Введение к работе
Актуальность проблемы. Умеренная гипергомоцистеинемия (ГГЦ) (12-30 мкмоль/л), встречающаяся у взрослых зависит преимущественно от нехватки витамина В9 и В12. Анализ общего гомоцистеина (оГци) позволяет выявлять нарушения ферментативных реакций, в которых участвуют коферментные формы витаминов В9, В12 и В6. Известно, что при внутриклеточном дефиците витамина В12 может наблюдаться ГГЦ одновременно с метилмалоновой ацидемией (ММА), (Andres Е.,. et al. 2004; Светлицкая С.Г., 2004). Параллельно ММА следует оценивать развитие лактоацидемии - показателя митохондриальной дисфункции. Различают первичную и вторичную митохондриальную дисфункцию (ВМД). В первом случае развиваются врожденные органические ацидемии (метилмалоновая и другие), которые обычно приводят к ацидозу, сопровождающемуся тяжелыми нарушениями со стороны сердечнососудистой и нервной систем. ВМД у лиц пожилого возраста изучена в меньшей степени. Она может зависеть от внутриклеточного дефицита витамина В12 и следовательно сопровождаться ГГЦ. В результате дефицита в митохондриях аденозилкобаламина развивается ММА, а при недостатке в цитоплазме метилкобаламина также и ГГЦ. Часто после констатации отсутствия дефицита в содержании витамина В12 в крови ГГЦ приписывают дефициту фолиевой кислоты. Однако нарастающие неврологические нарушения заставляют выяснять причины развития клинической картины, характерной для нарушения митохондриальной энергетики в различных тканях. Одна из актуальных проблем современной клинической биохимии состоит в разработке и рекомендации тестов, выявляющих нарушения прямого и анаплеротических путей митохондриального энергетического метаболизма, пригодных для диагностики ВМД. Для диагностики ВМД у взрослых и в старшей возрастной группе необходимо предложить тесты, позволяющие оценить сдвиги в метаболоме плазмы крови в пуле источников и интермедиатов энергетического метаболизма митохондрий. Из-за ограниченности методов, позволяющих констатировать развитие конкретных митохондриальных нарушений, лечение неврологических и сердечнососудистых заболеваний проводится без учета необходимости коррекции митохондриальной дисфункции.
Цель работы заключается в изучении проявления системных признаков митохондриальной дисфункции в условиях повышенного содержания общего гомоцистеина, в том числе, при нарушении его транспорта белками крови у лиц старшей возрастной группы. Задачи исследования:
1. Изучить перераспределение гомоцистеина (Гци) из альбуминовой фракции в состав крупномолекулярной фракции белков крови в условиях
активации альфа-2-макроглобулина (а2-МГ) трипсином методом ультрафильтрации с последующим анализом Гци .
Изучить фильтруемость Гци, связанного с белками плазмы крови лиц с заболеваниями сердечно-сосудистой системы, в том числе с нарушением внутрисосудистого свертывания и фибринолиза.
Изучить проявления ВМД и ГГЦ у пациентов без дефицита витамина В12 в плазме крови.
Изучить изменения в спектре аминокислот плазмы крови, являющихся источниками ММК и интермедиатов цикла Кребса.
Изучить проявления ВМД при ГГЦ и ММА у лиц с церебро-васкулярной патологией и интеллектуально-мнестическими нарушениями.
Положения, выносимые на защиту:
Определение фильтрации Гци, связанного с белками плазмы крови, позволяет выявить лиц с более тяжелой в патогенетическом отношении ГГЦ. Активация а2-МГ трипсином или эндогенными протеиназами в условиях внутрисосудистого свертывания и фибринолиза способствует перераспределению Гци из альбуминовой фракции в состав крупномолекулярной фракции белков крови. Это проявляется в снижении фильтрации Гци, связанного с белками плазмы крови. Снижение коэффициента фильтрации Гци, у лиц с активацией внутрисосудистого свертывания и фибринолиза встречается также в отсутствие ГГЦ.
Митохондриальная дисфункция у пациентов с сердечнососудистыми заболеваниями, в том числе, старшей возрастной группы, в случаях с метилмалоновой ацидемией и ГГЦ характеризуется повышенными уровнями лактата и пирувата.
Митохондриальная дисфункция у пациентов с сердечнососудистыми заболеваниями, в том числе, старшей возрастной группы проявляется в виде корреляции содержания аминокислот анаплеротических источников интермедиатов цикла Кребса с уровнями лактата и аланина.
Повышение уровней ММК и оГци в плазме крови негативно влияют на процессы памяти и мышления. У лиц старшей возрастной группы с проявлениями митохондриальной дисфункции в условиях ММА главным образом страдают процессы краткосрочной памяти.
Научная новизна исследования
В работе проведено изучение развития ВМД при ГГЦ и изменении транспорта Гци белками крови при нарушении коферментных функций витаминов В9 и В12. Обнаружено, что у лиц старшей возрастной группы, при ГГЦ и перераспределении потока транспорта Гци с а2-МГ фракцией белков развивается ММА и лактоацидемия. Последняя характеризует ВМД. Это объясняет причину развития неврологических нарушений,
параллельно эндотелиальной дисфункции при ГГЦ - известо, что митохондрион клетки весьма чувствителен к повышению уровня лактата. Показано, что эндотелиальная дисфункция может зависеть не столько от повышения оГци, сколько от связывания исследуемого аминотиола с фракцией белков, включающей а2-МГ. В образцах лиц с активацией внутрисосудистого свертывания в отсутствие ГГЦ обнаружено усиление связывания Гци с этой фракцией. Установлено, что наряду с эндотелиальной дисфункцией у лиц пожилого возраста с сердечнососудистыми заболеваниями развивается ВМД в виде лактат- и пируват-ацидемиямии. Высокая ММА (>5мкМ) сопровождается выраженной ГГЦ. ВМД в старшей возрастной группе (>55 лет) зависит от нарушения анаплеротического пути образования сукцината. Также показано, что избыточные количества ММК и оГци в плазме крови негативно влияют на процессы краткосрочной памяти и мышления.
Научно-практическая значимость
Метод определения коэффициента фильтрации Гци может быть использован для определения активации патогенетически важного процесса связывания этого аминотиола крупномолекулярными белками крови. Определение ММК, наряду с тестированием витаминов В12 и фолиевой кислоты в крови, необходимо для своевременного выявления митохондриальной дисфункции, ведущей к тяжелым неврологическим и сердечно-сосудистым заболеваниям. Определение ММК важно также для дифференциальной диагностики В12 и В 9 - зависимых ГГЦ.
Внедрение результатов исследования в практику
Результаты работы внедрены в практику обследования больных неврологических и кардиологических отделений клиник СПбГМУ им. акад. И.П.Павлова, поликлинике № 31 г. Санкт-Петербурга и используются при проведении лекций и занятий на факультете постдипломного образования. Получено разрешение на применение модифицированной диагностической технологии: «Лабораторная диагностическая технология выявления метилмалоновой ацидемии»,А.А. Жлоба, Е.Г. Маевская, В.В. Никитина, № ФС 2010/122, 02.04.10.
Апробация диссертации и публикации Апробация работы проведена на совместном заседании отдела биохимии НИЦ и проблемной комиссии «Патология» (протокол №11, от 15 декабря 2011 г.). Результаты исследований доложены на ежегодных межвузовских конференциях молодых ученых: «LXX конференция молодых ученых «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической медицины» - 2009», «III Международный молодежный медицинский конгресс - Санкт-Петербургские научные чтения - 2009», «LXXI конференция молодых ученых «Актуальные вопросы
экспериментальной и клинической медицины» - 2010», «LXXII конференция молодых ученых «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической медицины»-2011», «IV Международный молодежный медицинский конгресс - Санкт-Петербургские научные чтения - 2011». За исследование, результаты которого доложены на IV Международном молодежном медицинском конгрессе, Е.Г. Маевская награждена дипломом I степени. По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ, из них 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ, остальные - в научно-практических журналах и материалах конференций.
Личный вклад автора
Диссертант самостоятельно освоил и применил все методики биохимического анализа и методики нейропсихологического тестирования. В сборе материала, постановке и решении задач исследования диссертанту принадлежит ведущая роль. Статистическую обработку и анализ данных автор выполнил самостоятельно.
Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 132 страницах текста в формате А4 и состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, результатов исследования, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы и приложения.Работа содержит 27 рисунков и 12 таблиц. Библиографический указатель включает 127 литературных источников. По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ, из них 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ, остальные - в научно-практических журналах и материалах конференций.
