Введение к работе
Актуальность темы. Остеопороз - одно из наиболее распространенных метаболических заболеваний скелета - представляет собой серьезную медицинскую и социальную проблему (Цейтлин, 2002; Марченкова, 2000) из-за невозможности его выявления на ранних стадиях, сложности лечения, частых осложнений в виде трудно срастающихся переломов.
В основе развития данной патологии лежит нарушение ремоделирования костной ткани. Костное ремоделирование является процессом, благодаря которому происходит рост и постоянное обновление костной ткани. В норме ремоделирование костной ткани включает в себя процесс резорбции участка «старой» кости остеокластами и обязательный, достаточный для заполнения резорбционных лакун, процесс биосинтеза компонентов костного матрикса остеобластами. Сдвиг баланса ремоделирования в сторону резорбции является наиболее частой предпосылкой разрежения костной ткани и развития остеопороза.
Концентрация кальция и фосфора, а также активность тартрат-резистентной кислой фосфатазы в сыворотке крови до сих пор используются для оценки состояния процессов резорбции костной ткани как показатели деятельности остеокластов, а активность щелочной фосфатазы - для оценки процессов формирования и деятельности остеобластов (Камышников, 2002). Эти простые и недорогие методы диагностики обладают рядом недостатков, главными из которых являются невысокая информативность, низкая специфичность, а также существующие противоречивые данные об их изменении при развитии остеопороза (Баранов, 2002).
После растворения гидроксиапатитов происходит расщепление органических компонентов костного матрикса с участием протеолитических ферментов остеокластов. Ключевая роль в этом процессе принадлежит цистеиновой протеазе катепсину К (Buhlung et al., 2004; Buhlung et al., 2006). Предполагают, что он вовлечен в развитие остеопороза различного генеза, в том числе - сенильного и развивающегося у женщин в постменопаузальном периоде (Buhlung et al., 2004; Buhlung et al., 2006). Также показано участие матриксных металлопротеаз (ММП) первого, второго, седьмого, девятого, тринадцатого типа в ремоделировании костной ткани, однако сведения об их участии в резорбции кости противоречивы (Vaananen et al., 2000; Hou P. et al., 2004; Henriksen K. al., 2006). К настоящему времени не изучена степень вовлеченности катепсина К и ММП в патогенез разных вариантов остеопороза и не определена возможность использования сывороточной активности катепсина К и ММП в качестве прогностических маркеров.
Логично предположить, что заболевание, связанное с усилением активности протеаз может смещать баланс протеазы/ингибиторы в организме в сторону протеаз за счет выхода протеаз в кровяное русло. Изменение этого баланса, как показали исследования последних лет, создают условия для
развития многих патологий (Фаламеева, 2003; Ярыгина, 2005; Юзько, 2007) и, вероятно, могут усугублять течение основного заболевания. Контроль за активностью протеаз, попавших в кровоток из различных органов и тканей осуществляется а2-макроглобулином (а2-МГ) и арантитрипсином (агАТ). А2-макроглобулин обладает свойством захватывать и ингибировать все известные классы пептидаз (Веремеенко, 1998). Комплексы аг-макроглобулина с протеазами элиминируются из крови в течение 2 минут (Зорин, 2004), поэтому активность а2-макроглобулина в сыворотке отражает ее ингибиторные возможности. Кроме того, а2-МГ осуществляет транспорт различных цитокинов, в том числе - трансформирующего фактора роста Р, стимулирующего остеобласты и подавляющего активность остеокластов. Однако, после связывания с протеазами, комплексы цитокин-ингибитор-протеаза опознаются макрофагами печени как элементы, подлежащие деградации, поэтому происходит их захват и расщепление. Таким образом, цитокины могут не достигать клеток-мишеней.
Изменения активности а2-МГ и агАТ как резервов, способствующих адаптации организма при усилении резорбции костной ткани, а также возможность частичной передачи функций инактивации протеаз от одного ингибитора другому при усилении резорбции костного матрикса не изучались. Это особенно актуально при исследовании сенильного остеопороза, поскольку старение организма сопровождается усилением катаболических процессов, увеличением проницаемости в том числе, -лизосомальных мембран из-за окислительных повреждений. Кроме того, естественный процесс старения приводит к возникновению различных заболеваний, что существенным образом влияет на возникновение и течение остеопороза в этом возрасте. В частности, установлено, что развитие остеопороза у пожилых людей происходит на фоне болезней печени (Nakano, 1996; Kissler, 2002; Катикова, 2004). Печень является центральным органом в обеспечении организма пластическим материалом. Функциональные возможности печени в значительной мере определяются способностью осуществлять биосинтез и деградацию различных белков (Шкурупий, 1989). В печени происходит биосинтез сывороточных ингибиторов протеаз а2-МГ и а]-AT, а также деградация их комплексов с протеазами в лизосомах. 90% внутриклеточного лизосомального протеолиза реализуется за счет согласованного действия катепсинов В, L, D (Рывняк, 2004). Поэтому изменение активности этих протеаз в печени может определять системные последствия, во-первых, из-за возможного нарушения пластической функции печени, а во-вторых, - из-за возникшего дисбаланса протеазы/ингибиторы в организме.
Для установления особенностей этиопатогенеза заболеваний в настоящее время большое значение придается исследованиям на животных-моделях. Адекватность модели определяется ее приближенностью к процессам, происходящим в организме человека. Крысы OXYS могут
являться подходящей моделью для исследования сенильного остеопороза, поскольку развитие остеопороза у этой линии крыс сопровождается такими проявления старения, как усиление катаболизма белка, активация свободнорадикального окисления, нарушениями в работе печени из-за развивающихся фиброзных изменений, характерных для стареющего организма.
Еще одной распространенной формой остеопороза, а потому актуальной для исследования на животных-моделях, является остеопороз, развивающийся вследствие эстрогеновой недостаточности. Если постменопаузальный остеопороз активно изучается и более или менее успешно лечится, то остеопороз, вызываемый эстрогеновой недостаточностью у лиц женского пола в молодом возрасте изучен не достаточно хорошо. Особенную значимость этой проблеме придает то, что от формирования костной ткани в детском и подростковом возрасте зависит прочность костной ткани у взрослых. Значительную сложность в лечении остеопороза, развивающегося в молодом возрасте, представляет выбор препаратов лечения, поскольку препараты для взрослых обладают побочными эффектами, оказывающими влияние на рост и развитие молодого организма (Шварц, 2002; Фаламеева, 2008). Ранелат стронция (PC), применяемый для лечения постменопаузального остеопороза, способствует увеличению минеральной плотности костной ткани (МПКТ). В опытах in vivo и in vitro (Atkins, 2009), а также проспективных исследованиях (Meunier, 2004) он проявил себя не только как ингибитор резорбции, но и как стимулятор формирования костной ткани. Тем не менее, влияние PC на процессы резорбции костной ткани при лечении ОП в молодом возрасте не изучено.
Целью настоящей работы явилось изучение роли изменений в системе протеаз и их сывороточных ингибиторов в развитии разных форм остеопороза и влияния ранелата стронция на активность протеаз в костной ткани при развитии остеопороза на фоне эстрогеновой недостаточности.
В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:
Исследовать особенности изменения активности катепсина К и матриксных металлопротеаз (ММП) в костной ткани и сыворотке крови у животных при остеопорозе различного генеза и их взаимосвязь с плотностью костной ткани.
В эксперименте исследовать концентрацию кальция, фосфора, активность щелочной и тартрат-резистентной кислой фосфатаз в сыворотке крови в зависимости от формы остеопороза и оценить их диагностическое значение в сравнении с диагностическим значением сывороточной активности катепсина К.
Изучить изменения активности катепсинов В, L, D в печени и катепсин L-подобной активности в сыворотки крови у быстро стареющих крыс линии OXYS до и после появления признаков остеопороза.
Оценить изменения активности сывороточных ингибиторов аг антитрипсина и аг-макроглобулина при различной активности цистеиновых и металлопротеаз в костной ткани, печени и сыворотке крови экспериментальных животных.
Изучить влияние ранелата стронция в составе препарата «Бивалос» на исследуемые параметры при остеопорозе у крыс, развивающегося в результате эстрогеновой недостаточности.
Научная новизна
Выявлено, что повышение активности катепсина К и снижение активности остеобластов является общей чертой сенильного остепороза у крыс линии OXYS и остеопороза, развивающегося у самок крыс Wistar после овариэктомии. Активность катепсина К в сыворотке крови отражает активность резорбционного процесса. Установлено, что при сенильном остеопорозе у преждевременно стареющих крыс OXYS активность катепсина К в костной ткани позвоночника повышается в меньшей степени, чем при развитии остеопороза у овариэктомированных самок крыс Wistar. Показано, что активность ММП до манифестации остеопороза у крыс OXYS снижена по сравнению с группой контроля в отличие от остеопороза, вызываемом овариэктомией у самок крыс Wistar, при котором активность ММП в костной ткани не изменяется.
Показано, что остеопороз у крыс линии OXYS протекает на фоне усиления активности катепсинов L и D в печени и катепсин L-подобной сыворотки крови на отдельных этапах онтогенеза по сравнению с крысами Wistar аналогичного возраста. Показано увеличение активности сывороточного ингибитора а2-макроглобулина при одновременном снижении активности протеаз в кровяном русле у преждевременно стареющих крыс OXYS.
Установлено, что на ранних сроках после овариэктомии наблюдается сдвиг баланса ремоделирования в сторону процессов формирования костной ткани позвоночника и бедренной кости. На момент достижения максимума количества жировой ткани и массы крыс приходится максимум МП позвоночника и бедренной кости и начало снижения МПКТ скелета в целом. На более поздних стадиях после овариэктомии наблюдается усиление процессов формирования костной ткани в отделах скелета, на которые приходится меньшая физическая нагрузка. Одновременно с этим происходит замедление процессов формирования в костной ткани позвоночника и бедренной кости и усилением резорбтивных процессов этих отделах скелета, что выражается в снижении их минеральной плотности.
Впервые показано, что введение ранелата стронция в дозе 200 мг/кг молодым овариэктомированным самкам крыс увеличивает скорость и объем ремоделирования костной ткани. На первом этапе это выражается в значительном увеличении формирования костной ткани позвоночника и бедренной кости. На втором этапе усиливается резорбция в позвоночнике,
задерживается формирование костной ткани в бедренной кости и, одновременно, усиливается формирование в переферических отделах скелета. Увеличение объемов ремоделирования костной ткани под действием PC приводит к уменьшению активности ММП и а2-макроглобулина в сыворотке крови.
Научно-практическая значимость
Результаты исследования выявляют неодинаковую степень вовлеченности протеаз в ремоделировании костной ткани при развитии разных форм остеопороза. Исходя из этого, определение их активности позволяет подобрать более адекватную схему лечения остепороза. Поскольку активность катепсина К в костной ткани и сыворотке крови увеличивается задолго до манифестации остеопороза, определение его активности в сыворотке крови может быть использовано для ранней диагностики данного заболевания.
Основные положения, выносимые на защиту
Увеличение активности катепсина К в костной ткани у преждевременно стареющих крыс OXYS и у овариэктомированных самок крыс Wistar является причиной избыточной резорбции костного матрикса, что вместе со снижением активности остеобластов приводит к развитию остеопороза.
Активность катепсина К в сыворотке крови является показателем усиленной резорбции костной ткани при развитии остеопороза и может быть использована в качестве диагностического маркера.
Дополнительным фактором в развитии сенильного остеопороза у преждевременно стареющих крыс линии OXYS является нарушение соотношения протеазы/ингибиторы протеаз в организме.
Введение ранелата стронция в дозе 200 мг/кг молодым овариэктомированным самкам крыс Wistar вызывает нарушение естественных механизмов сохранения костной плотности на ранних этапах после овариэктомии.
Апробация работы Результаты работы доложены на Съезде физиологов Сибири, Томск, 2005; на Физиологическом Съезде, Москва, 2007; на конференции молодых ученых Института физиологии СО РАМН, Новосибирск, 2007; на конференции молодых ученых, посвященной патологии позвоночника, Новосибирск, 2008; на Всероссийской конференции молодых ученых «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины», Москва 2008; на Съезде физиологов Сибири, Барнаул, 2008.
Структура и объем диссертации Диссертация состоит из введения, четырех глав, включающих литературный обзор, материалы и методы исследования, результаты исследования, обсуждение результатов, после которых следуют заключение, выводы и список цитируемой литературы, содержащий 272 источника, в том числе 201 зарубежный. Работа изложена на 166 страницах машинописного текста, содержит 7 таблиц и 23 рисунка.
