Введение к работе
Актуальность и степень разработанности темы. Тимус или вилочковая железа - это центральный орган иммунной системы, в котором предшественники Т-лимфоцитов претерпевают сложнейший процесс дифференцировки и селекции, приводящий, в конечном итоге, к миграции прошедших селекцию и развивших необходимые функциональные механизмы клеток в периферические лимфоидные органы, такие как селезенка, лимфатические узлы, пейеровы бляшки и миндалины (Anderson, 1996). Эпителиальные клетки тимуса секретируют множество факторов, влияющих на незрелые Т-лимфоциты и способствующих различным этапам их созревания: хемокины, цитокины, ростовые факторы, которые создают оптимальные условия для созревания тимоцитов.
Тимус является эндокринным органом, и клетки его эпителия продуцируют ряд пептидных гормонов, которые действуют не только внутри тимуса, но и попадают в систему кровообращения (McClure et al, 1982, Bodey et al, 1997). Нужно отметить, что внетимусные, периферические функции тимусных гормонов стали изучаться относительно недавно (около 10 лет назад), и наша лаборатория явилась одним из пионеров этих исследований (Safieh-Garabedian et al., 2002, Lunin et al., 2008). Ранее, когда тимусные гормоны рассматривались как внутритимусные регуляторы, их терапевтическое применение ограничивалось заболеваниями, связанными с Т-клеточными дисфункциями. Однако исследования, проводимые в последнее время несколькими группами ученых по всему миру, включая нашу лабораторию, показывают, что тимусные гормоны влияют не только на внутритимусное созревание лимфоцитов, как считалось ранее, но также способны регулировать активность зрелых иммунных клеток, в том числе, при воспалительных реакциях (Lunin et al., 2008, Saitoh et al, 2004, Safieh-Garabedian et al., 1994). Ранее мы показали, что разные тимусные гормоны проявляют различные иммуномодулирующие свойства,. В частности, было установлено, что тимопентин оказывает стимулирующее действие на неактивированные иммунные клетки, тогда как тимулин подавляет ответ клеток, активированных эндотоксином (Лунин, канд. дисс, 2008). Вместе с тем, было продемонстрировано взаимодействие некоторых тимусных пептидов и ряда нейроэндокринных систем, что указывает на интеграцию тимуса в нейроэндокринные системы и, в первую очередь, в систему регуляции стрессового ответа, в качестве которой обычно рассматривают гипоталамо-гипофизарно-адреналовую ось (Киселева, 2013; Molinero et al., 2000). Таким образом, тимусные гормоны обладают гораздо более широким спектром эффектов, чем считалось ранее, и появились указания на существование неописанной ранее системы регуляции иммунного ответа с участием нескольких разных гормонов тимуса, которая, по нашей гипотезе, может быть частью общей нейроэндокринной системы регуляции воспалительных ответов.
Проведенные к настоящему моменту исследования во многом неполны, и не дают ответов на многие важные вопросы. В частности, ограничивается ли влияние тимусных гормонов только лимфоцитарной системой, обеспечивающей адаптивный иммунитет, или же эти эффекты носят более универсальный характер, регулируя также активность клеток врожденного иммунитета. Кроме этого, подавляющее большинство проведенных исследований влияния тимусных пептидов на воспалительные реакции были связаны с острыми краткосрочными ответами иммунных клеток на бактериальные клетки или токсины. Между тем, воспаления являются сложными, часто длительными процессами системного характера, вовлекающими практически все системы организма и, прежде всего, они сопровождаются нарушениями регуляции иммунной системы (Alexander et al., 1994). В качестве примеров можно назвать системные воспалительные синдромы, такие как сепсис, или аутоиммунные заболевания. Терапия воспалений, вызванных инфекциями, направлена, в первую очередь, на уничтожение микроорганизмов. Вместе с тем, другим подходом к терапии различных инфекционных, а также стерильных воспалительных и аутоимунных заболеваний является также подавление «чрезмерных» ответов иммунных клеток (Gilroy et al., 2004, Kortylewski et al., 2007). Цель такой модулирующей терапии состоит в восстановлении баланса между провоспалительными и антивоспалительными медиаторами. Последние исследования показывают, что модуляция иммунного и воспалительного ответа дает значительные преимущества при лечении различных воспалительных заболеваний (Ryan et al., 2002). До сих пор имеется очень мало сведений о роли тимусных пептидов в регуляции таких хронических системных патологий. Поскольку тимусные гормоны интегрированы в нейроэндокринные системы и в систему стрессового ответа, и как показывают наши предварительные данные (Лунин, канд. дисс, 2008), способны модулировать активность зрелых иммунных клеток, представляет интерес изучить их применение для коррекции иммунного дисбаланса в условиях хронических воспалений.
Кроме того, имеется большой пробел в области исследования молекулярных механизмов действия тимусных гормонов на иммунные клетки. До сих пор неизвестны первичные мишени (рецепторы) этих гормонов, и почти неизучена роль внутриклеточной сигнализации в регуляции активности иммунных клеток тимусными пептидами.
Цель и основные задачи. Целью настоящей работы является исследование регуляции системного воспалительного ответа пептидными гормонами тимуса и изучение эффективности их применения для коррекции воспалительных патологий, связанных с нарушением иммунного гомеостаза. В рамках этой цели были поставлены следующие задачи:
1. Изучить влияние тимусных пептидов тимулина и тимопоэтина на клетки системы врожденного иммунитета (макрофаги) in vitro в условиях исключения влияния Т-лимфоцитов, с использованием культивируемых макрофагальных клеток линии RAW 264.7. Исследовать молекулярные механизмы возможных эффектов тимусных пептидов с применением
ингибиторного анализа, а также путем оценки уровня активации внутриклеточных сигнальных каскадов.
2. Изучить влияние тимопентина in vivo в условиях индуцированного хронического
воспаления, вызванного бактериальным токсином и характеризующегося угнетением иммунного
статуса животных. Исследовать механизмы действия тимусных пептидов на продукцию
цитокинов и белков теплового шока разными популяциями иммунных клеток, а также на
цитокиновый профиль в крови.
-
Изучить в условиях in vivo эффективность применения тимусных пептидов тимулина и тимопентина для коррекции иммунного дисбаланса на нескольких моделях аутоиммунных заболеваний, характеризующихся разной степенью тяжести патологических симптомов. Исследовать молекулярные и клеточные механизмы влияния тимусных пептидов путем изменения продукции цитокинов, белков теплового шока и белков нескольких сигнальных каскадов в иммунных клетках. Изучить влияние тимусных пептидов на активность субпопуляций лимфоцитов-хелперов ТЫ и ТЫ 7, значимых для развития аутоиммунного заболевания.
-
Изучить эффективность использования тимусного пептида тимулина в сочетании с препаратом, блокирующим активность провоспалительного сигнального каскада NF-кВ для коррекции иммунного дисбаланса в условиях аутоиммунного воспаления.
5. В рамках поиска возможных мишеней тимусных пептидов с использованием
современных методов молекулярного моделирования изучить взаимодействие некоторых
тимусных пептидов с различными элементами комплекса Т-клеточного рецептора с белком
главного комплекса гистосовместимости I типа (TCR-MHC I), определить аффинность такого
связывания, а также подобрать такую структурную модификацию пептида, для которой
аффинность связывания была бы выше, чем у исходного варианта пептида.
Научная новизна. 1) При проведении исследований впервые показано, что в условиях хронического воспаления септического типа, индуцированного эндотоксином и сопровождающегося иммунным дисбалансом, применение тимопентина приводит к торможению иммунодепрессии, развивающейся в процессе хронического воспаления, а также к уменьшению смертности животных. Это выражается:
-
в повышении сниженной в условиях хронической интоксикации продукции цитокинов ИЛ-2 и ИФН-у лимфоцитами селезенки, а также в нормализации продукции ФНО-а и N0 перитонеальными макрофагами, и уровня исследованных провоспалительных цитокинов в крови.
-
в нормализации сниженного при токсическом стрессе количества лимфоцитов в тимусе.
с) в увеличении продукции лимфоцитами селезенки индуцибельной формы белка теплового шока БТШ72, который, будучи шаперонным белком, является важным элементом системы защиты клетки от повреждений. Впервые показано, что тимусные пептиды тимулин и тимопентин непосредственно воздействуют на макрофаги в условиях исключения влияния Т лимфоцитов. Таким образом, регуляторное действие тимусных пептидов касается не только адаптивной иммунной системы, но и клеток врожденного иммунитета. А именно:
-
показано, что пептиды повышали активность нестимулированных макрофагов, что выражалось в увеличении продукции макрофагами провоспалительных цитокинов ФНО-а, ИЛ-6 и ИЛ-1. Установлено, что стимулирующие эффекты тимусных пептидов на продукцию цитокинов, по меньшей мере, частично опосредуются активацией каскадов NF-кВ и SAPK/JNK.
-
ингибирующие эффекты тимусных пептидов на активированные эндотоксином клетки макрофагальной линии RAW 264.7 проявлялись только в сочетании с ингибиторами сигнальной трансдукции. Таким образом, они отличались от ранее наблюдавшихся эффектов in vivo, где введение тимулина сильно уменьшало ответ клеток на эндотоксин.,
-
влияние тимусных пептидов на макрофагальные клетки зависело от состояния клеток: была показана активация нестимулированных макрофагов и подавление активности ЛПС-стимулированных клеток. Эффекты тимулина были более ингибиторными, а эффекты тимопентина - более стимулирующими.
Впервые изучен эффект тимулина и тимопентина в условиях экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (ЭАЭ), моделирующего рассеянный склероз:
-
впервые показан двухфазный цитокиновый ответ при ЭАЭ, где первая (более ранняя) фаза характеризовалась повышением уровня цитокинов, продуцируемых субпопуляцией Thl (в частности, ИФН-у), а вторая (более поздняя) характеризовалась повышением уровня цитокинов, продукцируемых клетками Thl7 (в частности, ИЛ-17). Такой характер ответа был позже подтвержден на другой модели ЭАЭ.
-
впервые показан защитный эффект тимулина и тимопентина в условиях ЭАЭ - пептид значительно снижал выраженность симптомов рассеянного склероза. Эффект тимулина (но не тимопентина) сохранялся после отмены введения гормона.
-
механизм защитного эффекта пептидов связан с влиянием на продукцию провоспалительных цитокинов. Тимулин более эффективно предотвращал ответ клеток Thl7, характерный для аутоимунных реакций, тогда как тимопентин снижал «типичный» провоспалительный ответ, обусловленный клетками Thl.
4) Впервые изучена возможность коррекции тяжелой формы рассеянного склероза,
характеризующейся серьезной симптоматикой и высокой летальностью, при помощи
тимусного пептида тимулина, ингибитора сигнального каскада NF-кВ и комбинированного
применения этих двух препаратов.
-
подтвержден двухфазный цитокиновый ответ с первичной активацией клеток ТЫ и последующей активацией клеток ТЫ7.
-
показан защитный эффект тимулина и ингибитора каскада NF-kB на симптоматику заболевания, хотя полного излечения не наблюдали.
-
показано высокое сходство эффектов тимулина и ингибитора каскада NF-kB и отсутствие аддитивности их эффектов, что позволяет предполагать одинаковые механизмы действия этих препаратов.
5) Впервые с помощью современных средств компьютерного моделирования
продемонстрирована вероятность высокоаффинного взаимодействия тимусного пептида
тимопентина с рецепторным комплексом TCR-MHC I. Разработаны модификации пептида,
обладающие более высокой аффинностью связывания с указанным рецептором, чем
исходный пептид, которые могут стать перспективными лекарственными препаратами.
Теоретическая и практическая значимость
Проведенные экспериментальные и теоретические исследования, касающиеся регуляции иммунного гомеостаза с участием пептидных гормонов тимуса, позволяют расширить и систематизировать общее понимание особенностей разных тимусных пептидов, что весьма важно с точки зрения разработки новых стратегий их применения. Полученные данные об эффективности тимусных пептидов для коррекции патологий воспалительного характера, связанных с иммунным дисбалансом, расширяют представления о терапевтическом потенциале этих соединений, открывая новые возможности для их клинического применения и позволяя подбирать режимы коррекции с учетом особенностей конкретных патологий.
Положения, выносимые на защиту
-
Установлено, что два тимусных пептида, обладающих разными свойствами, тимулин и тимопентин, могут использоваться для коррекции иммунного дисбаланса при системных воспалительных заболеваниях.
-
Показано, что для коррекции патологии, связанной с хроническим воспалительным процессом септической природы и характеризующейся иммунной депрессией, эффективным является применение тимопентина, обладающего иммуностимулирующим эффектом.
3. Установлено, что индуцированный рассеянный склероз характеризуется
последовательной активацией различных популяций Т-хелперов, а тимусные пептиды тимулин и
тимопентин могут по-разному влиять на разные стадии аутоиммунного воспалительного
процесса. Показано, что для коррекции аутоиммунного воспаления при рассеянном склерозе,
характеризующегося патологической активацией иммунных клеток, более эффективным является тимулин, обладающий противовоспалительным эффектом. Доказано, что механизмом действия тимулина в данном случае является блокада сигнального каскада NF-kB.
4. Установлено, что тимусные пептиды тимулин и тимопентин способны влиять на клетки
системы врожденного иммунитета (макрофаги) в условиях полного исключения влияния Т-
лимфоцитов. Показано, что эффективность пептидов зависит от состояния клеток: был отмечен
стимулирующий эффект при воздействии на нестимулированные клетки, и слабый
ингибирующий эффект при воздействии на клетки, стимулированные бактериальным токсином.
5. На основании молекулярного моделирования прогнозируется возможность
высокоаффинного взаимодействия тимусного пептида тимопентина с рецепторным комплексом
Т-клеточного рецептора. Разработаны модификации пептида, обладающие более высокой
аффинностью связывания с указанным рецептором, чем исходный пептид, на основе которых
могут быть разработаны новые лекарственные препараты.
Апробация диссертации
Положения диссертации обсуждались на следующих научных мероприятиях: 4 Международный междисциплинарный конгресс Нейронаука для медицины и психологии. (Судак, Украина, 2008 г); 5 Международный междисциплинарный конгресс Нейронаука для медицины и психологии. (Судак, Украина, 2009 г); Итоговая конференция ИБК РАН, (Пущино Россия, 2012 г); Международная конференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», (Пущино Россия, 2009 г). 7 Международный междисциплинарный конгресс Нейронаука для медицины и психологии. (Судак, Украина, 2011 г); 8 Международный междисциплинарный конгресс Нейронаука для медицины и психологии. (Судак, Украина, 2012 г); 7 Международная конференция по сигнальной трансдукции в лейкоцитах, (Кос, Греция, 2013
г).
Объем и структура диссертации
