Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Генетически обусловленные нарушения обмена меди человека и животных
1.1. Биологическая роль.меди.и.медьсодержащие белки 10
1.2. Нарушения обмена меди 16
1.3. Открытие.ЦП,.его.распространение в животном мире 20
ГЛАВА II. Физико-химические свойства ЦП человека и животных
2.1. Молекулярная масса и другие физико-химичесткие параметры ЦП 20
2.2. Каталитическая /оксидазная/ активность ЦП 23
2.3. Влияние.и онов на каталитическую активность. ЦП .26
2.4. Структурная организация молекулы ЦП человека: одняцепочечная структура и доменное строение 27
2.5. Генетический полиморфизм. Структурные.варианты ЦП 33
2.6. Молекулярная гетерогенность ЦП 35
2.6.1. Углеводы в составе молекулы ЦП 35
2.7. Аминокислотный состав ЦП 37
2.8. Типы ионов.меди,медьсвязывающие.сайты.Эво-. люция ЦП 39
2.9. Иммунологический анализ ЦП 45
ГЛАВА III. Биологические функции ЦП
3.1. Ферроксидазная активность ЦП (КФ.І.І6.3.І). 46
3.2. Медьтранспортная функция ЦП 50
3.3. Антиоксидантные свойства ЦП 53
3.4. Регуляция уровня биогенных аминов 54
3.5. Роль ЦП в гомеостазе меди 55
3.6. Поли функциональность ЦП 56
ГЛАВА ІV. Обмен ЦП в норме и патологий
4.1. Биосинтез,регуляция и катаболизм ЦП 56
4.2. Молекулярная организация гена ЦП крысы 60
4.3. Последовательность реакций котранеляционного. созревания ЦП крысы 60
4.4. Дефект синтеза,созревания и структуры ЦП при ГЛД 63
ГЛАВА V. Материалы и методы исследований . 66
5.1. Выделение ЦП крысы и человека 67
5.2. Седиментационный анализ ЦП 67
5.3. Электрофоретический анализ ЦП 68
5.4. Определение оксидазной активности ЦП 72
5.5. Получение апо-ЦП 73
5.6. Получение.специфических антител к ЦП крысы и человека 73
5.7. Иммунодиффузия 74
5.8. Иммуноэлектрофорез 74
5.9. Восстановление и карбоксиметилирование ЦП 75
5.10. Пептидные карты ЦП крысы и человека 76
5.11. Получение йодированных.производных белков и их фрагментов 76
5.12. Тонкослойные.пептидные карты йодированных белков 77
5.13. Аминокислотный анализ белков 79
5.14. Определение N-концевых аминокислотных остатков 79
5.15. Определение содержания триптофана и тирозина 81
5.16. Определение свободных сульфгидрильных групп... 82
5.17. Определение углеводного состава 82
5.18. Определение содержания меди 87
5.19. Определение содержания белка 87
5.20. Выделение фракции аппарата Гольдки.из.клеток печени крысы 87
5.21. Иммунологический анализ ЦП из аппарата Гольджи. 88
5.22. Анализ ЦП методом ЭПР-спектроскопии 89
ГЛАВА VІ. Выделение и шзико-химическая характеристика церулоплазмина крысы
6.1. Выделение и очистка ЦП крысы 89
6.2. Определение.удельной оксидазной активности.ЦП крысы 93
6.3. Определение молекулярной массы ЦП крысы 96
6.4. Идентификация апо-форыы белка в препаратах ЦП крысы 104
6.5. Химический состав ЦП крысы 108
6.6. Сравнительный анализ ЦП крысы, и ЦП.человека методом пептидных карт на бумаге 117
6.7. Исследование ЦП крысы и ЦП человека и фрагментов этих белков методом тонкослойных.пептидных карт, йодированных гидролизатов . 121
6.8. Каталитически активная форма.ЦП из.аппарата.Гольджи печеночных клеток крысы 133
6.9. Ферментативные свойства ЦП крысы 135
6.10. Иммунохимический анализ ЦП крысы, ЦП человека и ЦП крысы из аппарата Гольджи 139
Обсуждение результатов 146
Выводы 161
Список литературы 163
- Биологическая роль.меди.и.медьсодержащие белки
- Молекулярная масса и другие физико-химичесткие параметры ЦП
- Медьтранспортная функция ЦП
- Последовательность реакций котранеляционного. созревания ЦП крысы
Введение к работе
Актуальность проблемы. В Лаборатории биохимической генетики НИИЭМ АМН СССР под руководством члена-корреспондента АМН СССР профессора С.А.Нейфаха проводятся всесторонние исследования молекулярных механизмов развития тяжелого наследственного заболевания человека - болезни Вильсона-Коновалова или гепатолентику-лярной дегенерации (ГЛД). Это заболевание характеризуется моногенным наследованием и ярко выраженными нарушениями обмена меди, в результате чего соли меди в токсических количествах откладываются в различных органах больных, в том числе в печени и тканях головного мозга. Нарушения обмена меди непосредственно связаны с дефицитом медьсодержащего гликопротеида плазмы крови - церуло-плазмина (ЦП), белка, ответственного за межорганный транспорт меди.
Исследования, проводимые в Лаборатории биохимической генетики НИИЭМ, с убедительностью показывают, что в печени больных ГЛД нарушены пути биосинтеза и созревания ЦП /8,14,36/. Кроме того, продемонстрировано, что в плазме некоторых больных циркулирует ЦП с измененной структурой /28,29/.
Весьма вероятно, что все эти изменения обусловливают дефицит ЦП в крови больных ГЛД, следствием чего является отложение солей меди в токсических концентрациях в клетках внутренних органов и это в свою очередь служит причиной развития симптомов заболевания.
Детальное исследование всех закономерностей биосинтеза и созревания ЦП в норме и при патологии требует, чтобы непосредственно изучалась та живая ткань, которая синтезирует этот белок, то есть ткань печени. Но живая ткань печени человека может быть
- 7 -получена для исследования только при особых обстоятельствах и притом в очень ограниченных количествах путем биопсии. Все это крайне осложняет возможности исследования на здоровых и больных людях. В связи с этим анализ закономерностей биосинтеза и созревания ЦП наиболее целесообразно производить на модельных системах, то есть на животных. Такой модельной системой может служить ткань и культура клеток печени крысы. При использовании этой модельной системы уже получена ценная информация о природе мРНК, кодирующей ЦП /16/, о молекулярной организации гена ЦП /15,45/, о путях биосинтеза, внутриклеточной миграции, котрансляционных и посттрансляционных модификациях и секреции ЦП крысы /31,34/«
Изучение закономерностей биосинтеза ЦП в модельной системе прежде всего требует детальной физико-химической и структурной характеристики данного белка и выяснения общности строения церу-лоплазминов крысы и человека, так как конечной целью проводимых исследований является изучение молекулярной патологии ЦП человека и разработка рациональных способов диагностики и лечения бо-лезни Вильсона-Коновалова у человека.
Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования было дать всестороннюю характеристику физико-химических свойств ЦП крысы. Исходя из поставленной цели основными задачами исследования являлись:
I/ получение очищенных препаратов ЦП крысы; 2/ доказательство гомогенности получаемых препаратов ЦП; 3/ определение основных физико-химических параметров и элементов
структурной организации ЦП крысы; 4/ сравнительный анализ свойств и строения ЦП крысы и человека; 5/ получение специфических антител к ЦП крысы, которые могли бы
быть использованы в дальнейших исследованиях по биосинтезу и обменным превращениям этого белка.
Научная новизна работы. Ранее в Лаборатории биохимической генетики НИИЭМ уже предпринималась попытка изучения свойств ЦП крысы /2/. В этой работе были охарактеризованы основные параметры белка, но, в целом, работа носила предварительный характер. В то время как физико-химические свойства ЦП человека достаточно хорошо охарактеризованы, и имеется обширная литература по этому вопросу, ЦП крысы до сих пор изучен явно недостаточно. В литературе опубликовано всего несколько единичных работ, посвященных этому белку, результаты которых к тому же носят противоречивый характер /83,123,132/. Таким образом, дальнейшее исследование и уточнение закономерностей строения и анализ свойств ЦП крысы представляется актуальным.
Научно-практическое значение полученных результатов. Получение гомогенных препаратов ЦП крысы и моноспецифических антител к ним явились основой для работ по выделению ЦП-мРНК и изучению механизмов созревания ЦП в гепатоцитах, проводимых в Лаборатории биохимической генетики НИИЭМ АМН СССР.
Полученные результаты по сравнительному исследованию ЦП позволяют определить особенности строения и свойств ЦП крысы и показывают, что ЦП - синтезирующая система печени крысы может служить адекватной моделью для изучения биосинтеза и обмена ЦП человека, выяснение которых необходимо для расширения наших знаний о молекулярных механизмах развития ГЛД.
Структура диссертации:
Работа изложена на 186 страницах машинописного текста, содержит 37 рисунков, II таблиц. Диссертация состоит из введения,
. 9 -обзора литературы (главы І-ІУ), материалов и методов исследования (глава У), собственных исследований (глава УІ), обсуждения результатов и выводов. Список литературы содержит 214 названий работ на русском и иностранных языках.
Положения, которые выносятся на защиту:
В диссертации разработаны оптимальные условия для препаративного получения ЦП крысы.
Изучены физико-химические свойства ЦП крысы и определены критерии гомогенности препаратов белка.
В результате сравнительных исследований церулоплазминов крысы и человека в основном продемонстрировано сходство ряда физико-химических параметров, а также доменной структуры этих белков.
Предложен оригинальный способ иммунизации кроликов препаратами ЦП крысы.
Получены моноспецифические антисыворотки против ЦП крысы с высоким титром.
Апробация диссертации:
Апробация диссертации состоялась на научной конференции Лаборатории биохимической генетики НИИЭМ АМН СССР 23/XI-84 г. Список работ, опубликованных по материалам диссертации:
1. Выделение и физико-химическая характеристика церулоплазмина
плазмы крови белых крыс.
Захарова Е.Т., Васильев В.Б., Горбунова В.Н., Шавловский М.М., Биохимия, 1983, 48, 10, 1709-1720.
2. Анализ видовых различий радиоактивно меченных церулоплазмина
и альбумина с помощью пептидных карт. Васильев В.Б., Захаро
ва Е.Т., Шавловский М.М., Вопросы медицинской химии, 1983, 3,
29, 70-74.
_ io -
Исследование первичной структуры церулоплазмина. Борисова О.П., Васильев В.Б., Вахарловский В.Г., Захарова Е.Т., Шавловский М. М., ІУ Всесоюзный биох.съезд, Ленинград, Наука, 1979, с.45.
Структурная организация церулоплазмина. Борисова 0;П., Вагин А.А., Васильев В.Б., Горбунова В.Н., Зайцев В.Н., Захарова Е. Т., Маслов В.Г., Мошков К.А., Яковлев А.С, Нейфах С.А.,Шавловский М.М., УІ конференция биохимиков прибалтийских республик, БССР и Ленинграда, Рига, 198I, с.240-241.
Наследственный дефект биосинтеза церулоплазмина при болезни Вильсона-Коновалова. Пучкова Л.В., Васильев В.Б., Вахарловский В.Г., Вербина И.А., Захарова Е.Т., Шавловский М.М., ІУ съезд ВОГиС им.Вавилова, Кишинев, 1982, 4, с.III.
Моделирование молекулярной патологии гепатолентикулярной дегенерации. Борисова О.П., Васильев В.Б., Захарова Е.Т., Шавловский М.М., I Всесоюзный съезд мед. генетиков, Киев, 1984, 53-54.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Биологическая роль.меди.и.медьсодержащие.. белки
Гомеостаз меди в печени достигается в первую очередь контролем экскреции меди с желчью, которая содержит как низкомолекулярные комплексы меди с аминокислотами и пептидами, так и макро-молекулярные медьсодержащие комплексы - результат катаболизма асиало-ЦП и других медьсодержащих белков в лизосомах /100/.
Детоксикацию и хранение избытка меди связывают с металло-тионеином, который содержит большую часть меди цитозоля гепатоци-тов /60/.
Третьей функцией печени в поддержании гомеостаза меди в организме является синтез ЦП в гепатоцитах, с включением меди в этот белок и последующим возвращением ее в кровь в составе ЦП, что представляет важное звено в метаболизме меди у млекопитающих. В сутки в организме здорового человека разрушается 4.35-7.87 мг ЦП на I кг веса тела, что в пересчете в среднем на массу взрослого человека соответствует выведению 1-2 мг меди. Эта величина указывает на существование нулевого баланса меди в организме и подтверждает участие ЦП в поддержании гомеостаза меди /30/.
Сама медь или специфические внутриклеточные комплексы ионов меди с органическими молекулами могут регулировать важные биохимические процессы, контролируя биосинтез белка или экспрессию активности фермента. В печени, например, содержание Си-металлотио-неина в цитозоле уменьшается во время дефицита меди и значительно возрастает при кормлении крыс медью /60/. Дефицит меди вызывает уменьшение количества лизилоксидазы в аорте, а в печени - снижение количества медьсодержащих ферментов - цит охр ом оксида з ы и су-пероксиддисмутазы.
В настоящее время известно несколько наследственных заболеваний человека - болезнь Менкеса (болезнь курчавых волос), болезнь Вильсона-Коновалова) и животных (болезнь Бедлингтонских терьеров), при которых патологические симптомы связаны с нарушением гомеостаза меди в организме. Болезнь Вильсона-Коновалова (гепатолентикулярная дегенерация) (ГЛД) /210,22/ - это тяжелое аутосомно-рецессивное заболевание человека, в основе которого лежит моногенная мутация /187/, нарушающая метаболизм меди и вызывающая дефицит медьсодержащих жизненно важных ферментов, таких как цит охр ом оке ид аза, суперокси-дисмутаза, аминооксидаза и др. и аккумуляцию токсичных количеств меди в тканях тела. Частота гетерозигот в среднем 1:200, а гомозигот, больных ГЛД в среднем в мире /194/ 1:200000.В разных странах частота различна, например,2.9:100000 в ГДР /54/ и 7:100000 в Японии /51/, видимо за счет большого числа в этой стране кровнородственных браков.
Болезнь проявляется в разном возрасте: от I года до 60 лет; 84% случаев в возрасте от б до 20 лет /157,194/ и постоянно прогрессируя, приводит к полной инвалидизации больных. ГЛД делится на три периода /9/: I период - преклинический (чаще до 12 лет), бессимптомный; П период - преневрологический или висцеральный (до 17-20 лет), проявляется в виде хронического гепатита, желтухи, гемолитической анемии или геморрагии, увеличения печени и (или) селезенки; Ш период - неврологический (у взрослых), характеризуется снижением интеллекта, дизартрией, экстрапирамидными гипер-кинезами, циррозом печени. Характерными симптомами ГЛД являются: медные роговичные кольца Кайзера-Флейшера (могут отсутствовать у детей), пониженное содержание ЦП в сыворотке крови у большинства больных, повышенное выделение меди с мочой и повышение содержания меди в печени. ГЛД генетически и клинически полиморфное заболевание /9,28, 29, 30, 40/. В 1956 году английский исследователь Waisne , известный своими работами в области болезни Вильсона /203-207/, впервые показал эффективность препарата Д-пенидилламина при лечении больных ГЛД. Д-пеницилламин / ft , fi, J - диметилцистеин/ является продуктом гидролиза пенициллина и способен образовывать внутренний (хелатный) прочный комплекс с медью за счет сульфгидрильной и аминогрупп, способствуя выведению меди из организма больных через почки /203,206/. При регулярном применении пеницилламина, обеспечивающем отрицательный баланс меди в организме, больные из тяжелых инвалидов превращаются в способных к трудовой деятельности членов общества. Одним из характерных признаков ГЛД является значительное снижение удельной оксидезной активности ЦП: около 90% пациентов с болезнью Вильсона имеют следовые количества ЦП /157/. Известно, однако, что 4-10% больных имеют нормальный, умеренно сниженный или даже повышенный уровень ЦП /156, 157, 183/, что по-видимому объясняется генетической гетерогенностью этого заболевания. Однако даже при нормальном содержании ЦП, у таких больных имеет место снижение включения радиоактивной меди в ЦП /157/. Поскольку симптомы болезни вызываются расстройством обмена меди, логично искать первопричину в нарушении экспрессии гена, кодирующего ЦП - медьпротеид, содержащий 96-98% всей меди сыворотки крови /136/. Болезнь Менкеса - сцепленный с полом генетический дефект всасывания и транспорта меди у новорожденных - характеризуется комплексом обменных нарушений вследствие недостаточного поступления меди в кровь. Эти нарушения приводят к дефициту медьсодержащих белков, не коррегируемому введением меди /188/. Дефицит меди обусловливает дефект зН-групп окисления, и, как следствие этого - снижение образования дисульфидных связей, этим объясняется появление аномальной курчавости волос у детей /96/. Клинически при болезни Менкеса отмечается психическая отсталость, микроцефалия, бесцветность волос, гипотермия, слепота. Мальчики погибают в раннем возрасте от сердечно-сосудистой недостаточности /75,76/. Болезнь Бедлингтонских терьеров, также как и болезнь Вильсона-Коновалова, развивается на фоне избыточного накопления меди в тканях организма, особенно в печени. Имеется некоторый параллелизм в заболевании человека и собаки /156,200/: 1) в обоих случаях оно носит аутосомно-рецессивный характер; 2) накоплению меди предшествуют указанные выше клинические симптомы; 3) наблюдается прогрессивная аккумуляция меди в печени, ведущая при отсутствии лечения к циррозу печени и летальному исходу; 4) пеницилламин - эффективно предотвращает заболевание; 5) наблюдается понижение экскреции меди с желчью и 6) замедленный выход ЦП в кровь.
Молекулярная масса и другие физико-химичесткие параметры ЦП
Ранее было показано, что ЦП свиньи состоит из 2-х субъединиц: 70 кД и 80 кД /145, 146/. В свете новых доказательств о ЦП человека как единичной полипептидной цепи, Ryaen предпринял сопоставление церулоплазминов четырех млекопитающих: человека, свиньи, кролика и лошади, подвергнув восстановленные и алкилиро-ванные белки гель-хроматографии в бМ гуанидин-хлориде /175/. Оказалось, что все эти церулоплазмины элюируются одним пиком с близкими молекулярными массами от 102 кД (ЦП свиньи) до НО кД (ЦП человека), что дает основание полагать об их сходном строении в виде одной полипептидной цепи. При этом, ЦП свиньи, близкий к ЦП человека по ряду свойств: числу атомов меди, спектральным и энзиматическим свойствам, MB и числу углеводных цепей, отличается от него по устойчивости к протеолизу. Выделенный в отсутствие ингибиторов протеаз, ЦП свиньи не содержит никаких следов низкомолекулярных фрагментов /175/.
Процесс фрагментации ЦП человека происходит, по-видимому, во время выделения, очистки и хранения белка, и носит упорядоченный характер, когда из крупных компонентов образуются фрагменты средней величины, которые в свою очередь распадаются до еще более мелких /б/, как было продемонстрировано в Лаборатории биохимической генетики НЙЙЭМ, белок деградирует в результате ограниченного протеолиза под действием протеиназ крови, которые в момент очистки ЦП освобождаются от связи со специфическими эндогенными ингибиторами и становятся активными /24,25/. Фрагментация подавляется инбибиторами сериновых протеаз ( ШСФ, - аминокапроновая кислота). Однако, даже в лучших препаратах ЦП человека при разделении их с помощью электрофореза в присутствии ДДС-їїа помимо основного компонента с MB 132 кД, соответствующего нативному ЦП, всегда обнаруживаются также ПО кД и 19 кД - фрагменты. Очевидно, эти фрагменты образуются из исходного ЦП путем единичного акта гидролиза, а пептидная связь, их соединяющая, является функционально наиболее лабильной. Распределение фрагментов в образце "спонтанно расщепленного" ЦП, показывает, что в белке имеются 2 очень лабильные связи: одна между 50 кД и 19 кД - фрагментами, другая - между 67 кД и 50 кД - фрагментами /85/. Лабильность может быть обусловлена как специфическим аминокислотным окружением, так и особой доступностью этих связей для атаки протеиназами: полипептидная цепь в этих местах, вероятно, имеет неупорядоченную структуру (междоменные связки, чувствительные к специфическому протеолитическому расщеплению). При этом высвобождаются компактные, высокоупорядоченные фрагменты- домены, элементы третичной структуры белков, относительно резистентные к протеолизу /197/.
Определение полной аминокислотной последовательности ЦП человека /198/ показало наличие остатков Про в третьем положении от С-конца 67 кД домена, в третьем и четвертом положении от N- конца и в третьем положении от С-конца 50 кД домена, а также в четвертом положении от и- конца 19 кД домена. Как известно, в районе Про полипептидная цепь как бы совершает поворот (изгиб) и, в данном случае, высвобождает Apr и Лиз, находящиеся между 67 кД и 50 кД и 50 кД и 19 кД доменами соответственно, делая их доступными действию трипсиноподобной протеазы (рис.б).
В нативном препарате ЦП отдельные его домены удерживаются в глобуле, несмотря на разрыв междоменных связей. Силы сцепления нарушаются только после денатурации ЦП, например, в условиях диссоциации в присутствии 1% ДДС- на. Убедительные данные в пользу доменного строения с доказательством внутримолекулярной гомологии ЦП были получены в Лаборатории биохимической генетики НйИЭМ при изучении процессов спонтанного и индуцированного протеолиза ЦП человека /6,33/. Оказалось, что 5 фрагментов из 6: Fj -F5 (обозначение по МБ в ДДС- на электрофорезе - Fj - 130 кД, F2- НО кД, F3-66 КД» fy - 48 кД, F - 22 кД и Fg- 18 кД), совпадают по аминокислотному составу и N- концевой аминокислотной последовательности, но отличаются от F6. На факт внутримолекулярной гомологии указывает и в 2 раза меньшее от теоретически ожидаемого количество пептидов в пептидных картах ЦП человека /28,29,192/, ошибочно отнесенное ранее на счет 2-х субъединичного строения молекулы. Электронномикроскопическое исследование ЦП человека /26,37/ показало, что молекула ЦП выглядит как гексамер, состоящий из 2-х слегка ассимметричных тримеров. На основе работ по внутримолекулярной гомологии, рентгено-структурному анализу /18/ и электронномикроскопическому исследованию, показавших наличие определенной внутренней симметрии молекулы ЦП, а также работ по биосинтезу ЦП в печени крысы /31/, продемонстрировавших наличие предшественника ЦП в аппарате Гольдки с МБ 65 кД, казалось вероятным, что созревание молекулы ЦП включает сшивку 2-х идентичных половин-субъединиц с МБ 65 кД каждая. Была предложена модель ЦП, состоящая из 6 ковалентно сшитых доменов, в которой каждая субъединица состоит из 2-х р 5-доме-нов и одного Fg -домена /33/. Гипотеза 2-х идентичных ковалентно сшитых субъединиц ЦП была уточнена благодаря работам группы Putnam по секвенации ЦП: /198, 197, 121, 85/. Этими авторами было продемонстрировано,что полипептидная цепь ЦП человека состоит из 3-х гомологичных участков, каждый из которых содержит по 340 аминокислотных остатков. Все три гомологичных участка характеризуюься 30% идентичностью последовательностей, а при попарном сравнении между собой - 40% идентичностью. При этом наиболее редкие аминокислоты в ЦП: Цис, Три и Мет имеют более высокий процент совпадения - 93%, 75% и 68% соответственно, что является строгим доказательством высокой степени консервативности структуры в повторяющихся гомологичных доменах ЦП человека. На основании данных о внутримолекулярной трипликации и ограниченном протеолизе, авторы предложили модель структуры молекулы ЦП (рис.6). Модель состоит из 6 чередующихся доменов 2-х разных типов или 9 доменов трех типов. Трехкратная внутренняя гомология предполагает, что молекула ЦП включает тандемную трипликацию предкового гена. Модель также предлагает возможные центры связывания меди, предсказывает локализацию дисульфидных связей и четырех олигосахаридных цепей: 3-х на 67 кД фрагменте и одной - на 50 кД фрагменте.
Медьтранспортная функция ЦП
Роль ЦП, как белка, транспортирующего медь к медьсодержащим ферментам в клетках всех органов животного организма,таким как цитохромоксидаза, впервые была постулирована Вготап в 1967 г. /64/. Убедительным аргументом в пользу этой гипотезы являлось то, что ЦП содержит 90-95% всей меди плазмы. Оставшиеся 5-10% Си существуют главным образом в виде комплексов меди с альбумином и аминокислотами /92/, и могут обеспечивать добавочный механизм транспорта меди, доставляя ионы меди к печени после их всасывания из кишечника, или после их освобождения из ЦП и других медьсодержащих белков тканей, где они могут вновь встраиваться в ЦП /96/.
Вслед за Broman ,Shokeir и shreffier также выдвинули гипотезу о медьтранспортной функции ЦП, обнаружив пониженную активность цит охр ом оксидазы лейкоцитов у пациентов с ГЛД, и умеренное снижение у гетерозиготных носителей этой мутации /189/.
В дальнейшем Marceau и Aspin /133/ сравнили распределение меченой меди, введенной крысам в двух формах: Си-альбумина и Си-ЦП. Цитохромоксидаза, выделенная из печени этих животных, содержала радиоактивную медь обеих форм, при этом в отличие от б7Си, введенной с ЦП, Си - легко удалялась ДДК. Исследователи также нашли, что медь из ЦП включалась в супероксиддисмутазу печени, тогда как большая часть альбуминовой меди ассоциировалась с низкомолекулярными белками печени, типа металломонеинов.
Убедительно продемонстрирована роль ЦП в транспорте меди в работе Hsieh. и Frieden/112/. Крысам, находившимся в течение двух месяцев на безмедной диете, что вызывало снижение активности цитохромоксидазы, вводили затем внутривенно ЦП, Си-альбумин, Си-гистидин и СиС12. Восстановление активности цитохромоксидазы было более быстрым и высоким у животных, которым вводили очищенный ЦП.
Harris и др. /104/ обнаружили пониженную активность лизил-оксидазы у медьдефицитных цыплят, которая не корректировалась введением эстрогена, но повышалась под действием инъекций СиэО . Однако максимальное увеличение ферментативной активности лизил-оксидазы достигалось только в том случае, когда таких цыплят сначала обрабатывали эстрогеном, а затем они получали СИБОЛ. ЭТО увеличение активности фермента прямо коррелировало с увеличением ПФД-активности сыворотки, также вызванное комбинированным введением CHSO И эстрогена. Таким образом, наибольшая активация лизи-локсидазы была связана только с ПФД-активностыо ЦП в сыворотке, а не с увеличением уровня меди в сыворотке. На основании этих наблюдений авторы пришли к выводу, что транспорт меди в ткань, где функционирует лизилоксидаза, требует специфического медьсодержащего белка сыворотки крови - ЦП.
Транспорт меди, возможно, требует наличия особых рецепторних механизмов в различных тканях. Как известно, Си "1" более лабильно связывается с ЦП, что наводит на мысль об этапе восстановления в процессе освобождения меди, переносимой белком /95/. Таким образом первым шагом в цепи переноса меди внутрь клетки является восстановление Си , ассоциированной с ЦП. Если этот процесс происходит на клеточной мембране, то необходим акцептор Си1+. Если же сам ЦП проникает внутрь влетки, то потребность в акцепторе отпадает. В виде См + медь связывается с внутриклеточными апобелками, а для ее фиксации в холобелке происходит окисление Си1+ до Си2+ кислородом. Такой механизм учитывает все стороны вопроса: и ведущую роль ЦП как переносчика и донора меди, и вырамеиную склонность к обмену Си + - лигандов и относительно высокую стабильность иона меди в Си2+ - белках.
Исследования binder и Моап /124/ показали отсутствие необходимости в гипотетическом акцепторе меди для ЦП на клеточной мембране, предложенного Frieden/95,96/. Они обнаружили способность самого ЦП проникать внутрь тканей. При этом максимальная активность ЦП в отношении ПФД наблюдалась в сердце и мозгу, а минимальная - в почках и печени, что согласуется с данными о богатстве первых двух тканей цитохромоксидазой, и, таким образом, еще раз подтверждает донорно-транспортную функцию ЦП для медьсодержащих ферментов.
Способность ЦП проникать внутрь клеток для освобождения меди биологически целесообразна: внутри реактивной сферы клетки имеются обширные восстановительные механизмы - многочисленные эндогенные субстраты, восстановленные НАД и НАДФ, глутатион, аскорбиновая кислота и т.д., кроме того, ЦП способен использовать электронно-транспортную машину клетки, восстанавливающую ЦП в анаэробных условиях /65/.
Последовательность реакций котранеляционного. созревания ЦП крысы
На основе рестрикционного анализа фрагментов ядерной ДНК, несущих последовательности гена ЦП, было проведено изучение топографии ЦП-кодирующих последовательностей в геномной ДНК крысы, в результате которого установлена ЛИНЕЙНО-МОЗАИЧНАЯ (прерывистая) структура гена ЦП /15,45/. Этот ген представлен сложной совокупностью кодирующих последовательностей - 5,-6 экзонов, и вставок--интронов, причем линейная протяженность кодирующей единицы-транскриптона в несколько раз превышает длину молекулы ЦП-мРНК. Наличие протяженных интронов объясняет существенную избыточность размеров природного гена ЦП (сумма молекулярных масс рестрикцион-ных фрагментов клеточной ДНК, гибридизуемых с ЦП-кДНК), по сравнению с молекулярными размерами зрелой ЦП-мРНК, созревание которой включает стадии эндонуклеазного вырезания интронов и лигази-рования-сшивки экзонов (сплайсинг).
Далее, методами молекулярной гибридизации с ЦП-кДНК (так называемый "синтетический" ген-двунитевая кДНК, синтезированная по матрице ЦП-мРНК), как специфическим молекулярным зондом, идентифицированы ядерные предшественники ЦП-мРНК. Обнаружены избыточность ьШ пре-мРНК по сравнению с ЦП-мРНК и наличие множественных дискретных классов ЦП-пре-мРНК с различными величинами МБ - ин-термедиатов процессинга-сплайсинга /16/. Эти результаты еще раз служат доказательством расщепленной молекулярной организации хромосомного гена ЦП.
Согласно современным представлениям, цепь реакций посттрансляционной модификации секреторных белков осуществляется ферментной системой цитоплазматических мембран. В частности, начальные стадии этого процесса связаны с мембранами эндоплазматическо-го ретикулума, а завершающие стадии созревания продуктов секреции происходят в аппарате Гольджи /158/. Известно, что в образовании мембраносвязанных полисом, синтезирующих все изученные до сих пор секреторные белки, важнейшую роль играет связывание с мембранами так называемой сигнальной или якорной последовательности растущей полипептидной цепи. Эта последовательность, обогащенная гидрофобными аминокислотами, локализуется на л -конце растущей полипептидной цепи секреторного белка и обеспечивает векториальное высвобождение этого продукта трансляции в полость цистерн шероховатого ретикулума /58/. По мере элонгации растущего полипептида "сигнальная" последовательность отщепляется под действием ассоциированной с мембранами специфической пептидазы и поэтому, как правило, она не обнаруживается в составе завершенных полипептидов, выделенных из гладкого ретикулума, из аппарата Гольджи или из кровотока.
В опытах по исследованию биосинтеза ЦП в печени крысы в Лаборатории биохимической генетики НИИЭМ показано, что ЦП синтезируется на мембраносвязанных ПРО печени в форме пре-про-ЦП с MB 84- кД /34,35/. Этот первичный продукт не выявляется в опытах на интактных животных, а обнаруживается только при трансляции ЦП-мРНК в гетерологичной бесклеточной системе, эффективно транслирующей экзогенные мРНК, но не содержащей аппарата, обеспечивающего созревания белков из первичных трансляционных продуктов /202/.
В присутствии микросомных мембран и клеточного сока (гомологичная бесклеточная система), содержащих, по-видимому, фермент -сигнальную пептидазу, которая обеспечивает протеолитическую модификацию продуктов трансляции, происходит отщепление сигнальной N-концевой последовательности со снижением MB полипептида до 80 кД (npo-ullj). Эта первая котрансляционная стадия ограниченного протеолиза имеет место в ходе элонгации, когда длина растущего полипептида достигает около 60 аминокислот, при этом происходит отщепление сигнальной последовательности примерно в 33 аминокислоты. Второй этап протеолитического созревания начинается в мембранах гладкого ретикулума и завершается в аппарате Гольдки образованием активного оксидазоположительного про-ЩЬ, с MB 65 кД по данным ДДС- Na электрофореза /31/. Он появляется в крови через 2 часа и циркулирует наряду с высокомолекулярной формой ЦП-І30 кД /34/.
Опыты по определению последовательности реакций начального гликозилирования в системе процессов котрансляционной модификации ЦП показали, что гликозилирование ЦП сопряжено с его синтезом на полисомах и подавляется ингибитором элонгации циклогексимидом. При этом субстратом начального гликозилирования служат растущие цепи ЦП с длиной более 60 аминокислотных остатков, то есть прошедшие I стадию ограниченного протеолиза /включение С-глюкозы только в про-ЦП 80 кД/ /34/»
