Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. Биохшлические свойства никотиновых рецеп торов ацетилхолина 100
а) Нейро-мышечные нАХР 10
б) нАХР нервной системы позвоночных . 15
в) нАХР нервной системы беспозвоночных . 21
Заключение 25
2. Современные подхода к изучению участка узнавания нАКР 26
а) Метод химической модификации 26
б) Химико-фармацевтический подход к изучению участка узнавания нАХР 36
Заключение 49
ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 52
ГЛАВА Ш. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
1. Идентификация участков связывания Ч-Щ и С-ТК в мембранных препаратах ЗГК . 63
2. Фармакологические и биохимические свойства нАХР ЗГК 64
а) рН-зависимость специфического связывания Ч-Щ и С-ТК с мембранными препаратами
ЗБ 64
б) Изучение стабильности специфического связывания Ч-Щ и 14С-ТК 67
в) Фармакологические свойства нАХР ЗГК . 67
г) Анализ содержания углеводных остатков в нАЯ ВТК 71
3. Анализ конформаций соединений, взаимодействующих с нАХР ВТК 72
4. Химическая модификация нАХР ЗІК 75
ГЛАВА ІV. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 84
ВЫВОДЫ 114
ЛИТЕРАТУРА 116
- Нейро-мышечные нАХР
- МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
- Идентификация участков связывания Ч-Щ и С-ТК в мембранных препаратах ЗГК
- ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Введение к работе
Актуальность проблемы. Многочисленными физиологическими, электрофизиологическими и биохимическими исследованиями установлены общие принципы передачи нервного сигнала через химические синапсы. Одной из центральных стадий передачи сигнала является взаимодействие низкомолекулярных веществ - медиаторов, одним из которых является ацетилхолин, с участком узнавания рецептора, расположенного на постсинаптической мембране, что приводит к изменению ее ионной проницаемости.
Актуальность изучения участка узнавания холинергических ли-гандов обусловлена тем, что знание механизмов управления хемо-возбудимым каналом - одним из центральных звеньев передачи нервного импульса, позволит глубже понять молекулярные основы нервной регуляции, найти общие черты и различия между рецепторами и каналами разной специфичности. Кроме того, участок узнавания холинергических рецепторов является мишенью для ряда белковых токсинов, алкалоидов, лекарств и отравляющих веществ, поэтому сведения о структуре узнающего участка являются необходимыми для более эффективного лечения патологических состояний, затрагивающих холинергическуто передачу, разработки принципов борьбы с токсическими веществами и направленного синтеза лекарственных препаратов.
В настоящее время наибольшие успехи достигнуты в изучении нейрочшшечных никотиновых рецепторов ацетилхолина (нАХР) /I/. В частности, было показано, что участок узнавания холинергических лигандов расположен на n-концевом фрагменте <* -субъединицы рецептора. В состав участка узнавания входит карбоксильная группа и вблизи находится дисульфидная связь, необходимая для поддер- жания функционально-активной конформации рецептора. нАХР зрительных ганглиев кальмара (ЗГК) относится к малоизученному типу никотиновых рецепторов ЦНС. Работы по исследованию этого типа рецепторов, отличающихся по своим фармакологическим признакам, в первую очередь, по сродству к <*-нейротоксинам змей и декаметонию, от нейро-мышечных рецепторов, развернулись только в последние годы и не вышли за рамки описания фармакологических и некоторых биохимических свойств. Сведения же о строении участка узнавания никотиновых рецепторов центрального типа практически отсутствуют.
Цель и задачи работы. Целью настоящей работы явилось изучение особенностей строения участка узнавания хшпшергических ли-гаидов нАХР центральной нервной системы на примере холинорецепто-ра зрительных ганглиев кальмара.
Учитывая современное состояние проблемы и исходя из цели исследования были поставлены следующие задачи:
Изучить фармакологические и биохимические свойства нАХР зрительных ганглиев кальмара.
Определить структурные особенности соединений, действующих на нАХР, с целью формирования представлений о строении его участка узнавания.
С помощью метода химической модификации выявить аминокислотные остатки и функциональные группы рецептора, участвующие в связывании холинергических соединений.
Результаты исследования и их новизна. В результате проведенных исследований было показано, что: І. В зрительных ганглиях кальмара (ЗГК) присутствуют нАХР, нечувствительные к «*-нейротоксинам змей и декаметонию. _ 7 -
Антитела к нАХР электрического органа т. marmorata не блокируют связывание холинергических лигандов с нАХР ЗГК. В рецепторном комплексе содержатся углеводные остатки, специфично связывающие конканавалин А; в субъединице, несущей участок узнавания, такие остатки отсутствуют. Морфин и налоксон обладают относительно высоким сродством к нАХР ЗГК, в то время как лей-энкефалин не взаимодействует с этой рецепторной системой.
Агонисты никотиновой специфичности обладают общей конформаци-ей, при которой совпадают не только расстояние между нуклео-фильным атомом и аммонийной группой лиганда, составляющее 0,5 нм, но и направление взаимодействия нуклеофильного атома с соответствующей группировкой рецептора. Это позволило построить трехмерную модель участка узнавания нАХР. Модификация остатков цистеина, метионина и гистидина не приводит к падению специфического связывания ^-метилцитизина (%-Щ) и 14С-тубокурарина (14С-ТК).
Модификация, направленная по карбоксильной группе, и нитрование остатков тирозина вызывают полную инактивацию специфического связывания.
Модификация по шлиногруппам и остаткам аргинина приводит к ин-гибированию Ъ0% специфического связывания ті-Щ; ингибирование связывания 14С-ТК составляет, соответственно, 100$ и 50$. Добавление никотина в реакционную среду препятствует ингибиро-ванию специфического связывания "тН-Щ после модификации по остаткам тирозина, аргинина и карбоксильным и аминогруппам. Добавление никотина не предотвращает падения специфического связывания С-ТК после модификации по аминогруппам и остаткам аргинина.
Результаты, описанные в пунктах 2-Ю, получены впервые. Результаты, полученные в пункте I, частично воспроизводят результаты, описанные в литературе, и дополняют их. Целесообразность проведения дополнительных экспериментов обусловлена противоречивостью экспериментальных данных, полученных разными авторами.
Совокупность полученных в работе результатов позволила сформулировать вывод о том, что в 3IK присутствует две субпопуляции участков связывания холинергических лигандов, близких по фармакологическим свойствам и отличающихся химическим строением. В состав участков узнавания I субпопуляции входят остатки тирозина, аргинина и карбоксильные группы. В состав П субпопуляции входят остатки тирозина, лизина и карбоксильные группы. Вблизи участков узнавания находится аминогруппа, важная только для связывания С-ТК. На основании анализа полученных результатов предложена модель строения участков узнавания нАХР ЗГК.
Дтш решения задачи исследования были использованы два, ранее существовавших независимо, подхода - направленная по определенному аминокислотному остатку белка химическая модификация и анализ конформаций лигандов с целью реконструкции участка узнавания.
Новым элементом является также то, что впервые на уровне мембранно-связанного препарата было исследовано участие в связывании холинергических лигандов всех аминокислотных остатков рецептора, модификация которых возможна в неденатурирующих условиях.
Научно-практическая ценность. В работе на основании анализа результатов исследования структурных особенностей лигандов никотиновой специфичности и влияния направленной химической модификации на специфическое связывание агонистов и антагонистов была проведена реконструкция участков узнавания НІШ? ЗГК и показана их ге- терогенность. Полученные результаты позволяют приблизиться к пониманию молекулярных механизмов функционирования относительно малоизученных нАХР ЦНС, нечувствительных к ос-нейротоксинам змей и декаметонию.
Разработанная методика направленной химической модификации мембранно-связанных препаратов рецептора позволяет в достаточно мягких условиях определять функциональную важность и проводить достаточно строгую локализацию таких аминокислотных остатков, как лизин, аргинин, тирозин, метионин, гистидин, аспарагиновая и глутаминовая кислота, и может использоваться для исследования участков узнавания других рецепторних систем. Кроме того, была продемонстрирована высокая эффективность метода химической модификации для выявления гетерогенности рецепторних систем.
Предложенная трехмерная модель участка узнавания нАХР позволяет просто и эффективно проводить предварительную оценку способности того или иного соединения взаимодействовать с ацетилхолино-выми рецепторами никотиновой специфичности. Кроме того, она может облегчить направленный синтез соединений никотиновой специфичности, в том числе холинолитиков и холиномиметиков преимущественно центрального типа действия, проблема создания которых является одной из горячих точек современной фармакологии.
Нейро-мышечные нАХР
Около десяти лет назад начался новый период в истории изучения холинорецепции. Появилась реальная возможность выделения хо-линорецепторного белка и тщательного изучения его биохимических свойств in vitro . Этот качественный скачок стал возможен благодаря удачному выбору объекта исследования - электрического органа рыб, предложенного Нахманзоном /2/, и использованию уникальных по своей специфичности к нейро-мышечным нАХР инструментов - .-нейротоксинов змей семейства аспидовых. Эти нейротоксины, введенные в практику лабораторных исследований Ли /3/, нашли широкое применение в целях характеризации, выделения и очистки нАХР из различных источников /4-8/.
Электрический орган представляет собой производное мышечной ткани со значительно иннервированной поверхностью, образующей области постсинаптических контактов /9/. За счет этого упрощается выделение мембранно-связанных и солюбилизированных рецепторов, содержание которых составляет около 1300 пмоль/г ткани. Содержание никотиновых рецепторов ацетилхолина в поперечнополосатых мышцах животных значительно меньше и колеблется от 6 пмоль/г ткани для нормальной до 80 пмоль/г ткани для иннервированной мышцы /Ю/.
Итоги изучения нейро-мышечных нАХР изложены в ряде обзоров /1,5,11-13/, ниже будут приведены их основные структурные и функциональные характеристики.
Совокупность результатов биохимических и физико-химических экспершлентов доказывает, что нАКР являются интегральными мембранными белками /II/. Шкромолекулярный комплекс нАХР из электрического органа образован пятью белковыми субъединицами, две из которых являются эквивалентными, и имеет субъединичную формулу c/Z , р.
Материалы и методы
Выделение мембранного препарата нАХР ЗГК проводили по модифицированной Котелевцевым /107/ методике Виттакера /181/. Солю-билизадию периферических мембранных белков и отмывку АХЭ проводили ступенчатой отмывкой 0,6 М KCI и 0,6 М KI в 50 мМ трис-НСІ, рН 7,4. Осадок ресуспендировали в 10 объемах буфера А и центрифугировали в роторе JA -14 (" васктап ", ФРГ) 20 мин при 18000 g Осадок (препарат I) собирали и хранили при -70С.
Получение мембранного препарата нАХР из электрического органа Т. marmorata проводили ПО общепринятой МЄТОДИКЄ /182/.
Синтез N-43-Jдетилцитизина. К I мг цитизина (5,3 мкмоль), растворенному в 2 мл нитрометана, добавляли 0,38 мкмоль -метил-иодида (ІЗ Ки/ммоль) в 2 мл абс. бензола, запаивали в ампулу под азотом и выдерживали в течение 3-х суток при комнатной температуре. Затем раствор упаривали на роторном испарителе, добавляли I мл абс. этанола и вновь упаривали. Операцию повторяли дважды. Н -МЦ выделяли с помощью тонкослойной хроматографии на силикат е-ле в системе бензол/триэтиламин (1:1). В этой системе N -метилцитизин имеет Rf = 0,6. Зону, содержащую її -МЦ, вырезали, продукт элюировали метанолом. Выход по внесенной радиоактивности 1Ь%.
Синтез 3(5)-азидо-N -метилцитизина. 0,43 мг (2,3 мкмоль) 3-(5)-азидометилцитизина, полученного по методике /108/, растворяли в I мл абс. нитрометана и прибавляли 0,2 мкмоль ІЗ-метил-иодида (13 Ки/ммоль) в I мл абс. бензола. Раствор запаивали в ампулу под азотом и выдерживали 3 суток при комнатной температуре. Затем раствор упаривали под вакуумом, добавляли I мл абс. этанола и вновь упаривали. Операцию повторяли дважды. 3(5)-азидо- N-%-метилцитизин выделяли с помощью тонкослойной хроматографии на силикагеле в системе хлороформ/метанол (33:1) (3 5)-азидо- N-метилцитизин имеет R= 0,75). Зону, содержащую радиоактивный продукт, вырезали и экстрагировали 3(5)-азидо-ы - -метилцитизин метанолом. Выход по внесенному -метилиодиду - 68%.
Идентификация участков связывания Ч-Щ и С-ТК в мембранных препаратах ЗГК
Идентификацию и характернеацию участков связывания С-ТК и Тї-Щ в мембранных препаратах ЗГК проводили методом равновесного радиолигандного анализа. Выбор радиоактивных лигандов определялся тем обстоятельством, что Тї-Щ является агонистом, а С-ТК - антагонистом нАХР /188/, что представляло возможность для более глубокого изучения молекулярных механизмов взаимодействия лигандов с участком узнавания рецептора.
Определение связывания Чі-Щ и С-ТК с мембранными препаратами ЗГК проводили методом центрифугирования, поскольку применение метода фильтрации в случае С-ТК невозможно из-за высокой неспецифической сорбции последнего на стекловолокнистых фильтрах /189/. Суспензию мембранного препарата инкубировали в течение 30 мин в присутствии радиоактивных лигандов, после чего центрифугированием отделяли свободный лиганд от присоединившегося к мембранным частицам. Количество последнего определяли по убыли радиоактивного лиганда в супернатанте. Параллельно измеряли неспецифическое связывание лигандов, которое соответствовало их связыванию в присутствии 10 М никотина. Разность радиоактивности в супернатанте в пробирках, содержащих и не содержащих никотин, соответствовала специфическому связыванию.
Результаты, полученные при измерении зависимости специфического связывания Тї-Щ и С-ТК от концентрации внесенного радиоактивного лиганда, трансформированной в координатах Скетчарда /190/, свидетельствуют, что в мембранных препаратах ЗГК присутствуют участки специфического связывания %-Щ, характеризующиеся Кд = 53+9 нМ и С-ТК (% = 210+30 нМ), причем число этих участков совпадает и составляет 22+3 пІД/r ткани (рис. 6). Специфическое связывание С-ТК и ЧВ-Щ возрастало с увеличением концентрации лигандов, достигало насыщения и описывалось гиперболической зависимостью типичной изотермы адсорбции. При концентрации лигандов, близкой к насыщению, специфическое связывание было пропорционально концентрации белка в пробе.
Обратимость связывания подтверждалась тем, что мембранные препараты, предварительно уравновешенные с 14С-ТК или "%-Щ, после трехкратной отмывки полностью восстанавливали свою способность связывать радиоактивные лиганды.
Обсуждение результатов
Несмотря на значительные успехи, достигнутые при изучении никотиновых рецепторов ацетилхолина, в особенности нАХР из электрических органов рыб (см. обзор литературы), сведения о строении участка узнавания рецептора и молекулярных механизмах лиганд-ре-цепторных взаимодействий носят фрагментарный характер. Точная локализация и состав аминокислотных остатков, входящих в участок узнавания, НеИЗВеСТНЫ Даже ДЛЯ НАХР ИЗ ЭЛеКТрИЧеСКОГО Органа Torpedo caiifornic хотя полная аминокислотная последовательность всех субъединиц рецептора была определена с помощью генетических методов еще два года назад /31-33/. До сих пор представления о строений участка узнавания рецептора возникали из двух подходов. Первый - это традиционный химико-фармацевтический подход, основывающийся на сравнительном изучении особенностей строения соединений, взаимодействующих с рецептором, и их физиологической активности in vivo и in vitro /153,194/. Второй метод заключается в химической модификации аминокислотных остатков рецептора с последующим определением влияния такой обработки на физиологическую активность рецептора /II/. Существенным недостатком, снижающим потенциальные возможности этих методов, является то, что и физиологические испытания огромного числа синтетических соединений, обладающих никотиновой специфичностью, и химическая модификация проводились, как правило, на объектах из разных источников, что крайне затрудняло обсуждение результатов. Дополнительную неопределенность вносили видовая специфичность и гетерогенность никотиновых рецепторов ацетилхолина.
Особенностью подхода, примененного в настоящей работе, является то, что для достижения цели исследования - изучения особенностей строения участка узнавания холинергических лигандов нАХР ЩС - комплексно и на одном объекте были использованы биохимические методы, химико-фармацевтический подход и метод химической модификации. Следует особо подчеркнуть, что была изучена функциональная важность всех аминокислотных остатков, модификация которых возможна в неденатуриругощих условиях.
Эксперименты были выполнены на мембранных препаратах ЗГК, обогащенных АХР. Это, с одной стороны, способствовало сохранению функциональной активности рецептора, поскольку, будучи интегральным мембранным белком, нАХР частично изменяет свое сродство к холинергическим лигандам после солгабшшзации /51,52/, а с другой стороны, позволило упростить методику радиолигандного анализа, использовав для этого метод центрифугирования. Кроме того, мембранное окружение в какой-то мере защищало рецептор от неблагоприятного воздействия условий химической модификации и самих модифицирующих агентов.
