Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы . 17
1.1. Классификация жидких кристаллов . 17
1.2. Кооперативность и фазовые переходы . 22
1.3. Биологические мембраны: структура и функции 35
1.3.1. Структура мембран . 35
1.3.1.1. Липидный состав . 36
1.3.1.2. Мембранные белки . 39
1.3.1.3. Асимметрия мембран . 40
1.3.1.4. Жидкостно-мозаичная модель мембран 41
1.3.2. Функции мембран . 43
1.3.2.1.Пассивная диффузия . . 43
1.3.2.2. Облегченная диффузия . 45
1. 3. 2. 3. Активный транспорт ионов: Na+, К+ - АТФаза свойства и биологическая роль . 47
1.3. 2.4. Транспорт глюкозы . 54
1.3.2.5. Ацетилхолинэстераза (АХЭ) . 56
1.4. Структурно-функциональные изменения клеточных мембран в патогенезе рассеянного склероза и некоторых других заболеваний ... 58
1. 5. Прогрессирующая мышечная дистрофия . 62
1.6. Структура липопротеинов и их функции . .63
1.6.1. Липопротеины очень низкой плотности (ЛПОНП) 65
1.6.2.Липопротеины низкой плотности (ЛПНП) 66
1.6.3. Липопротеины высокой плотности (ЛПВП) 71
1.7. Аполипопротеины 80
1.7.1. Аполипопротеины A-I, А-П, В 80
1.7.2. Взаимодействие апоА-I с фосфолипидами 81
1.7.3. Кинетика комплексообразования аполипопротеинов с липидами 84
1.8. Взаимодействие липопротеинов с клеточными мембранами ...
86 1.9. Резюме 91
ГЛАВА 2. Материал и методы исследований 96
2.1. Приготовление эритроцитов и их «теней» . 96
2.2. Выделение липопротеинов 96
2.3. Хроматографические методы 97
2.4. Электрофорез ... 97
2.5. Вискозиметрия 98
2.6. Определение удельной электропроводности 99
2.7. Способ определения кинетических характеристик Na+, К+-АТФазы с помощью интерферометрии . 100
2.8. Способ определения кинетических характеристик ацетилхолинэстеразы с помощью интерферометрии 104
2.9. Способ определения скорости транспорта глюкозы с помощью интерферометрии . . 106
2.10. Термический анализ . 109
2.11. Определение коэффициента удельной теплопроводности ПО
2.12. Инфракрасная спектроскопия . 112
2.13. Клинико-биохимическое исследования . 115
ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований 119
3.1. Исследование термодинамических, реологических и оптических свойств эритроцитарных мембран в области физиологической температуры 119
З.І.І.Термодинамические свойства 120
3.1.2.Коэффициент поверхностного натяжения 126
З 1.З.Изменение реологических свойств под влиянием температуры 129
3.1.4,Оптические свойства 132
3.1.4.1. Изменение показателя преломления взвесей эритроцитов и их «теней» в зависимости от температуры . 132
3.1.4.2. Применение ИК-спектроскопии для исследования механизмов структурных изменений эритроцитарных мембран при воздействии температуры 136
3.2. Некоторые механизмы структурных изменений эритроцитарных мембран при изменении рН среды. 139
3.3. Влияние структурных фазовых переходов в эритроцитарных мембранах на активность некоторых ферментов: 150
3.3.1. Na+, К+-АТФаза 150
3.3.2. Ацетилхолинэстераза . 154
3.3.3. Скорость ноглощения глюкозы эритроцитами по изменению коэффициента преломления 157
3.4. Роль спектрина в фазовых переходах эритроцитарных мембран . 159
3.5. Изменение структуры мембран эритроцитов и активности Na+,K+-ATOa3bi у участников советско-канадского трансарктического лыжного перехода 165
3.6. Структурно-функциональные изменения клеточных мембран в патогенезе рассеянного склероза и некоторых других заболений : ...173
3.6.1. Изменение реологические свойств мембран эритроцитов у больных рассеянным склерозом и некоторых других заболений . 173
3.6.2. Активность Na+, К+-АТФазы «теней» эритроцитов у больных PC. ... 177
3.6.3. Активность АХЭ эритроцитов у больных PC. 182
3.6.4. Сравнительный анализ активности Na+,K+-ATOa3bi, АХЭ и вязкости взвесей эритроцитов при всех типах течения PC . 185
3.6.5.. Изменение реологических свойств эритроцитов у больных острым инфарктом миокарда. 190
3.7. Аномальное изменение вязкости в липопротеинах плазмы крови человека и крыс в области физиологической температуры. 194
3.8. Аномальное изменение удельной электропроводности в липопротеинах в области физиологической температуры. 203
3.9. Структурные изменения в ЛПВП, аполипопротеинах и олигонуклеотидах при взаимодействии с биологически активными соединениями 211
3.9.1.Некоторые механизмы взаимодействия кортизола с липопротеинами высокой плотности и аполипопротеином A-I. 211
3.9.2.Взаимодействие тетрагидрокортизола с олигонук-леотидом CC(GCC)3 и мононуклеотидами СМ5'Р и GM5'P. 225
3.9.3. Взаимодействие кортизола с олигонуклеотидом CC(GCC)3 и мононуклеотидами СМ5'Р и GM5'P.. 246
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов исследований 265
Заключение. 297
Выводы. 301
Список литературы 304
- Кооперативность и фазовые переходы
- Активный транспорт ионов: Na+, К+ - АТФаза свойства и биологическая роль
- Способ определения кинетических характеристик Na+, К+-АТФазы с помощью интерферометрии
- Изменение показателя преломления взвесей эритроцитов и их «теней» в зависимости от температуры
Введение к работе
Актуальность проблемы. Структурные переходы в биологических мембранах в диапазоне изменения температур (Т) и рН, имеющих место в организме, представляют большой интерес, так как могут регулировать активность многих ферментов [Jackson W.M.et al.,1973; Островская Т.А., Куницын В.Г. и соавт., 1979; Wallach D.F.H. et al.,1979; Черницкий Е.А. и соавт., 1981; Конев СВ., 1987; Некрасова М.Ф.,1988; Куницын В.Г. и соавт., 1990; Предтеченская Е.В., 1990], ионную проницаемость [Passow Н.1969; Лев А.А.,1975], а также гемолитическую и осмотическую стойкость [Geigy D.,1970; Рощупкин Д.И., Владимиров Ю.А.,1977]. Они выявлены в мембранах эритроцитов и лимфоцитов [Verma S.P.et al.,1976; Куницын В.Г. и соавт., 1978; Куницын В.Г. и соавт., 1979; Wallach D.F.H. et al.,1979; Kunitsyn V.G., 1980; Kunitsyn V.G.,Kamenskaya V.V.,1981; Куницын В.Г. и соавт.,1983; Куницын В.Г. ,1984; Шныров В.Л.,1989; Лапшина Е.А. и соавт.1993], в мембранах ядер и митохондрий [Храповицкий В.П.,1985; Бурлакова Е.Б. и соавт.,1986].
Кроме биологических мембран, одним из примеров надмолекулярных систем являются липопротеины. Большой интерес исследователей к липопротеинам (ЛП) плазмы крови связан как со значительной ролью этих уникальных липид -белковых комплексов в развитии атеросклероза , так и с их участием в механизмах нарушения липидного обмена, сопровождающих развитие ряда патологий различной этиологии-диабета, гепатита, D-гиповитаминозов и др.
Структурный фазовый переход в области физиологической температуры, обнаруженный в липопротеинах низкой плотности (ЛПНП) человека , касается тонких изменений структуры липидов, главным образом эфиров холестерина [Deckelbaum R.J.et al.1975; Deckelbaum R.J.et all977]. Этот переход был обнаружен с помощью ренгеноструктурного анализа, микрокалориметрии и поляриметрии. В то время как Dearborn D.G.et al. [1969]; .Scanu A.et al. [1969] обнаружили в ЛПНП частицах только изменение вторичной структуры апоВ. Выявлен излом на кривых зависимости параметра упорядоченности ЭПР-зонда, производного стеариновой кислоты, от температуры в ЛВП3 и в ЛПОНП человека [Панасенко О.М. и соавт.1983; Рууге Э.К. и соавт. ,1983 ]. Авторы относят этот излом к латеральному разделению липидных и белковых фаз в липопротеиновом монослое ЛП, хотя отмечают, что, по-видимому, имеет место модификация структуры аполипопротеинов, так как указанный излом не был зарегистрирован при исследовании липидов, выделеных из ЛПВП2 и ЛПВП3 [Панасенко О.М.и соавт.1983]. В интактных ЛПОНП кролика с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии установлен переход в области 40-42С [ Morriset J.D.et al.,1984 ]. Позднее с помощью ЭПР-зонда (ДСМ) также был обнаружен излом в ЛПНП [ Медведева Н.В. и соавт., 1987]. В то же время в работе Olivier J.L.et al. [1988] с помощью ЭПР-зонда -меченого клофибрата- не было обнаружено особенностей во всех классах ЛП. Известны и другие работы, в которых был зарегистрирован Т-переход в ЛПНП, но при более низкой температуре и в очень широком температурном интервале (AT) [ Kroon Р.А. et al.,1981] . Перечисленные работы касались температурных переходов в липидной части ЛП. Однако работы, связанные с изучением изменения вторичной структуры апоВ в области физиологической температуры, единичны [Dearborn D.G.et al.,1969; Scanu A.et al,1969], а в апоА-I и апоА-П в доступной нам литературе неизвестны. Недостаточно изучены изменения структуры липидов в области фазового перехода и в ЛПВП [ Медведева Н.В. и соавт.,1987 ].
Учитывая определенную общность структуры биологических мембран и поверхностного слоя в ЛП [ Куницын В.Г., 1977; Куницын В.Г. и соавт.1979; Куницын В.Г. и соавт.,1983; Медведева Н.В. и соавт., 1987], полагаем, что и в последних имеет место фазовый переход как в липидах, так и в белках.
Несмотря на большое количество работ, связаных с изучением ЛП и биологических мембран до сих пор остается актуальной задача по выяснению механизма структурных фазовых превращений, обусловленных изменениями как в белках, так и в липидах при значениях температуры и рН близких к физиологическим . Особый интерес представляет взаимодействие гормонов с ЛП или мембранами при изменении температуры.
Большие успехи достигнуты в области изучения белкового компонента ЛП. Расшифрованы первичная и вторичная структуры основных аполипопротеинов, изучены их функции. Имеются сведения о том, что некоторые аполипопротеины принимают участие в процессах , не связанных собственно с обменом ЛП. Высказывается мнение о более универсальной их роли в организме. В частности, представляет большой интерес влияние ЛПВП и комплекса апоА-I с глюкокортикоидами на регуляцию экспресии генов [Панин Л.Е. и соавт. 1988; Иванова Н.Г. и соавт.,1991]. Панин Л.Е. с сотрудниками [1992], впервые обнаружили наличие в хроматине ядер печени крыс апоА-I, апоВ и апоЕ. АпоА- I обнаружен в хроматине ядер различных тканей [ Panin L.E. et al, 2000].
Учитывая, что аполипопротеины и глюкокортикоиды проникают в ядра клеток, представляет несомненный интерес рассмотреть взаимодействие глюкокортикоидов и их комплексов с аполипопротеинами (апоА-I) с ДНК и олигонуклеотидами. Известно, что в ДНК происходят структурные переходы под влиянием воды, солей и т.д. [Малеев В.Ю. и соавт.,1993; Семенов М.А. и соавт.,1996]. Взаимодействие глюкокортикоидов с ДНК мало изучено [Kothekar V.et al., 1988].
Мы полагаем, что изучение структурных фазовых переходов позволит понять тонкие механизмы функционирования биологических мембран и ЛП, а также выяснить особенности влияния ЛП и аполипопротеинов на геном клеток. С другой стороны, моделирование мембранных процессов невозможно без четкого представления механизма взаимодействия в липид-белковых комплексах. Липопротеины являются уникальной естественной моделью липид-белковых комплексов, изучение которых позволит расширить наши представления о механизме структурных переходов в биологических мембранах, и как эти переходы отражаются на функции мембран.
Цель работы. Изучить механизм структурных фазовых переходов в мембранах эритроцитов, ЛП, аполипопротеинах и олигонуклеотидах при воздействии биологически активных веществ (гормонов), сдвигах температуры и рН в физиологическим допустимых пределах, а также показать изменение некоторых функциональных свойств биологических мембран в области структурного фазового перехода.
Задачи исследования:
1. Разработать новые высокочувствительные методы для обнаружения структурного фазового перехода в ЛП, апоА-1, эритроцитарных мембранах и цельных клетках в области физиологической температуры с минимальным нарушением их нативной структуры.
Исследовать механизм структурного фазового перехода в эритроцитарных мембранах в области физиологических изменений температуры.
Изучить кинетические характеристики №+,К+-АТФазы, ацетилхолинэстеразы (АХЭ) в эритроцитарных мембранах, а также скорость поглощения глюкозы эритроцитами в области выявленного структурного фазового перехода.
Исследовать механизм структурных фазовых переходов в ЛПВП, ЛПНП и ЛПОНП в области физиологической температуры.
Исследовать механизм структурного фазового перехода в ЛПВП и апоА-I при совместном воздействии на них температуры и кортизола.
Изучить механизм взаимодействия тетрагидрокортизола и кортизола с олигонуклеотидом CC(GCC)3 и мононуклеотидами СМ5'Р и GM5T как в отсутствии, так и в присутствии апоА-1.
Научная новизна работы. Впервые показано, что температурные зависимости удельной электропроводности и вязкости ЛПВП, ЛПНП, ЛПОНП и апоА-1 человека и крыс аномально изменяются в области Т=35-38С. Наличие аномальной области на температурных зависимостях удельной электропроводности и вязкости ЛПВП, ЛПНП, ЛПОНП и апоА-1 человека и крыс связано со структурным фазовым переходом как в аполипопротеинах, так и в фосфолипидах. Вычислена энергия активации, энтальпия перехода и температурный коэффициенты а и г\, в силу малости энтальпии перехода в ЛПВП и в ЛПОНП сделано заключение, что в фосфолипидах и липидах этих частиц имеют место ориентационные переходы типа смектик А-»С и смектик-»холестерик соотвественно, относящиеся к фазовому переходу второго рода. Структурный фазовый переход в апоА-1 в силу малости энтальпии перехода , а также в связи с изменением симметрии и теплоемкости (клубок —»а-спираль, клубок ->Р-структура переходы), содержит элементы фазового перехода первого и второго рода.
Установлено, что стероидный гормон кортизол значительно увеличивает упорядоченность апопротеинов в ЛПВП, изменяя его вторичную структуру (клубок —»а-спираль и клубок—»р-структура переходы), а также увеличивает упорядоченность липидов, в частности, фосфолипидов. Увеличение упорядоченности апопротеинов и фосфолипидов приводит к увеличению энтальпии перехода в 13 и более раз, что свидетельствует об увеличении межмолекулярного взаимодействия между апопротеинами и липидами в ЛПВП частицах.
Впервые установлено, что температурные зависимости вязкости, поверхностного натяжения, удельной электропроводности, коэффициента преломления, кривых охлаждения и коэффициента удельной теплопроводности мембран эритроцитов и цельных клеток имеют аномальную область в области физиологической температуры, что обусловлено структурным фазовым переходом. Установлено, что наблюдаемый структурный фазовый переход связан с изменением вторичной структуры ( клубок ->а-спираль, клубок-»Р-структура и а-спираль ->р~структура переходы), а также с изменением упорядоченности фосфолипидов. Причем в фосфолипидах мембран вероятен фазовый переход типа смектик А-»С, подобно липопротеинам. Выявлено регуляторное действие структурного фазового перехода на некоторые функции мембран, в частности, Na+, К+-АТФазу, АХЭ и скорость поглощения глюкозы.
Исследовано взаимодействие кортизола и тетрагидрокортизола с олигонуклеотидом CC(GCC)3 и мононуклеотидами СМ5Т и GM5T.
Установлено, что оба гормона взаимодействуют с олигонуклеотидом по трем функциональным группам с образованием водородных связей:
1)NH или СО связям основания цитозина, 2)РОг-группой,
3)ОН-связью дезоксирибозы
Взаимодействие гормонов с олигонуклетидом приводит к увеличению упорядоченности олигонуклеотида внутри цепи, а также способствует образованию двуцепочечной спирали, т.е. имеет место структурный переход типа порядок—» порядок. АпоА-І в комплексе с ТГК и олигонуклеотидом разрушает вторичную структуру олигонуклеотида, т.е. вызывает переход типа спираль—жлубок.
Предложены новые методы регистрации структурных фазовых переходов (интерферометрия, вискозиметрия, термический анализ, определение коэффициента удельной теплопроводности, кондуктометрия ) в биологических мембранах, липопротеинах и апоА-1 в области физиологической температуры и рН, а также способы определения кинетических характеристик Ш+,К+-АТФазы, АХЭ в «тенях» эритроцитов и скорости утилизации глюкозы во взвесях с малым количеством эритроцитов.
Теоретическая и практическая значимость работы.
Нами . выявление изменение вторичной структуры в мембранных белках, ЛП и упорядоченность фосфолипидов, свидетельствующие об изменении симметрии, теплоемкости, параметра порядка в биологических мембранах и ЛП, что согласуется с механизмом структурных фазовых переходов в физике твердого тела (ферромагнетизм, сверхпроводимость), в жидкостях (сверхтекучесть) и жидких кристаллах в силу универсальности их законов.
Впервые вычислены величины энтальпии перехода в ЛПВП и ЛПОНП. Небольшая величина перехода в области физиологической температуры позволяет сделать заключение об ^ А—>С и смектик—»холестерик -переходах в фосфолипидах и липидах. В силу подобия структуры ЛП и мембран можно заключить, что и в биологических мембранах подобные переходы имеют место.
Обнаруженные переходы в апоА-І ЛПВП и в мембранных белках ( клубок —»а-спираль, клубок —»Р-структура переходы) свидетельствуют об общности механизма фазового перехода в этих биологических структурах.
Механизм структурных фазовых переходов в ЛП и биологических мембранах хорошо моделируется структурными изменениями жидких кристаллов. Методы изучения фазовых переходов в жидких кристаллах хорошо применимы как при изучении ЛП, так и биологических мембран.
На основании исследования структурного фазового перехода в области физиологической температуры в эритроцитарных мембранах предложены способы диагностики и прогноза течения инфаркта миокарда и рассеянного склероза .
Основные положения, выносимые на защиту:
При изменении температуры в физиологически допустимых пределах регистрируются структурные фазовые переходы в эритроцитарных мембранах, ЛП и апоА-1.
В основе фазового перехода в эритроцитарных мембранах и в ЛП лежат смектик А—»С и смектик —»холестерик -переходы, а также клубок—» а-спираль, клубок —»р-структура и а-спираль—»Р-структура переходы.
Структурные превращения в ЛПВП и апоА-I под влиянием кортизола приводят, к увеличению энтальпии фазового перехода, как следствие изменения вторичной структуры аполипопротеинов и упорядоченности фосфолипидов.
При добавлении тетрагидрокортизола и кортизола к олигонуклеотиду CC(GCC)3 в нем возникают структурные переходы типа порядок —^порядок. При добавлении к олигонуклеотиду комплекса гормон -апоА-І в нем наблюдается плавление (спираль—жлубок-переход). Предложен новый механизм и схема взаимодействия тетрагидрокортизола (ТГК) и кортизола с олигонуклеотидом CC(GCC)3 и мононуклеотидами СМ5Т и GM5T, раскрывающие влияние апоА-1 совместно с ТГК на вторичную структуру олигонуклеотида.
Фазовые переходы в эритроцитарных мембранах, наблюдаемые при физиологически допустимых сдвигах Т и рН, изменяют кинетические характеристики Na+,K+-ATOa3bi, АХЭ и скорость поглощения глюкозы эритроцитами.
Предложены новые методы изучения фазовых переходов в биологических мембранах, цельных клетках, ЛП и макромолекулах, а также новые способы определения кинетических характеристик Na+,K+-АТФазы, АХЭ в «тенях» эритроцитов и скорости поглощения глюкозы во взвесях эритроцитов в малом количестве клеток, максимально сохраняющие нативность биологических структур.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на IV Всесоюзной Енисейской биофизической конференции (Красноярск, 1978), Международной конференции по квантовой химии, биологии и фармакологии (Киев, ИТФ,1978), Всесоюзном IV биохимическом съезде (Ленинград, 1979), Первом биофизическом съезде ( Москва, 1982), представлены в трудах Международной теоретической биохимической и биофизической конференции (Бомбей, 1980), Международном Санибельском симпозиумах по квантовой химии и биологии (Флорида,США, 1980-1982 и 2001); на -5~м Всесоюзном съезда анатомов, гистологов и эмбриологов.-Винница.1986; 8th Intern. Congress on Circumpolar Health. May 20-25,1990; в институте лимфологии CO
РАМН, Материалы научн. конф. 2-4 июня. Новосибирск.-1994; обсуждались на семинарах в институте биорганической химии СО
РАН, Новосибирск и в институте биофизики СО РАН, Красноярск. Публикации. По теме диссертации опубликовано 43 работы.
Диссертация выполнена в соответствии с планом научно-исследовательской работы Государственного учреждения института биохимии СО РАМН (Гос.регистрация № 01.99.000.8290).
Кооперативность и фазовые переходы
В статистической физике рассматриваются 2 вида систем. В первой системе молекулярное взаимодействие мало и им можно пренебречь. Во второй взаимодействие между молекулами настолько велико, что состояние одной молекулы зависит от состояния соседней и систему можно рассматривать только как совокупность взаимодействующих молекул. Такие системы называются кооперативными [Fowler V. et al..l939].
В настоящее время принято считать , что кооперативные свойства присущи конденсированной ( твердой, жидкой, но не газообразной) фазе и связаны с существованием в ней «сети» слабых нековалентных взаимодействий.
Кооперативные системы обладают двумя биологически значимыми качествами: эффектами дальнодействия и фазовыми переходами. Дальнодействие проявляется в том , что точечное (локальное) возмущение в каком -либо участке системы (мембраны, ЛП, ДНК) передается по физическому механизму на значительные внутри- и межмолекулярные расстояния, изменяя состояние другой молекулы или части молекулы (например, ДНК), первично не затронутой возмущением.
Особенно ярко кооперативность проявляется при фазовых переходах, частным случаем которых служит изменение агрегатного состояния вещества. Фазовый переход представляет собой скачкообразную общесистемную реорганизацию топографии и (или) сил взаимодействия атомов, ионов, молекул, наступающий в момент достижения критической интенсивности воздействия, например, температуры. В зависимости от того, первое или второе производное термодинамического потенциала испытывает разрыв при фазовых превращениях, различают фазовые переходы первого и второго рода соответственно.
При фазовых переходах первого рода скачком изменяется энтропия, энтальпия , плотность, объем. В точке перехода происходит поглощение или выделение скрытого тепла, а температура и давление остаются постоянными. Следовательно, исходя из соотношения AH=TAS , где АН и AS- изменения энтальпии и энтропии в процессе перехода, Т-температура перехода, можно определить один из параметров, зная два других. К фазовым переходам первого рода относятся все агрегатные превращения (плавление, испарение и т.д.), переходы между кристаллическими состояниями кристалл-жидкий кристалл [ Ландау Л.Д. и соавт.,1976] , денатурация белков и нуклеиновых кислот [ Волькенштейн М.В.,1978].
При фазовых переходах второго рода скачок испытывают вторые производные химического потенциала (д ц/ЗТ )р= Ср/Т, (dVdP2)T=(dV/3P)T и д2[і/д?дТ= (3V/3T)P, т.е. скачок испытывают теплоемкость, сжимаемость и коэффициент объемного расширения сответственно. В то время как термодинамические функции (энтальпия, энтропия и объем) остаются неизменными. В точке перехода отсутствует расслоение на фазы, возникновние нового свойства происходит сразу во всем объеме с одновременным изменением симметрии системы. Например, переход феромагнетика в парамагнетик, гелия в сверхтекучее состояние [Ландау Л.Д., Лифшиц Е.М., 1976 ].
Следует подчеркнуть, что обе составные части биологических мембран-белки и липидный бислой обладают как дальнодействием, так и способностью к фазовым переходам [Конев СВ. и соавт.1970; Krizan J.E.et al.,1973; Lee A.G.,1977; Куницын В.Г.,1977 ; Куницын В.Г. и соавт.1978; Волькенштейн М.В.,1978 ; Куницын В.Г. и соавт.1979; Конев СВ., 1987].
В качестве примера передачи информационного сигнала на большие расстояния по системе белок-белковых взаимодействий заслуживает внимания работа [Borovikov U.V.et al.,1982]. При связывании тяжелого меромиозина с фибриллярным актином обнаружено изменение поляризации флуоресценции триптофановых остатков актина при молярном соотношении меромиозин -мономер актина 1:10 и ниже. Эффект отсутствовал, если F-актин обрабатывался глутаровым альдегидом. Вазина А.А. на основании ренгеноструктурного анализа структуры мышцы в процессе функционирования предложила модель мышцы как лиотропного жидкого кристалла. Согласно этой модели, именно силы дальнодействия в сократительной единице, состоящей из одной миозиновои и трех актиновых нитей, генерируют механическое напряжение [ Вазина А.А.,1983].
У белков хорошо выражена способность к кооперативным структурным переходам, наблюдаемая при денатурационных процессах [ ЖоллиМ, 1968]. При объединении отдельных молекул белков в надмолекулярную структуру типа природных комплексов возможно появление кооперативных свойств у тех биополимеров, которые в отдельности ими не обладают. Так, у некоторых индивидуальных гистонов парциальная теплоемкость при 20С очень высока и близка к 0,5 кал/г град, что сопоставимо с теплоемкостью денатурированных белков. В этих молекулах содержание а-спиральных участков крайне незначительно. Иная картина наблюдается при объединении гистонов в октамеры, свойственные хроматину, при этом возрастает степень а-спиральности, снижается парциальная теплоемкость и появляется денатурационный пик теплопоглощения, т.е. формируется единая надмолекулярная кооперативная система [ Ахрем А.А. и соавт., 1982] . Второй основной компонент -липиды ЛП и мембран — также обладает и дальнодействием , и способностью к фазовым переходам [Lee A.G.,1977; Куницын В.Г., 1977 ; Куницын В.Г. и соавт., 1978 ;Куницын В.Г. и соавт., 1979; Ивков В.Г., Берестовский Г.Н. ,1981].
В липидном бислое дальний порядок организации определяется прежде всего расположением углеводородных цепей фосфолипидов. Поворот этих цепей вокруг одинарных С-С - связей обычно рассматривается как основной механизм фазового перехода. Для всех фосфолипидов критическая температура фазового перехода (Тс) значительно снижается при гидратации, что свидетельствует о существенной роли воды в определениии кооперативного поведения липидного бислоя [ Джоунс МД982].
Активный транспорт ионов: Na+, К+ - АТФаза свойства и биологическая роль
Транспортные системы можно описывать исходя из числа переносимых молекул и направления перемещения [Alberts B.et al. 1983 ] или в соответствии с тем, как осуществляется перенос - в сторону установления равновесия или против него. В системе унипорта происходит перенос молекулы одного типа в обоих напралениях; в системе котранспорта перенос одного растворенного вещества сопровождается переносом одновременным или последовательным стехиометрического количества другого. В случае симпорта оба вещества перемещаются в одном напралении. Примерами таких систем являются Н+/сахара и Na+/caxapa (глюкоза, галактоза, ксилоза, арабиноза) в бактериях и Ш+/аминокислоты в клетках млекопитающих. В случае антипорта вещества переносятся в противоположных направлениях (например, Na+ в клетку, а Са из клетки).
Молекулы, которые сами не могут пересекать липидный бислой, используют для этого белки-переносчики, с которыми они связываются [Alberts B.et al., 1983 ]. Облегченная диффузия и активный транспорт во многом сходны. Оба процесса осуществляются, по-видимому, при участии специальных белков-переносчиков и для обоих характерна специфичность к ионам, сахарам и аминокислотам. Облегченная диффузия и активный транспорт напоминают взаимодействие между ферментом и субстратом, однако они осуществляются без образования ковалентных связей. На это сходство указывают следующие моменты: имеется специфический участок связывания для растворенного вещества; процесс переноса характеризуется насыщением; процесс характеризуется определенной константой связывания (Км) вещества, сходные по своей структуре с; переносимым соединением, являются конкурентными ингибиторами и блокируют транспорт. Основные различия между облегченной диффузией и активным транспортом состоят в следующем: Облегченная диффузия может осуществляться в обоих направлениях, активный транспорт лишь в одном; активный транспорт всегда идет против электрического или химического градиента и требует энергетических затрат; Некоторые вещества диффундируют через мембрану по электрохимическому градиенту быстрее, чем можно ожидать, исходя из их размеров, заряда или коэффициента распределения. Процесс облегченной диффузии можно объяснить с помощью механизма «пинг-понг» . Согласно этой модели, белок-переносчик может находиться в двух основных конформациях - в состоянии «понг» он экспонирован в раствор с высокой концентрацией вещества, и молекулы последнего могут связываться со специфическими участками. В результате конформационных изменений в белке участки связывания вместе с переносимым веществом экспонируются в раствор с низкой его концентрацией в состоянии «пинг». Этот процесс полностью обратим, и суммарный поток вещества через мембрану определяется его концентрационным градиентом. Скорость, с которой растворенное вещество поступает в клетку, зависит от следующих факторов: Трансмембранного концентрационного градиента; Количества переносчика; Быстроты связывания вещества с переносчиком; Скорости конформационных изменений нагруженного и ненагруженного переносчика. Гормоны регулируют облегченную диффузию, изменяя число молекул переносчиков. Инсулин повышает интенсивность транспорта глюкозы в жировых и мышечных клетках, индуцируя поступление новых переносчиков из некоего внутриклеточного пула [ Mueckler М. et al., 1985]. Он также повышает транспорт аминокислот в клетки печени и некоторых других тканей. Одним из многих эффектов глюкокортикоидов является повышение транспорта аминокислот в печень, где они служат субстратом глюконеогенеза. Гормон роста усиливает транспорт аминокислот во все клетки, а эстрогены стимулируют этот процесс в матке [Марри Р. и соавт., 1993
Функциональная единица фермента состоит из 2-х полипептидных цепей: большей (а -субъединица) и меньшей ( Р -субъединица), входящих в состав ферментативного комплекса в соотношении 1:1. Меньшая субъединица пересекает мембрану только 1 раз, в то время как большая - много раз образуя несколько петель (рис.8) [ Болдырев А.А., 1998 ] . При этом оба конца пептидной цепи обращены в цитоплазму. Активный центр фермента также обращен в цитоплазму и доступен для цитоплазматического АТФ. Центры связывания переносимых ионов локализованы в петле между 2-ой и 3-ей спиралями, пронизывающими мембрану. Таким образом, а-субъединица может выполнять функцию насоса независимо от р -субъединицы. Однако оба полипептида образуют компактную глобулу, насквозь пронизывающую мембрану.
Часть Р -субъединицы, которая обращена во внеклеточную среду, несет на себе ковалентно присоединенные углеводные компоненты, которые можно отнести к лектинам - мембранным гликопротеинам, которые отвечают за межклеточное узнавание и адгезию. В процессе белкового синтеза обе субъединицы встраиваются в мембрану одновременно. Существует мнение, что Р -субъединица обеспечивает правильную ориентацию а-субъедицы в мембране.
Способ определения кинетических характеристик Na+, К+-АТФазы с помощью интерферометрии
Электрофорез проводили в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия, использовали трис -глициновый буфер, рН 8,3 при комнатной температуре. Сила тока составляла 10 мА/см [LaemmliU.K et.al.,1970]. Для разделения смеси аполипопротеинов использовали 3%-ный концентрирующий и 12,5%-ный разделяющий гели, содержащие 0,1% SDS. Белковые растворы вносили в ячейки концентрирующего геля по 10-20 мкл.
Белковые полосы визуализировали 0,1% Кумасси G-250 в смеси метанола и 10% водной уксусной кислоты (1:1). В качестве маркеров использовались низкомолекулярные белки: фосфорилазу - 94 кДа, альбумин - 67 кДа, овальбумин - 43 кДа, карбоангидраза - 30 кДа, ингибитор трипсина - 20,1 кДа и лактальбумин - 14,4 кДа "Pharmacia" (Швеция). Выделенные апоА-1, не содержат примесей других белков по данным электрофореза. Вискозиметрия. Для изучения вязкости изотоничный буфер разбавляли бидистиллированной водой в 10 раз. Фракции ЛП исследовали в течение первых 3-5 дней после выделения Концентрацию ЛП определяли по содержанию в них белка [ Lowry О.Н. et al., 1951]. .
Вязкость ЛП и апо A-I определяли с помощью автоматического устройства, разработанного в нашем институте [Куницын В.Г. и соавт., 1997]. Устройство позволяет определять время истечения жидкости через капилляр с точностью до 0,01 сек. Высоту детектора подбирали в зависимости от природы исследуемой жидкости, регулируя напряжение сдвига. В нашем случае высота детектора составляла 20 мм. При диаметре капилляра 0.56 мм. скорость сдвига составляла 2.5 с"1 . Для надежной регистрации аномальной области растворов ЛП их относительная вязкость находилась в пределах 1,2-2 сП. Относительная (динамическая) вязкость определялась по формуле .,1981: Ро t0 (1) где г) о -вязкость воды с учетом поправки на температуру, р0 -плотность и t0 -время истечения воды, tx -время истечения и рх -плотность исследуемой жидкости. Расчет энтальпии вязкого течения проводили по формуле [ Гуль В.Е. и соавт., 1979]: 1ет) = 1еАм+ АН (2), 2,3 RT 101 V NA - постоянная Авогадро; h-постоянная Планка; V- молярный объем; А8 -энтропия активации, не зависящая от температуры; ДН теплосодержание (энтальпия) активации; R-универсальная газовая постоянная; Т-абсолютная температура. Величину АН определяли непосредственно из соотношения (2) : АН_= tga, 2.3R AH=2.3R tg a (3), где tga -тангенс угла наклона касательных на кривой lg г(Т), проведенных по обе стороны от аномальной области . В растворах ЛПВП содержание белка составляло 4 мг/мл., а в ЛПНП и ЛПОНП 1 мг/мл и 0,5 мг/мл соотвественно. Концентрация апоА-I была равна 0,5 мг/мл. Объем пробы для определения вязкости составлял 0,3 мл.Число проб для каждой из исследуемых ЛП составлял более 10. Диализ нативных и нагруженных гидрокортизоном ЛП проводили при 4С в течение 48 ч против разбавленных К+, Na+ -фосфатных буферных растворов. 2.6. Определение удельной электропроводности. Для определения удельной электропроводности изотоничный буфер разбавляли до 0,004 М и 0,0002 М бидистиллированной водой. Фракции ЛП исследовали в течение 3-5 дней после выделени . Концентрацию ЛП определяли по содержанию в них белка [Lowry О.Н. et al.,1951]. В исходных растворах ЛПВП содержание белка составляло 4 мг/мл, а в ЛПНП и ЛПОНП 1 мг/мл и 0,5 мг/мл, соответственно. 102 Устройство для определения удельной электропроводности описано нами ранее [Панин Л.Е., Куницын В.Г. и соавт.,1991]. Кондуктометрическая ячейка разработана Ибрагимовым Р.ИЦ1984]. Условия изучения фазовых переходов в эритроцитарных мембранах и липопротеинах подобраны автором [Куницын В.Г. и соавт.,1993; Куницын В.Г.ТІоляков Л.М.1998 ]. Режим кондуктометрии: 1) платиновые электроды; 2) напряжение в кювете 2 В, 3) частота переменного тока 2000 гц; 4) длина кюветы 1,8 см;объем жидкости, заливаемой в кювету 0,7 мл; 5) содержимое кюветы термостатировали с помощью ультратермостата «U-4» «Germany» в интервале 33-41 С через каждый градус, время инкубации составляло 5 мин. Концентрацию водородных ионов определяли на рН-метре OP-211/l"Radelkis" (Hungary)" с точностью д ±0,05. Энергию активации расчитывали согласно [Капустин А.П.,1978]. Число проб для каждой из исследуемых ЛП составлял более 10. Проведена статистическая обработка результатов, доверительные интервалы на кривых ст(Т) укладываются в пределы размера меток, р 0,05. 2.7. Способ определения кинетических характеристик Na+,K+-AT I a3bi с помощью интерферометрии Существующий способ определения активности аденозинтрифосфотазы основан на определении неорганического фосфора в гемолизате эритроцитов. Фосфор образуется при инкубации гемолизата эритроцитов с АТФ. Активность ЇУ ++-зависимой , Na+, К+-АТФазы определяют вместе в присутствии ионов Mg++, Na+,K+,aKTHBHOCTb Mg++- АТФазы -определяют только с ионами Mg++. Активность Ка+,К+-АТФазы вычисляют как разность между общей активностью и активностью Mg++- АТФазы 103 Реактивы: для определения активности аденозинтрифосфатаз в гемолизатах эритроцитов используются следующие реактивы: 1.0,05 М раствор трис -буфера, рН 7,4 2.93,2 мг MgCl2 в 100 мл трис -буфера,рН 7,4 3.20 дМ КС1, 90 цМ NaCl 5 дМ MgCl2 d 05 мл раствора трис-буфера, рН 7,4 4.Раствор АТФ на трис -буфере, рН 7,4 в 0,5 мл раствора содержится 5 дМ АТФ 5.20% раствор трихлоруксусной кислоты б.Раствор эйконогена: в 100 мл бидистилированной воды содержится 6 г метабисульфита натрия , 0,1 г эйконогена, 1,2 г сульфита натрия 7.5% молибдата аммония в 5 н растворе серной кислоты 8.1% раствор фенофталеина 9.1% раствор гидроксода натрия, свободный от С02 Ю.Стандартный раствор неорганического фосфора: в 100 мл бидистированной воды содержится 0,4389 г КН2РО4; для калибровочной кривой разводят в 20 раз. Методика определения. Кровь брали в количестве 4 мл, в охлажденную пробирку с гепарином. Затем кровь центрифугировали при 3000 об/мин, в течение 15 мин. Эритроциты отделяли от плазмы и 1 мл эритроцитов гемолизировали охлажденной бидистилированной водой (1:4). Через 10 мин после окончания осаждения центрифугировали 15 мин при 3000 об/мин. Определение неорганического фосфата проводится по классическому методу Фиске-Суббароу. Принцип метода Фиске-Суббароу. Неорганический фосфор образует с молибденовой кислотой фосфорно -молибденовую кислоту, которая восстанавливается эйконогеном или другим восстановителем и сернистокислым натрием в молибденовую синь. По степени окраски 104 определяемой колориметрически, вычисляют количество неорганического фосфора [Рубин В.А. и соавт., 1980] Недостатки описанного метода: 1. Значительное количество материала, необходимого для исследования (4 мл крови); 2. Окраска фотометрируемого раствора изменяется во времени; 3. Способ трудоемок и требует много времени. Цель предлагаемого способа: повышение точности, упрощение метода и уменьшение объема пробы для определения кинетических характеристик (Км, VMax) Na+, К+-АТФазы взвесей «теней» эритроцитов. Поставленная цель достигалась следующим путем: процесс гидролиза АТФ Na+, К+-АТФ-азой регистрировался по изменению коэффициента преломления (An) взвесей «теней» эритроцитов в растворе АТФ в зависимости от его концетрации и температуры смеси. Скорость гидролиза АТФ определялась крутизной полученных кривых Ап(С) (тангенсом угла наклона) и Дпмах характеризующим скорость в области насыщения (VMax). Кроме того, определялась костанта Михаэлиса как проекция точки Дпмах/2 на ось абсцисс. Изменение коэффициента преломления регистрировалось с помощью интерферометра Релея (ЛИР-1). Коэффициент преломления определялся с точностью до 5-го знака.
Изменение показателя преломления взвесей эритроцитов и их «теней» в зависимости от температуры
Мы считаем, что для расширения представлений о механизме структурного фазового перехода необходимо привлечение других методов. Одним из таких методов является вискозиметрия. Впервые, этот метод был применен при изучении структурного перехода в эритроцитарных мембранах в области 18-19С. Аномальное поведение вязкости в указанной области температур авторы объясняли изменением «свободного» объема «теней» эритроцитов [Zimmer G., Schirmer U., 1974].
В настоящее время известно множество фактов, указывающих на то, что вязкость отражает степень анизотропии (упорядоченности) жидкокристаллических систем [ Папков СП., Куличихин В.Г.,1977; Капустин А.П.,1978]. Позднее нами было сделано предположение, что аномальное изменение вязкости в биологических мембранах, липид 131
белковых комплексах (липопротеидах) связано с изменением упорядоченности (параметра порядка) в белках и липидах [Kunitsyn V.G.,1980; Куницын В.Г., Хавин П.П. и соавт.,1983; Куницын В.Г.,1984; Kunitsyn V.G et al.,2001 ]. Вследствие изменения анизотропии (упорядоченности) мембран изменяется и их деформируемость (упругие свойства) [Kunitsyn V.G, 1982].
На рис. 15 (а и б ) представлены графики зависимости вязкости взвесей эритроцитов кролика и человека и их «теней» от температуры (34-43С) в норме. Видно, что зависимость г)(Т) имеет излом на кривой и небольшой скачок вязкости. Характер изменения вязкости взвесей от температуры различен по обе стороны от точки перегиба (рис.15). Точка перегиба (Тс) кривых лежит близ 37-38 С, как для эритроцитов, так и для их «теней». Аналитический вид функций г(Т) «теней» у кролика и человека различный, что обусловлено различным содержанием липидов и белков. С другой стороны они подчеркивают различный вид функций по обе стороны относительно точки структурного перехода (Тс). Характерно, что изменения г(Т) «теней» эритроцитов при нагревании отличаются от кривой г(Т) при охлаждении, т.е. зависимость г(Т) носит гистерезисный характер [Куницын В.Г.,1984], что свидетельствует о необратимости процесса изменения структуры под влиянием температуры. Это свойство характерно для неравновесных биологических структур [Волькенштейн М.В.,1978]. С другой стороны явление гистерезиса предполагает доменную и кластерную природу структуры липидов мембран [ Wallach D.F.H. et al, 1979; Ивков В.Г. и соавт.,1982 ].
Изменение вязкости эритроцитарных мембран у человека и аналитический вид функций относительно «излома» для «теней» эритроцитов. 1-«тени» эритроцитов; 2-цельные эритроциты. Температурная зависимость вязкости буферного раствора не имеет особенностей, это гладкая, монотонно убывающая функция (рис.15 с). 134
Результаты исследований термодинамических, реологических свойств и коэффициента поверхностного натяжения во взвесях цельных эритроцитов и их «теней» показали аномальные изменения этих характеристик в области физиологической температуры. Полученные результаты позволили предположить, что такие же аномалии могут быть выявлены и при изучении изменения коэффициента преломления в мембранах эритроцитов в той же области температур. Известно, что коэффициент преломления тесно связан с теплоемкостью и диэлектрической проницаемостью, кроме того он имеет прямо пропорциональную зависимость с плотностью раствора [Мандельштамм Л.И., 1950; Поль Р.В.,1966, Ландсберг Г.С.,1976 ].
На рис.16 представлены кривые зависимости изменения коэффициента преломления от температуры ( An (Т)) для эритроцитов морской свинки, кролика, человека и «теней» кролика. Из кривой 1 видно, что An взвеси эритроцитов человека слабо изменяется в интервале температур 34-37С и 38-42С , а в области 37-38С наблюдается скачкообразное изменение коэффициента преломления. Из кривой 2 видно, что An взвеси эритроцитов кролика мало изменяется в интервале температуры 34-38 С и 39-42 С , а в области 38-39 С ( ДТ=1 С) регистрируется скачкообразное изменение An . Из кривой 3 видно, что An взвеси эритроцитов морской свинки слабо изменяется в интервале температур 34-36 С и 37-42 С , а в области 36-37 С регистрируется скачкообразное изменение коэффициента преломления.
Из кривой 4 видно, что An взвеси «теней» эритроцитов кролика в гипотоническом растворе фосфатного буфера слабо изменяется в интервале температур 34-38 С и 39-42С, а при температуре 38-39С наблюдается скачкообразное изменение. Критические температуры (Тс) переходов регистрируются при 38,5 С для эритроцитов и «теней» кролика, 37,5 С для эритроцитов человека и 36,5 С для эритроцитов морской свинки. На рис 16 (5) представлена зависимость An гемоглобина от температуры. Как видно из рис. 16(5) An не изменяется во всем интервале температур. (Концентрация гемоглобина в растворе была равна концентрации гемоглобина в клетке). Зависимость An буферного раствора от температуры также не имела особенностей.
