., etal, 1997; Sanders S., etal., 1997; Скулачев В.П., 1998; O Byrne SM etal., 2000; Lenaz G., et.al., 2002).
Активные формы кислорода различаются по скорости распада. Гидроксильные радикалы, как наиболее реакционноспособные и короткоживущие, могут оказывать свой эффект только в месте их образования. Перекись водорода может диффундировать из места образования на значительные расстояния, пересекая клеточные и внутриклеточные мембраны, в то время как супероксидные радикалы наиболее активны вблизи железа и диффундируют только через специальные анионпроводящие каналы (Halliwell В., Gutteridge J.M., 1984;КарузинаИ.И. и соавт., 1995).
Данные литературы свидетельствуют о том, активные формы кислорода опосредуют агрегацию, действуя как вторичные мессенджеры на начальной стадии тромбоцитарной активации. В цельной крови агрегация тромбоцитов может быть индуцирована перекисью водорода (Н202) (Iuliano L., etal., 1994; Leo R., etal, 1997). Тромбоциты имеют мембранно-связанные Н202 -генерирующие системы, при действии агонистов в тромбоцитах образуется Н202 (Del Principe D., etal, 1985).
Низкие концентрации эндогенной Н202 требуются для увеличения синтеза ТхА2 (Ambrosio G, etal, 1994). Действие Н202 на агрегацию тромбоцитов зависит от ее концентрации: в миллимолярньгх концентрациях Н2Ог усиливает агрегацию (Holmsen Н., Robkin L., 1977; Del Principe D., etal., 1985). В то же время имеются работы, свидетельствующие о том, что Н2Ог является ингибитором агрегации (Stuart М., Holmsen Н., 1977; Holmsen К, Robkin L., 1977). Воздействие высокими, но не токсичными концентрациями экзогенной Н2О2 и 02 может ингибироватъ агрегацию тромбоцитов под действием АДФ через стимуляцию гуаннлатциклазы (Ambrosio G., etal., 1994). Перекись водорода оказывает как стимулирующее, так и ингибирующее действие на агрегацию тромбоцитов (Canoso R., etal, 1974; Ohyashiki Т., etal, 1991; Ambrosio G., etal., 1994).
В литературе имеются противоречивые сведения и о влиянии на агрегацию тромбоцитов супероксидного аниона. Результаты исследований свидетельствуют как об увеличении агрегации тромбоцитов под действием супероксиданиона (Handin R.L., etal., 1977; SaJvemini D., etal., 1989; Leo R., et.al., 1997), так и о торможении агрегации (Mittal С.К., etal., 1977; Ambrosio G., etal., 1994).
Фармакологический анализ механизмов агрегации тромбоцитов крыс, индуцированный адреналином
В общем случае агрегатограммы, получаемые на импедансном агрегометре АИ-300, аналогичны кривым, получаемым на оптических агрегометрах. Параметры агрегации тромбоцитов, получаемые в цельной крови крыс, анализируются по общепринятым характерным точкам. Обработка кривых агрегации, высвечиваемых на матричном индикаторе прибора, осуществляется с помощью подвижного экранного маркера. Маркер устанавливается в характерных точках кривых, при этом на цифровом табло прибора появляются номер точки (N) и значение модуля импеданса (А). Импедансом называется модуль полного электрического сопротивления, представляющий сумму омического и емкостного сопротивления. Расчет параметров агрегации тромбоцитов, определяемых импедансным методом на АИ-300, производился по формуле: A = Z2 - Z i (Ом), где: А - интенсивность агрегации, Ом; Z2- максимальное значение модуля импеданса в конечной точке, Ом; Ъ\ -значение модуля импеданса в начальной точке, соответствующей началу агрегации, Ом (Иванов В.И., 1999).
В качестве контроля использовали пробу цельной крови крыс объемом 0,55 мл, в которую вводили индуктор адреналин (0?05 мл). В качестве опытных проб использовали цельную кровь крыс объемом 0,55 мл, в которую вводили 10 мкМ йохимби-на - селективного антагониста альфа-2 адренорецепторов. Интенсивность агрегации тромбоцитов определяли через 15с после введения адреналина (0,05 мл) импедансным методом. В последующей серии опытов в пробу цельной крови крыс объемом 0,55 мл вводили 10 мкМ идазоксана (селективный антагонист альфа 2- адренорецепторов), через 15с вводили адреналин (0,05мл) и определяли интенсивность агрегации с помощью импедансометрии.
Пробу крови объемом 5 мл разделяли на 4 аликвоты:
1) контроль-цельная кровь крыс, в которой импедансным методом определяли интенсивность агрегации.
2) облучение цельной крови светодиодом(Х- ббОнм, экспозиция I минута, доза облучения - 0,03 Дж/ем2. Непосредственно после облучения импедансным методом определяли интенсивность агрегации тромбоцитов.
3) введение в цельную кровь препаратов с определением интенсивности агрегации тромбоцитов.
4) облучение пробы, содержащей биохимические препараты, светодиодом
(Аг ббОнм, доза облучения 0,03 Дж/см2). Сразу после облучения оценивали агрега ционную активность тромбоцитов в цельной крови.
Полученные в процессе исследований данные обрабатывались методами вариационной статистики с использованием программы Excel 97.0 из пакета MS Office ХР (Microsoft Corp). Данная программа осуществляет расчеты по стандартным формулам математической статистики с использованием алгоритмов и методов.
Лабораторные крысы являются одним из наиболее распространенных объектов исследований в экспериментальной патологии. Этот вид животных широко используется при проведении исследований механизмов гемостаза и тромбообразования (Raymond S., Dodds W., 1975; Minuth M., Jacobs К., 1983; Розенберг A.. и соавт., 1984; Prieur D., Meyers К., 1984). Однако, работ, посвященных анализу механизмов агрегации тромбоцитов крыс в цельной крови немного, а методические вопросы в литературе практически не освящены (Margo A., etal., 1992, Pawlak D.,etal., 1993; Torres Duarate A., etal,, 1995). В связи с этим нами была усовершенствована методика оценки агрегационной активности тромбоцитов на основе импедансного метода (Дементьева И.Н., Гаспарян Л.В., 2002). Так, для выбора стабилизатора крови были проведены исследования с цитратом натрия 3,2% и гепарином (50 ед/мл). Агрегация тромбоцитов, индуцированная АДФ, наблюдалась в гепаринизированной цельной крови, тогда как в цельной крови, стабилизированной цитратом натрия, агрегации не было. В дальнейшем в исследованиях агрегации в цельной крови в качестве антикоагулянта использовали раствор гепарина в физиологическом растворе в конечной концентрации (50 ед/мл) (раствор гепарина для инъекций, в 1 мл 5000ЕД, Московский эндокринный завод).
Исследование индуцированной адреналином агрегации тромбоцитов крыс в цельной крови
Данные литературы свидетельствуют, что адреналин даже в высоких концентрациях (100 цМ) не вызывает ни «shape change» - изменения формы тромбоцитов, ни агрегации тромбоцитов крыс в плазме (Hye Sook Yun-Choi., etal., 2000). Однако, адреналин в присутствии низких концентраций коллагена в плазме вызывает изменения формы кровяных пластинок - «shape change». Адреналининдуцированная агрегация тромбоцитов крыс в плазме была ингибирована а2-антагонистоми иохимбином и феноламином, но не сн-антагонистом празоцином или р-антагонистом пропранололом. Это позволило заключить, что адреналининдуцированная агрегация тромбоцитов крыс осуществляется через аг- адренергические рецепторы (Hye Sook Yun-Choi, et.al., 2000). Однако, есть сообщения, что катехоламины в тромбоцитах крыс действуют через р-адренорецепторы (Hwang D.H., 1985; Koutouzov S.,etal., 1985; Mackinnon A.,et.al., 1992). Можно полагать, что через эти же механизмы реализуется и агрегация тромбоцитов в цельной крови крыс.
В отдельной серии экспериментов (п=10) был проведен фармакологический анализ механизмов агрегации тромбоцитов крыс с использованием агониста (адреналин) и антагонистов (иохимбин, идазоксан). Как известно, последние являются классическими альфа-2 адреноблокаторами (Elliott Н., 1984; Waterfall J.s 1985; Muir N., 1987; Galitzky X, etal., 1990). Полученные результаты исследования представлены на рис.3 т- 120
Влияние а-блокаторов на адреналининдуцированную агрегацию - р -0,05-достоверность различий по отношению к контролю
Как видно из рис.3, селективные блокаторы йохимбин и идазоксан угнетают адреналининдуцированную агрегацию в цельной крови крыс на 60-70%. Это свидетельствует о том, что один из механизмов агрегации, индуцированной адреналином, тромбоцитов цельной крови крыс реализуется через а2-адренорецепторы.
Известно, что агрегация тромбоцитов под влиянием адреналина зависит от концентрации экзогенного кальция в среде. Из литературных данных (Scott D., etal., 1986; Hye Sook Yun-Choi, 2000) и по результатам наших исследований следует, что в цитратной обогащенной тромбоцитами плазме и цитратной цельной крови крыс при низкой концентрации кальция в среде (40 мкМ) адреналин не вызывает агрегацию тромбоцитов. В тех случаях, когда удается сохранить концентрацию ионов кальция в среде близкой к физиологической (применение гепарина в качестве антикоагулянта) адреналин действует как индуктор агрегации в цельной крови крыс. 3.4. Влияние светодиодного облучения на агрегацию тромбоцитов в зависимости от длины волны.
Повышенный интерес исследователей к физиологическим эффектам светодиодного облучения обусловлен, прежде всего, интенсивными работами по замене дорогостоящих лазерных излучателей источниками светодиодного некогерентного света, которые являются более дешевыми, надежными, безопасными и удобными в эксплуатации (Бирюков B.C., Шингарев Г.Н., 1995). Установлено, что светодиодное облучение порой позволяет достигать лечебных эффектов, схожих с эффектами лазерных воздействий (Дерябин Е.И., 1997). Показано, что красное светодиодное облучение подавляет агрегацион-ную активность тромбоцитов (Карандашов В.И. и соавт., 1998). Вместе с тем, комплексной сравнительной оценки действия светодиодного облучения различных длин волн на агрегационные свойства тромбоцитов не проводилось.
Результаты влияния светодиодного облучения разных длин волн на агрегацию тромбоцитов представлены на рис. 4.
Рис.4. Изменение интенсивности агрегации под действием АДФ после светодиодного облучения с разными длинами волн - р 0,05 - достоверность различий по отношению к контролю. Для изучения влияния светодиодного облучения на АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов цельной крови использовались светодиодные излучатели с длинами волн 430, 565, 595, 660, 880 нм. Доза воздействия была стандартной и составляла 0,045 Дж/см2. Из графика на рис.4 видно что светодиодное облучение снижало интенсивность агрегации. Наибольший эффект светодиодного воздействия наблюдался при облучении крови синим (Х=430нм) и красным светом (Х.=660нм) - на 35% и 42% соответственно. При облучении крови зеленым (к= 565нм), желтым (Х,=595нм), инфракрасным светом (Х,=880нм) уменьшение интенсивности агрегации по сравнению с контролем составило 21%, 23% и 26% соответственно.
Таким образом, светодиодное облучение в диапазоне 430 880 нм в дозе (0,045Дж/см ) действует однонаправленно - уменьшает агрегацию тромбоцитов. Выраженность торможения агрегации кровяных пластинок зависит от длины волны. Наибольшим антиагрегантным действием на тромбоциты цельной крови обладают излучения светодиодов синего ()-=430 нм) и красного (А,=660 нм) диапазона Светодиодное воздействие желтым (1=565 нм), зеленым (Х=595 нм) и инфракрасным (Я.=880 нм) светом на кровяные пластинки вызывает меньший антиагрегационный эффект.
Влияние светодиодного облучения на агрегацию тромбоцитов в присутствии ингибитора СОД
Исследовано изменение функциональной активности тромбоцитов в присутствии диэтилдитиокарбамата (ДДТК). В исследованных концентрациях ДДТК специфически ингибирует СОД и т.о. обеспечивает повышение концентрации супероксиданиона. Результаты исследований влияния светодиодного облучения (іг=10, Х,=660 нм? доза 0,423 Дж/см2) на фоне ингибирования СОД представлены на рис. 13. Как видно из рис.13, при добавлении ДДТК в цельную кровь крыс наблюдается уменьшение интенсивности АДФ-индуцированной агрегации в среднем на 28% и адреналининдуцированной агрегации - на 49% по отношению к контролю.
Исходя из механизма действия ДДТК, можно полагать, что в результате ннгибирования СОД происходит увеличение концентрации супероксиданиона. Из литературы известно (Brune В., etal., 1990), что Супероксиданион может выступать в качестве обратимого ингибитора растворимой гуанилатциклазы тромбоцитов человека. Вместе с тем, данные других авторов (Mittai СК., Murad F., 1977; Ambrosio G., etal., 1994) свидетельствуют об активирующем действии супероксиданиона в отношении гуанилатциклазы крысы и человека. Было показано, что супероксиданион вызывал 10-кратное увеличение в тромбоцитах человека концентрации цГМФ, что приводило к ингибированию АДФ-индуцированной агрегации на 48%. Наши данные свидетельствуют о том, что ингибирование СОД с помощью ДДТК и светодиодное облучение проявляют аддитивное действие. Поскольку известно, что облучение красным светом биологических объектов сопровождается повышением образования супероксиданиона (Callaghan А., etal., 1996; Каш Т., 2000), можно предположить, что при облучении образцов крови, содержащих ДДТК, происходит суммация эффектов Ог из разных источников: экзогенного фонового и стимулированного облучением.
Наиболее вероятным объяснением антиагрегантного действия супероксиданиона может быть активация им гуанилатциклазы с последующим увеличением образования интрацеллюлярного уровня цГМФ, который опосредует торможение агрегации тромбоцитов. Механизм активации гуанилатциклазы супероксиданионом связьшают (Braughler J.M.,1980; Северина И.С, 1994) с конформационным изменением фермента, обусловленным окислением SH-rpyrm двух остатков цистеина. 3.7.3. Влияние светодиодного облучения на агрегацию тромбоцитов в присутствии каталазы.
Каталаза является водорастворимым антиоксидантом, который осуществляет ферментативное разложение пероксида водорода (Н202) до неактивных продуктов. В высоких (не физиологических) концентрациях пероксид водорода известен как индуктор агрегации тромбоцитов (Holmsen Н., RobkinL., 1977; Del Principe D., et.al., 1985). Добавление в кровь каталазы ускоряет детоксикацию пероксида водорода, что ведет к понижению его концентрации. В наших экспериментах с добавлением в кровь каталазы можно оценить влияние на процесс низких физиологических концентраций Н2О2. Результаты исследований приведены на рис. 14. Как видно из рисунка 14, добавление в кровь каталазы приводило к достоверному усилению как АДФ, так и адреналинстимулированной агрегации тромбоцитов. Поскольку каталаза снижает концентрацию Н2С 2, можно считать, что эндогенная перекись водорода в условиях контрольных экспериментов проявляет ингибирующее действие на агрегацию тромбоцитов.
По данным литературы, эндогенная перекись водорода усиливает АДФ - и коллагенстимулированную агрегацию тромбоцитов, т.к. необходима для синтеза ТхА2 (Самаль А.Б,, 1988; Ambrosio G.,1994). В тромбоцитах Н202 постоянно образуется как побочный продукт в ходе циклооксигеназного пути обмена арахидоновой кислоты, В высоких дозах (миллимолярных) Н202 даже индуцирует процессы агрегации тромбоцитов (Holmsen Н., Robkin L.; 1977; Del Principe D.? etal., 1985). Описанные в литературе эксперименты с каталазой давали противоречивые результаты, а именно - отсутствие эффекта фермента при эндогенных концентрациях Н202 (Handin RL, etal, 1977; Salvemini D., etal., 1989; Ambrosio G., 1994), ингибирование спонтанной агрегации тромбоцитов под действием ишемии -реперфузии (Leo R., etal., 1997) и, наконец, усиление агрегации тромбоцитов (Holmsen К, Robkin L., 1977; Ambrosio G., 1994).
Антиагрегантное действие Н202 объясняют активацией гуанилатциклазы (Ambrosio G., etal., 1994), по механизму, сходному с добавлением супероксиданиона (Mittal СК., Murad F., 1977). Вероятно» полученное нами усиление агрегации тромбоцитов под действием каталазы обусловлено предотвращением активации гуанилатциклазы эндогенной перекисью.
