Содержание к диссертации
Введение
1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
1.1. Периферийный катаболизм ароматических соединений у псевдомонад 9
1.2. Биохимическая характеристика метаболических путей, обусловленных TOL плазмидами
1.2.1. Деградация толуола и его производных у штаммов P. putida .......... 14
1.2.2. Ферменты расщепления толуола и его производных 19
1.2.2.1. Субстратная специфичность ферментов 19
1.2.2.2. Ключевые ферменты 20
1.2.2.3. Катехол-2,3-диоксигеназа 23
1.2.2.4. Катехол-2,3-диоксигеназа, как маркер экспрессии TOL -плазмидных генов .
1.3. Генетическая и молекулярно-биологическая характеристика TOL плазмид 26
1.3.1. Общие свойства и строение TOL плазмид 26
1.3.1.1. Изофункциональность 26
1.3.1.2. Температурочувствительность .... 26
1.3.1.3. Конъогативность 28
1.3.1.4. Образование рекомбинантов с Е плазмидами . . . 30
1.3.1.5. Устойчивость к атомарному кислороду и ультрафиолетовому облучению ... '34
1.3.1.6. Бензоатная элиминация 34
1.3.2. Физическая и генетическая структура плазмиды 37
1.4. Экспрессия TOL -плазмидных генов 41
1.4.I. Доминирование плазмидного пути расщепления ароматических соединений у штаммов P. putida 41
1.4.2. Генетическая регуляция активности a?OL-плазмидных генов . 43
1.4.3. Условия экспрессии TOL -плазмидных
генов 46
1.4.4. Транскрипция генов . . 48
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Основные препараты и реактивы 51
2.2. Штаммы бактерий 53
2.3. Питательные среды 53
2.4. Условия культивирования микробов .... 55
2.5. Условия индукции плазмидных ферментов . . 55
2.6. Определение активности ферментов .... 56
2.6.1. Приготовление бесклеточного экстракта 56
2.6.2. Определение сухого веса бактерий . . 57
2.6.3. Определение активности К230 57
2.6.4. Определение активности гидролазы 2ГМПА 60
2.6.5. Определение активности KI20 60
2.7. Частичная очистка К230 61
2.8. Определение синтеза белка во время индукции активности К230 61
2.8.1. Радиоактивное мечение белков .... 61
2.8.3. Электрофорез белков в ПААГ-е .... 62
2.9. Изучение синтеза РНК во время индукции активности К230 62
32
2.9.1. Включение Р-ортофосфата в клетки бактерий 63
2.9.2. Включение Н-урацила в лабильную РНК 63
2.9.3. Выделение суммарной РНК 64
2.9.4. Анализ препаратов суммарной РНК ... 65
2.10. Выделение TOL -плазмидоспецифической РНК 66
2.ЮЛ. Иммобилизация TOL -плазмидной ДНК на сефарозе 2В 66
2.10.2. Очистка TOL -плазмидоспецифической РНК 66
2.11. Изучение TOL -плазмидной ДНК 67
2.11.1. Выделение и очистка плазмидной ДНК 67
2.11.2. Анализ плазмидной ДНК 68
2-,11.3. Выделение из геля рестрикционных фрагментов плазмидной ДНК 69
2.12. Гибридизация РНК-ДНК в капилляре ..... 69
3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1. Изучение динамики индукции активности К230 71
3.1.1. Определение активности К230 71
3.1.2. Стабильность К230 76
3.1.3. Динамика индукции активности К230 ... 78
3.2. Синтез белка во время индукции активности К230 84
3.3.. Синтез РНК во время индукции К230 .... 87
3.3.1. Изучение синтеза лабильных РНК .... 87
3.3.2. Состав РНК, синтезированной во время индукции К230 . 92
3.3.3. Выделение TOL -плазмидоспецифических РНК 96
3.3.4. Изучение динамики синтеза ШОЬ -плазмидо специфических РНК 99
3.4. Локализация активно транскрибируемых участков в геноме плазмиды pwwo 10?
4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
4.1. Индукция активности К230 112
4.2. Транскрипция TOL плазмиды pWWO ..... 118
4.3. Локализация активно-транскрибируемых регионов TOL плазмиды pWWO 124
5. ВЫВОДЫ 128
Литература . 131
- Периферийный катаболизм ароматических соединений у псевдомонад
- Основные препараты и реактивы
- Изучение динамики индукции активности К230 71
Периферийный катаболизм ароматических соединений у псевдомонад
В природных экосистемах микробные ассоциации регулируются, по всей вероятности, набором химических веществ, находящихся в данной экологической нише. При этом следует подчеркнуть два основных момента: во-первых, микробы должны содержать механизмы, обеспечивающие резистентность к токсическим концентрациям как органических, так и неорганических соединений, находящихся в контакте с микробами, и во-вторых, если воздействующее соединение является постоянным компонентом данной среды, то в процессе эволюции селективные преимущества для выживания получают те микробы, у которых формируются генетические механизмы для утилизации данного химиката в качестве источника энергии и углерода.
В природе, особенно в почве, находится огромное количество всевозможных ароматических соединений, что по всей вероятности, обусловливает чрезвычайную разнообразность периферийного катаболизма у почвенных микроорганизмов. В этом отношении наиболее примечательны почвенные псевдомонады, способные утилизовать ароматические соединения по пути окислительного расщепления /I, 2, 3, 4, 5, 6, 7/. Они способны утилизовать также и синтетические органические соединения, в частности, гербициды /8/.
Причем разные штаммы почвенных псевдомонад имеют разный спектр катаболических возможностей /9/, В то же время эти катаболические пути имеют много общего. Они начинаются окислением одной боковой цепи до ароматической карбоксильной кислоты с образованием в дальнейшем катехо-ла, протокатеховой или гентизиновой кислоты, служащих "исходными субстратами" для последующих реакций окислительного расщепления (рис. I) /10/. Выбор конкретного "исходного субстрата"определяется микроорганизмом, его генетическими возможностями, и химической структурой окисляемого соединения.
Основные препараты и реактивы
Ферменты
Дезоксирибонуклеаза I, свободная от РНК-азы, фирма "Worthington" , (США).
Рестрикционные эндонуклеазы Xhol, Hlndlll, полученные из ВНИИ прикладной энзимологии Главмикробио-прома при СМ СССР,(Лит.ССР).
Рибонуклеаза из поджелудочной железы, фирма "Reanal", (ВНР).
Лизоцим из яичного белка, фирма "Sigma", (США).
Нуклеиновые кислоты и белки
ДНК плазмиды pBRj22 из Е. coli HBIOI была любезно предоставлена Я.К. Хабихтом (Институт химической и биологической физики АН ЭССР).
Суммарная тРНК, рибосомная 23S РНК, субчастицы и рибосомные белки Е. coli МЕЕ600 были любезно предоставлены М.Б. Зставом (НИИ общей и молекулярной патологии Тартуского госуниверситета),
Сывороточный альбумин, фирма "Ееanal",(ВНР).
Препараты
Агароза, фирма "Miles" , (США).
Сефароза-2В, фирма "Pharmacia", (Швеция). ДЭАЭ-целлюлоза, "Reanal", (ВНР). Гидроксилапатит, ША-Grade НТР фирма "Bio-Rad", (США).
Основные реактивы
м-Толуат, фирма "Koch-Light", (Англия)» п-Толуат, фирма "Koch-Light",(Англия). Катехол, фирма "Koch-Light", (Англия). Янтарная кислота, фирма "Reanal", (ВНР). ДЦС-натрия, 99 %-ный, фирма "Sigma", (США). Реактивы для электрофореза в ПААГ, фирма "Reanal", (ВНР).
Формамид, фирма "Serva", (ФРГ).
Радиоактивные изотопы: раствор ортофосфорной кислоты, меченной 22р без носителя, 0,74 ТБк/мл, В/О "Изотоп" , (СССР).
5- Н-урацил, раствор в 50 %-пом этаноле, 0,7 ТБкямоль, В/0 "Изотоп", (СССР).
L - [4,5- HJ -лейцин, 2,0 ТБк/ммоль, фирма ".Amersham", (Англия).
L - [4,5(1)-] -лизин- НС1, 1,84 ТБк/ммоль, фирма "Amersham" , (Англия).
Минеральные соли отечественного производства марки "осч" или "хч".
При приготовлении растворов использовали бидистиллиро-ванную воду.
Миллипорные фильтры с диаметром пор 0,23 мкм, фирма "Synpor", (Чехословакия) и "Millipore", (США).
Стекловолокнистые фильтры GF/C, фирма "Whatman", (Англия).
Рентгеновский фильм HS11, фирма "ORWO", (ГДР).
Изучение динамики индукции активности К230 71
Б предварительных опытах нами было проведено сравнительное изучение активности ключевых ферментов разложения катехола в бесклеточных экстрактах и в суспензиях интактных клеток бактерий. Оказалось, что активности К230 и гидролазы 2ГМПА в штамме P. putida mt-2 pWWO (TOL+) и активность KI20 в штамме P. putida mt-2 PaW340 (ТОІГ) можно определять как в клеточных экстрактах, так и в суспензиях интактных клеток (табл. 2), Числовое значение активности ферментов в суспензии интактных клеток (мкмоль/мин на I мг с,в,б.) было в среднем на один порядок ниже числового значения активности этих же ферментов в бесклеточном экстракте (мкмоль/мин на I мг белка) (табл. 2).
При росте бактерий P. putida mt-2 pWWO (TOL+) на TOL-плазмидоспецифическом субстрате - м-толуате - как на единственном источнике углерода и энергии, индуцировался синтез только TOL -плазмидоспецифических ферментов - К230 и гидролазы 2ГМПА, а активность хромосомно-детерминированной KI20 отсутствовала (табл. 2).
Так как активность К230 в 20...30 раз превосходит активность следующего фермента T0L -плазмидоспецифического пути - гидролазы 2ГМПА (рис. 3, табл. 2), то в дальнейших наших опытах в качестве маркерного фермента TOL -плазмид-ного метаболического пути определялась лишь активность К230. Для определения активности этого фермента на уровне интактных клеток нами были отработаны оптимальные условия ферментативной реакции. Оказалось, что в начале ферментативной реакции разложения катехола кинетическая кривая образования продукта реакции - полуальдегида 2-гидрокси-муконовой кислоты (2ГМПА) - носит линейный характер и скорость реакции прямопропорциональная количеству микробных клеток в реакционной смеси (рис. 9). После осаждения клеток в надосадочной жидкости отсутствовала активность К230, но присутствовал продукт реакции - 2ГМПА, окрашивающий реакционную смесь в желтый цвет ( -Я-макс = 375 нм). Это указывает на то, что субстрат реакции - катехол, должен проникать в клетки, ферментативная реакция протекает внутри клеток, а продукт реакции - 2ГМ0А выходит в среду. Изучение зависимости скорости реакции от концентрации субстрата показало, что в случае интактных клеток максимальная скорость реакции достигается при концентрации 80...90 мкМ катехола, а в условиях бесклеточного экстракта - при 30...40 мкМ (рис. 10). Определение активности К230 при концентрации катехола в клеточных суспензиях ниже 10 мкМ оказалось невозможным. С другой стороны, кинетика этой реакции не изменялась даже при 300-кратном избытке субстрата, указывая, тем самым, что в наших условиях определения активности К230 концентрация катехола не лимитирует скорость реакции.
