Содержание к диссертации
Введение
I. Сравнительная характеристика дуоденазы и химаз, ферментов, структурно родственных химазоподобной протеазе (литературный обзор) 7
1. Дуоденаза, сериновая протеаза эпителиоцитов бруннеровых желез 7
1.1. Локализация и предполагаемая биологическая роль дуоденазы 7
1.2. Молекулярные свойства и структура дуоденазы 9
1.3. Энзиматические свойства дуоденазы 13
2. Химазы тучных клеток 17
2.1. Гетерогенность и биологическая значимость тучных клеток 17
2.2. Тканевая локализация и молекулярные свойства химаз 21
2.3. Структурные особенности химаз 25
2.4. Упаковка и хранение химаз в секреторных гранулах 30
2.5. Активация предшественников химаз 34
2.6. Субстратная специфичность химаз 35
2.6.1. Синтетические субстраты 35
2.6.2. Полипептидные и белковые субстраты 36
2.7. Ингибиторы химаз 41
2.7.1. Синтетические ингибиторы 41
2.7.2. Природные ингибиторы химаз 42
2.8. Физиологическая роль химаз 48
II. Результаты и обсуждение 53
1. Очистка фермента 54
2. Критерии чистоты и молекулярные свойства фермента 58
3. Стабильность фермента 63
4. N-концевая последовательность СЫР 63
5. Влияние рН, температуры и ионной силы на активность фермента 66
6. Субстратная специфичность ChIP 68
6.1. Синтетические субстраты 68
6.2. Природные полипептидные субстраты 71
7. Ингибиторный анализ 76
8. Иммунногистохимическая локализация ChIP 79
III. Экспериментальная часть 85
1. Материалы 85
2. Методы 86
2.1. Очистка химазоподобной протеазы 86
2.2. Определение белка 87
2.3. Определение активности 87
2.4. Определение концентрации фермента 88
2.5. Определение кинетических параметров гидролиза субстратов 88
2.6. Гидролиз белков и пептидов ChIP 89
2.7. Масс-спектрометрический анализ 90
2.8. Гель-электрофорез 91
2.9. Аналитические методы определения ChIP 91
2.10. Определение рН-зависимости ChIP 92
2.11. Ингибирование ChIP 92
2.12. Определение N-концевой последовательности белка 93
2.13. Получение антител к ChIP 93
2.14. Иммуногистохимический анализ 93
Выводы 95
Список литературы 96
Список сокращений 123
- Молекулярные свойства и структура дуоденазы
- Полипептидные и белковые субстраты
- Критерии чистоты и молекулярные свойства фермента
- Определение кинетических параметров гидролиза субстратов
Введение к работе
Протеолитические ферменты (протеазы), в том числе сериновые протеазы, играют важную роль в регуляции многообразных биологических процессов всех живых организмов, осуществляя модификацию биологически активных белков и пептидов и тем самым определяя начало или прекращение физиологических процессов.
Сериновые протеазы широко распространены в природе и присутствуют как в микроорганизмах, так и в высших растениях и животных, включая человека.
Все сериновые протеазы на основании данных об их пространственном строении разделяют на три семейства: химотрипсина, субтилизина и карбоксипептидазы II. Представители этих семейств берут начало от разных эволюционных предшественников и отличаются друг от друга по первичной структуре и пространственной укладке полипептидных цепей. Однако, все сериновые протеазы разными эволюционными путями пришли к одинаковому каталитическому механизму и содержат в активном центре молекулы каталитически активные остатки His, Ser и Asp в идентичной геометрической ориентации.
Семейство химотрипсина включает большое число протеаз из бактериальных и высших организмов и привлекает большой интерес исследователей. В организме они выполняют как деструктивную, так и регуляторную функции: гидролиз белковых компонентов пищи (ферменты поджелудочной железы трипсин, химотрипсин, эластаза,); посттрансляционный процессинг ферментов, гормонов, цитокинов (энтеропептидаза, калликреин, трипсин, гранзим В); участие в каскадных реакциях активации зимогенов ферментов, контролирующих процесс свертывания крови и фибринолиза (плазмин, тромбин, факторы Va, Vila, Villa, IXa.Xa и др.) и системы комплемента (факторы С1г, C1s, I, D). Кроме того, сериновые протеазы этого семейства играют существенную роль в клеточной дифференциации и пролиферации.
Для многих ферментов к настоящему времени хорошо известны энзиматические свойства и выявлены их природные субстраты. Однако, существует ряд сериновых протеаз семейства химотрипсина, изучение которых началось сравнительно недавно. К числу таких ферментов относятся протеазы секреторных гранул гемопоэтических клеток млекопитающих, объединенных в группу так называемых гранзимоподобных протеаз - химазы тучных клеток, катепсин G нейтрофилов, гранзимы цитотоксических Т-лимфоцитов и натуральных киллеров. До сих пор их точная биологическая роль не установлена, но многочисленные данные свидетельствуют о том, что они играют важную роль в иммунном ответе организма, поддержании гомеостаза, развитии ряда патофизиологических процессов. Так, например, для гранзимов А и В из цитотоксических Т-лимфоцитов показано, что они участвуют в запуске апоптических процессов клеток-мишеней, инициируя каскад активации каспаз, важных ферментов апоптоза. Активность катепсина G связана с фагоцитозом - функцией азурофильных гранул, в которых хранится фермент, -. Кроме того, он способен регулировать активную концентрацию цитокинов.
Интерес к изучению гранзимоподобных протеаз клеток гемопоэза не ослабевает, что обуславливается участием ферментов этой группы в жизненно важных процессах организма. Число гранзимоподобных протеаз постоянно пополняется новыми, неизвестными ранее представителями.
Более того, последние данные свидетельствуют о том, что их клеточное происхождение может быть шире и не ограничиваться только клетками иммунной системы, следовательно, расширяется и спектр их действия.
Настоящая работа посвящена исследованию новой сериновой протеазы, структурно близкой гранзимоподобным протеазам (химазоподобнои протеазы), обнаруженной в слизистой дуоденума крупного рогатого скота в процессе систематического изучения ферментов тонкого кишечника млекопитающих, проводимого в лаборатории химии протеолитических ферментов ИБХ. Цель настоящего исследования -получение высокоочищенного препарата фермента, изучение его физико-химических и энзиматических свойств, определение клеточной локализации нового фермента.
Молекулярные свойства и структура дуоденазы
Сопоставление аминокислотных последовательностей дуоденазы [2] и других сериновых протеаз показало, что структурно близкими дуоденазе ферментами являются катепсин G нейтрофилов, большинство гранзимов цитотоксических лимфоцитов, химазы тучных клеток. Все эти ферменты, включая дуоденазу, образуют так называемую группу гранзимоподобных протеаз внутри семейства химотрипсина. Наиболее близкой дуоденазе (85% структурной идентичности) оказалась протеаза тучных клеток 1 овцы (sMCP 1), которая, по-видимому, является структурным аналогом дуоденазы быка.
Как и все родственные ферменты, дуоденаза является мономером (молекулярная масса 26,5 кДа) и характеризуется высоким значением pi ( 10). Дуоденаза активна при щелочных значениях рН, проявляя максимальную каталитическую активность при рН 7,9-8,2. Фермент является гликопротеином с содержанием Сахаров 3,5% [3]. Дуоденаза синтезируется в виде препрофермента, который содержит гидрофобный сигнальный пептид (17 аминокислот) и активационый дипептид GlyLys [10]. Такой же активационый дипептид содержат зимогены sMCP 1 [11], химазы 2 хомяка [12] и катепсина G мыши [13]. Аминокислотная последовательность дуоденазы, выведенная из структуры кДНК, содержит дополнительные аминокислоты в С-концевой области молекулы, которые отсутствуют в зрелом белке. Следовательно, помимо протеолитической активации в N-концевой части молекулы, где удаляется активационный дипептид, дуоденаза подвергается процессингу в С-концевой части, в ходе которого освобождается Lys227. Аналогичным образом подвергается протеолитической активации катепсин G и эластаза нейтрофилов человека [14,15].
В структуре дуоденазы и других гранзимоподобных протеаз можно выделить характерные особенности, присущие только этой группе ферментов. Во-первых, наличие в N-концевой области молекулы высококонсервативного фрагмента в положении +1...+4 (IIGG) и +9...+16 (PHSRPYMA). Во-вторых, содержание трех инвариантных дисульфидных связей Cys42-Cys58, Cys136-Cys201, Cys168-Cys182 (здесь и далее нумерация химотрипсиногена А). Во всех ферментах этой группы отсутствует инвариантная дисульфидная связь Cys191-Cys220 в области активного центра, характерная для большинства сериновых протеаз, в том числе ферментов поджелудочной железы (трипсина, химотрипсина) и плазмы крови.
Первичная специфичность гранзимоподобных протеаз, в основном, определяется природой остатка, занимающего положение 226, тогда как первичная специфичность протеаз группы трипсина определяется природой остатка в положении 189 [16]. В субстратсвязывающем участке дуоденазы положение 226 занимает остаток аспарагиновой кислоты, а в положении 189 находится аспарагин. Таким образом, отрицательно заряженный остаток в положении 226 определяет трипсиноподобную составляющую специфичности дуоденазы. Кроме дуоденазы, такой же или сходной структурой субстратсвязывающего участка обладают протеаза тучных клеток 1 овцы sMCP 1 (Asp226) [11] и катепсин G (Glu226) [17]. Эти ферменты, как и дуоденаза, обладают двойной субстратной специфичностью [18, 19]. При связывании в субстратсвязывающем «кармане» дуоденазы и подобных ей протеаз более выгодное положение занимает Р1-остаток лизина субстрата [20] по сравнению с Р1-остатком аргинина, тогда как для трипсина наблюдается противоположный эффект (предпочтительность аргинина лизину). Структурные особенности субстратсвязывающего участка, обуславливающие химотрипсиноподобные свойства дуоденазы, до сих пор точно не определены.
Молекула дуоденазы имеет принципиально то же пространственное строение, что и все сериновые протеазы семейства химотрипсина (рис. 1) [20]. Дуоденаза состоит из двух доменов, в углублении между которыми находится активный центр фермента, представленный характерной триадой каталитически активных остатков His57, Ser195, Asp102 и субстратсвязывающим участком. Шесть и семь антипараллельных В-складок формируют цилиндрическую структуру двух доменов соответственно. Каждый из доменов содержит одну или две а-спирали. Из всех сериновых протеаз с известным пространственным строением наиболее близким дуоденазе является катепсин G человека.
Полипептидные и белковые субстраты
Химазы, триптазы и карбоксипептид аза А, в отличии от пищеварительных ферментов поджелудочной железы (трипсина, химотрипсина и др.), хранятся в секреторных гранулах тучных клеток в энзиматически активном состоянии, а не в виде зимогенов [69, 103, 104]. Несмотря на то, что концентрация протеаз внутри гранул чрезвычайно высока и может достигать 80-800 рМ [105, 106], ферменты могут находиться в них длительное время, не подвергаясь автолизу и не деградируя другие белковые компоненты гранул. Это объясняется тем, что, во-первых, при кислом значении рН внутри гранул тучных клеток, равном 5,5 [107], химазы относительно неактивны [108], и, во-вторых, они находятся в связанном состоянии с серглициновым протеогликаном, что может стерически затруднять и минимизировать автолиз. Показано, что гМСР1, находясь в ассоциированном состоянии с протеогликаном, остается полностью активной при нейтральных значениях рН в течение нескольких месяцев [109], а препарат фермента в растворе в тех же условиях теряет свою активность за несколько дней [62].
Протеогликаны содержатся внутри секреторных гранул многих гематопоэтических клеток, синтезирующих биологически активные белки. Белковая составляющая протеогликанов представляет собой пептидный кор с молекулярной массой 17-19 кДа, так называемый серглицин. Он содержит участок, богатый остатками серина и глицина и устойчив к действию протеаз [110, 111]. К остаткам серина этого участка ковалентно присоединены различные типы гликозаминогликановых цепей (или гепарин, или хондроитин-сульфаты А, В, D, Е) [112-114]. В мукозальных тучных клетках синтезируются преимущественно протеогликаны с О-связанным хондроитин-сульфатом [115]. В тучных клетках соединительной ткани мыши и крысы находятся гепарин-содержащие протеогликаны [112]. Тучные клетки человека содержат и гепарин, и хондроитин-сульфат Е (табл. 3, 4) [116], хотя химаза человека связывается преимущественно с гепарином [104].
Поскольку химазы при рН 5,5 заряжены положительно, и у них отсутствует гепарин-связывающий участок Trp-Ser-Xrp [117], вероятнее всего они взаимодействуют с отрицательно заряженными гепарином или хондроитин-сульфатом электростатически. Методом молекулярного моделирования трехмерной структуры химаз мыши [91] были идентифицированы положительно заряженные участки на поверхности молекул ферментов, отвечающих за взаимодействие с протеогликанами. Химазы, синтезирующиеся в тучных клетках соединительной ткани и связанные с гепарином (гМСР-1, тМСР-4, 5), имеют по два участка с высокой плотностью положительного заряда (регионы 1 и 2, богатые остатками лизина и аргинина). Эти участки расположены в разных доменах молекулы и удалены от активного центра фермента (рис. 3). Химазы мукозальных тучных клеток, связанные с хондроитин-сульфатом (гМСР-2, тМСР-1, 2), обладают только одним таким участком (регион 2), причем его положительный потенциал меньше, чем у химаз СТТК.
Химаза-9 мыши (тМСР-9) оказалась единственной гранулярной протеазой, обладающей тремя положительно заряженными участками на поверхности молекулы, что дает возможность ферменту образовывать мультимерные комплексы с серглициновыми протеогликанами [85].
При стимуляции тучных клеток химазы попадают во внеклеточную среду путем экзоцитоза в виде макромолекулярного комплекса ( 107 Da) с серглициновым протеогликаном [114, 118, 119]. Причем, для разделения фермента и протеогликана ex vivo в случае гМСР-1 требуется высокая концентрация соли (1М NaCI или 2М KCI) [118]. Таким образом, и после экзоцитоза даже при нейтральном значении рН внеклеточного пространства химазы остаются связаны с протеогликаном.
После дегрануляции судьба химаз может быть различной. Например, гМСР-1 [109] и тМСР-4 [68] остаются иммобилизованными внутри гранулярного матрикса и не освобождаются в жидкую фазу. Место их действия ограничено непосредственной близостью к тучной клетке. Активность более растворимых гМСР-2 и тМСР-1, синтезирующихся в мукозальных тучных клетках, детектируется как в тканях, так и в кровяном потоке при интестинальной анафилаксии [120] и гельминтозной инфекции [121, 122]. Спектр действия растворимых химаз потенциально более широк.
Критерии чистоты и молекулярные свойства фермента
Хотя биологические функции химаз до конца не ясны, in vitro эксперименты показывают, что эти ферменты способны катализировать многие важные биохимические реакции, в число которых входят: процессинг и деградация гормонов, деградация внеклеточного матрикса, активация других ферментов. Химазы, относящиеся к а-группе, (химаза человека, обезьян, собаки, химаза 2 хомяка) и некоторые р-химазы (тМСР 4, химаза 1 хомяка) способны образовывать активный ангиотензин II из ангиотензина I [76, 138, 139]. Показано, что основной путь образования ангиотензина II в сердце является химазо-зависимым и только 25% ангиотензин II-образующей активности сердца человека принадлежит ангиотензин-конвертирующему ферменту (АСЕ) [162]. Поскольку ангиотензин II является биоактивным пептидом, способным повышать кровяное давление и оказывать воздействие на ткани сердечно-сосудистой системы, следовательно, химазы посредством образования ангиотензина И могут влиять на развитие различных нарушений в сердечно-сосудистой системе. Так, показано, что химаза человека ответственна за увеличенное содержание Анг II при атеросклерозе [163]. Способность гМСР-1 деградировать Анг I и Анг II, при этом не оказывая влияния на брадикинин, говорит о том, что фермент имеет потенциальную возможность регулировать уровень вазоактивных пептидов, приводя к общему гипотензивному состоянию [109].
Химаза собаки и гМСР-1 способны деградировать нейропептиды дыхательных путей - вещество Р и вазоактивный интестинальный пептид [109, 136]. Таким образом, химазы могут влиять на сокращающую способность мышц бронхов.
В коже химазы, вероятно, принимают участие в тканевом ремоделировании и деградации матрикса при воспалении. Например, химаза человека, выделенная из кожи, химаза собаки, гМСР-1, гМСР-2 и тМСР-4 способны активировать матриксные металлопротеиназы (ММР) - ММР-1, MMP-3 [164-167]. Непосредственная активация внутритканевой коллагеназы ММР-1 может быть важна для миграции тучных клеток через внеклеточный матрикс в интестинальный эпителий, например, при изгнании паразитов [72]. Учитывая, что матриксные металлопротеназы секретируются в местах воспаления, где происходит также увеличение числа тучных клеток, способных секретировать химазы, возможно, химазы играют активную роль в метаболизме внеклеточного матрикса при условиях воспаления.
Кроме того, показано, что химазы способны сами гидролизовать белки внеклеточного матрикса. Инкубация участков кожи с химазой человека приводит к деградации якорных филаментов и нарушению взаимодействия между эпидермисом и дермой [168].
Химазы мукозальных тучных клеток мыши и крысы гМСР-2 [168] и тМСР-1 [170] повышают эпителиальную проницаемость слизистой при отсутствии других медиаторов воспаления при кишечных воспалениях, сопутствующим паразитарным инфекциям, и аллергическом ответе. Показано, что химазы тучных клеток соединительной ткани крысы (гМСР-1) и мыши (тМСР 4, 5) гидролизуют фибронектин [171, 172], а гМСР-1 и 2 -коллаген IV базальной мембраны [173]. Теми же свойствами обладает химаза человека [174]. Подобная деградация базальной мембраны может приводить к увеличению проницаемости сосудов при иммунных и аллергических ответах организма.
Химаза человека способна процессировать проколлаген, причем гепарин не влияет ни на скорость, ни на тип образующихся продуктов гидролиза [175]. Образуется коллаген, способный формировать фибриллы, аналогичные тем, которые формируются под действием коллаген-образующих ферментов. Увеличение активности химазы кожи мыши тМСР-4 приводит к увеличению роста капилляров и образованию коллагеновых волокон при заживлении ран [176].
Еще одна возможность участия в воспалительных реакциях показана для гМСР-1, тМСР-3 и 4. Эти ферменты способны инактивировать тромбин, который активируется при воспалительных реакциях [118, 177]. Для проявления этой активности ферментам необходимо находиться в комплексе с гепарином. Отсутствие гепарина значительно снижает тромбин-инактивирующую способность химаз. Тромбин помимо участия в процессе свертывания крови проявляет себя в воспалительных реакциях: он является хемотактическим фактором для лейкоцитов, вызывает пролиферацию различных клеток и т.д. Таким образом, гМСР-1, тМСР-3 и 4 могут ограничивать свертывающую и противовоспалительную активность тромбина.
Химаза человека способна превращать цитокины в активную форму. Протеаза образует активный интерлейкин-1(3 из неактивной формы, которая синтезируется в резидентных клетках кожи (кератиноцитах, фибробластах). Образующийся продукт на 3 аминокислоты длиннее, чем зрелый интерлейкин -1(3, образованный моноядерными клетками периферической крови, и обладает сравнимой биологической активностью [178]. Активация химазой интерлейкин -1В, который является медиатором воспаления, может иметь важное значение для инициации воспалительного ответа в коже. Кроме того, химаза человека оказалась первым ферментом, для которого показана способность образовывать растворимую биоактивную форму фактора стволовой клетки (SCF), вызывающего активацию и дегрануляцию тучных клеток [179].
Определение кинетических параметров гидролиза субстратов
Субстратную специфичность ChIP изучали на примере гидролиза п-нитроанилидов пептидов. Кинетические параметры гидролиза субстратов были получены при условиях, соответствующих физиологическим для дуоденума (рН 8,0; 37С). Мы сравнили действие на субстраты исследуемого фермента и родственных протеаз: химазы человека [132, 133], химазы 2 крысы (гМСР2) [131, 132], дуоденазы [5], а также химотрипсина [132, 191, 192] (табл. 13).
Как выяснилось, ChIP проявляет химотрипсиноподобную активность, гидролизуя субстраты, содержащие объемистые гидрофобные остатки фенилаланина и лейцина в Р1-положении (номенклатура Шехтера и Бергера [23]). Субстраты трипсина (содержащие положительно заряженные остатки аминокислот в Р1-положении) не гидролизуются ферментом.
Наиболее предпочтительными для ChIP оказались соединения, содержащие остаток фенилаланина в Р1-положении и остаток пролина в Р2 положении (Suc-Val-Pro-Phe-pNA и Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA). Наиболее эффективный из числа исследованных субстрат ChIP (Suc-Val-Pro-Phe-pNA) является также самым эффективным для химаз человека и крысы и лучшим гидрофобным субстратом дуоденазы, обладающей двойной (трипсино- и химотрипсиноподобной) специфичностью. Субстрат с остатком лейцина в Р1-положении гидролизуется ChIP в 65 раз менее эффективно (значение /WKM), чем соответствующий субстрат с остатком фенилаланина (табл. 13, соединения 2 и 3). Для сравнения, химаза человека проявляет приблизительно такую же, как ChIP, избирательность в отношении этих субстратов, тогда как дуоденаза гидролизует Phe-содержащий субстрат только втри раза эффективней, чем Leu-содержащий субстрат.
Известно, что многие сериновые протеазы, в частности, дуоденаза [13], другие ферменты группы гранзимоподобных протеаз [132, 137], а также лейкоцитарная эластаза [193], предпочитают в Р2-положении субстрата остаток пролина. Это объясняется двумя факторами. Во-первых, особое устройство Б2-участка связывания фермента, в образовании которого принимает участие планарная часть имидазольного кольца His57, обеспечивает комплементарность молекулярных поверхностей боковой цепи остатка пролина (и других гидрофобных цепей среднего размера) и S2-«кармана» связывания. Во-вторых, конформационная жесткость, присущая пролину, способствует более эффективному фиксированию других остатков (Р1, РЗ) субстрата или ингибитора в соответствующих карманах связывания фермента. Поскольку лучшие синтетические субстраты ChIP содержат в Р2-положении остаток пролина, можно предположить, что S2-участок связывания ChIP устроен аналогичным образом.
Кроме Pro-содержащих субстратов были исследованы два трипептида, содержащих Phe в Р1-положении и Ala/Gly в Р2 и РЗ-положениях (табл. 13, соединения 4 и 5). Субстрат Suc-Ala-Ala-Phe-pNA гидролизовался ChIP в 5 раз более эффективно, чем субстрат Suc-Gly-Gly-Phe-pNA.
«Короткий» субстрат химотрипсина (Suc-Phe-pNA) не чувствителен к действию ChIP. Таким образом, ChIP гидролизует протяженные (три- и тетрапептиды) субстраты химотрипсина. Замена остатков в Р2 и РЗ положениях субстрата при неизменном Р1 -остатке приводит к значительным изменениям скоростей гидролиза (значение /ccat), причем значение Км остается практически одинаковым. Для ChIP характерны относительно невысокие значения эффективности гидролиза (значение кса\/Км) субстратов, производных п-нитроанилина: 102-104 М"1с"1, сравнимые со значениями, полученными для дуоденазы и химазы 2 крысы. Расширить представления о субстратной специфичности ChIP позволили исследования с использованием природных пептидов и белков (проинсулин человека, бычий сывороточный альбумин, глюкагон, мелиттин и N-концевой тетрадекапептид ангиотензиногена) (табл. 14). Продукты гидролиза этих субстратов идентифицировали методами секвенирования и масс-спектрометрии. Данные по гидролизу этих субстратов подтвердили химотрипсиноподобную специфичность ChIP, определенную по действию фермента на синтетические субстраты. В исследованных белковых и пептидных субстратах ChIP гидролизует пептидные связи, образованные карбоксильной группой ароматических и объемистых алифатических остатков (Phe, Туг, Тгр, Leu, lie, Gin).
