Введение к работе
Актуальность работы. Одной из важных проблем современной биохиыии и ихшунохимии является изучение кинетики и механизма взаимодействия антигенов с антителами. Одним из перспективных подходов изучения реакции антиген-антитело является метод твердофазного иммуноферментного анализа. С помощью этого метода может быть определена среднечисловая равновесная константа диссоциации комплекса антигена с поликлональньом антителами (Kd) и рассчитаны константы скорости реакции антиген-антитело (к).
Знание равновесных и кинетических параметров взаимодействия антиген-антитело необходимо для создания чувствительных тест-систем иммуноферментного определения различных антигенов. Большой практический интерес представляет иммуноферментный анализ строфантина К ССТР)- сердечного гликозида, используемого в кардиологии для лечения сердечной недостаточности. Созданные ранее иммунофэрментные тест-системы строфантина не удовлетворяют в достаточной мере современным требованиям клинической практики. В связи с этим остается актуальной разработка экспрессного и чувствительного твердофазного иміуноферментного анализа ПЯ>А) строфантина.
Важной задачей является подбор формованных твердых матриц, на основе которых моаио было бы создать удобные иммунные и аффинные сорбенты, позволявшие достигать высокой чувствительности иммуноферментного определения.
Очевидно, что иммобилизованные на иммуносорбентах антитела меняот свои свойства. Поэтому крайне необходимо изучать иммуно-химические харсл-еристики антител, ковалентно связанных с различными полимерными носителями, и сравнивать их со свойствами антител в растворе.
Диссертационная работа выполнялась в соответствии с плановой темой ИБОХ АН Беларуси "Разработать научные основы иммуноферментного анализа для микроопределения сердечных гликозидов и другие антигенов и создать иммуноферментные системы для определения сердечных гликозидов и прогестерона" (номер гос. регистрации 01860068356) и Государственными научно-техническими программами "Новейшие методы биоинженерии" и "Здоровье".
Цель работы. Целью работы было изучение реакции вэ.-urvo-действия строфантина и его пероксидазного конъюгата со споци-
фичннми антителами в растворе и ковалентно связанными с различными полимерными носителями.
Положения, выносимые на защиту: количественная характеристика сорбционных свойств полисти-рольных пробирок и полиамидных мембран и определение емкости химически активированных полистирол'ьных шариков и модифицированных полиамидных мембран по отношению к гшуноглобулинам;
- получение и характеристика аффинных и иммунных сорбентов на
основе этих матриц для их использования в иммунофернентном
анализе строфантина;
определение кинетических и равновесных параметров взаимодействия строфантина со специфичными антителами в растворе методом твердофазного иммуноферментного анализа;
- получение кинетических и равновесных характеристик взаимодей
ствия строфантина и его пероксидазного конъюгата со специфичны
ми антителами против строфантина, ковалентно связанными с акти
вированными полистирольными шариками и модифицированными
полиамидными мембоанами;
- разработка иммуноферментных тест-систем для определения
строфантина на основе различных иммунных и аффинных сорбентов.
Научная новизна. В работе использованы модифицированные полимерные носители - активированные полиамидные мембраны и по-листирольные шарики -. и количественно охарактеризованы и" сорб-ционные свойства. Разработан способ получения иммуносорбента на основе активированных полиамидных мембран и _нтител против СТР. Использование полученных сорбентов позволило определить равновесные и кинетические параметры взаимодействия антигена с антителами, ковалентно связанными с активированными лолимьрными носителями. Проведено сравнение свойств иммобилизованных и растворенных антител. С использованием активированных носителей разработано 7 иммуноферментных тест-систем для определения строфантина.
Практическая значимость работы. Разработанные аналитические тест-системы для определения строфантина с использованием различных формованных полимерных носителей могут стать основой серийного производства наборов реагентов для иммуноферментного определения этого гликозида в биологических жидкостях. Отдельные компоненты разработанных тест-систем могут быть
использованы для ИФА других антигенов.
ИФА строфантина с использованием активированных полисти-рольных шариков и иммобилизованных на них вторых антител выбран для практического использования в клинической практике с целью мониторинга СТР при гликозидотерапии кардиологических больных. Оформлена вся научно-техническая документация на набор реактивов "ИФА-Строфантин-ПХ" для определения СТР в сыворотке крови.
Апробация работы. Основные результаты работы доложены и представлены на 14-ом Менделеев-дом съезде по общей и прикладной химии (Ташкент, 1989), на 7-ой Международной конференции молодых ученых по органической химии и биохимии (Варна, 1990), на 2-ой Всесоюзной конференции "Современные направления создания медицинских диагностикумов" (Москва, 19эо), на 7-ом Всесоюзном симпозиуме "Инженерная энзимология" (Москва, 19Э1).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 статей, тезисы б докладов и получено авторское свидетельство
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (I глава), экспериментальной части (4 главы) , выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена ка 162 страницах, включая 7 таблиц и 36 рисунков. Библиография - 131 название. В диссертации имеется приложение: і Шедико-техническиэ требования к набору реактивов, утвержденные Мин. здравоохранения РБ; 2)Инструкция по применению набора реактивов для иммуноферментного определения строфантина в сыворотке крови человека; з)Технические условия на компоненты набора реактивов для иммуноферментного определения строфантина в сыворотке крови человека с использованием антигена, меченного пероксидазой, и иммуносорбента, содержащего антивидовые антитела.
