Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 9
2.1. Современные представления о механизмах реализации биологического эффекта стероидных гормонов 9
2.2. Рецепторы стероидных гормонов 14
2.3. Мышечная деятельность и андрогены 31
3. Собственные исследования 37
3.1. Методическая часть 37
3.1.1. Постановка опытов на животных 37
3.1.2. Препаративные методы исследования 38
3.1.2.1. Выделение ядер из скелетных мышц 38
3.1.2.2. Получение сыворотки крови 39
3.1.2.3. Очистка 3Н-стероидов 40
3.1.3. Аналитические методы исследования 42
3.1.3.1. Определение величины связывания андрогенов ядрами скелетных мышц 42
3.1.3.2, Определение константы диссоциации и количества связывающих мест ядерных рецепторов андрогенов 44
3.1.3.3. Исследование процессов диссоциации и инактивации ядерных андрогенрецепторных комплексов 45
3.1.3.4. Обработка ферментами изолированных ядер скелетных мышц и экстрагированных из них рецепторов андрогенов 46
3.1.3.5. Измерение радиоактивности 47
3.1.3.6. Количественное определение ДНК 47
3.1.3.7. Определение концентрации 19-нортестостерона в сыворотке крови 47
3.1.3.8. Математическая обработка результатов 48
3.2. Результаты исследования 60
3.2.1. Сравнительная характеристика методов разделения свободного и белоксвязанного стероида
3.2.2. Экстрагируемость связанного с ядрами -стероида растворами КС1 различной концентрации 62
3.2.3. Зависимость связывания андрогенов ядрами скелетных мышц от температуры и времени инкубации 64
3.2.4. Анализ связывания андрогенов по Скэтчарду
3.2.5. Лигандная специфичность связывания андрогенов ядрами скелетных мышц 71
3.2.6. Диссоциация и инактивация ядерных андрогенрецеп-торных комплексов в скелетных мышцах 73
3.2.7. Природа ядерных рецепторов андрогенов в скелетных мышцах 78
3.2.8. Влияние введения нортестостерона на связывание андрогенов ядрами скелетных мышц 81
3.2.9. Влияние физических нагрузок на рецепцию андрогенов ядрами скелетных мышц 87
4. Обсуждение результатов 93
5. Выводы 103
6. Указатель литературы 105
- Современные представления о механизмах реализации биологического эффекта стероидных гормонов
- Определение величины связывания андрогенов ядрами скелетных мышц
- Экстрагируемость связанного с ядрами -стероида растворами КС1 различной концентрации
- Диссоциация и инактивация ядерных андрогенрецеп-торных комплексов в скелетных мышцах
Современные представления о механизмах реализации биологического эффекта стероидных гормонов
Гормонам, как факторам регуляции метаболических процессов в организме человека и животных „в последние десятилетия придается все возрастающее значение специалистами клинических и экспериментальных дисциплин. Этому способствуют современные достижения в области фундаментальных наук - физики, химии, математики, на основе которых создаются новые и совершенствуются существующие методы познания биологической сущности эндокринной системы, разрабатываются прикладные аспекты физиологии, биохимии и патологии гормональной регуляции (4, 12, 38, 42).
Трудно себе представить решение проблемы гормональной регуляции без глубокого изучения механизма действия гормонов. В последние годы опубликован ряд работ обзорного и монографического характера, в которых в общем виде и в деталях изложены экспериментальные факты и теоретические представления авторов к моменту публикации работ об организационной структуре и функции механизма действия гормонов и гормональной регуляции (19, 27, 31, 92, 123).
При анализе литературы по вопросу о механизме действия гормонов принципиальным представляется то, что установлено различие в путях реализации биологического эффекта гормонов белковой и полипептидной природы и гормонов небелковой структуры. Эти различия заключаются в клеточной топографии начального этапа действия гормона - узнавания и восприятия гормона субстратом действия, которым по общему современному представ 10 лению является рецептор.
Если для белковых и полипептидных гормонов место взаимо действия ("встречи") гормона с рецептором является плазматичес»-кая мембрана (I, 20, 24, 43, 61, 148), то контакт стероидных гормонов с рецептором осуществляется внутри клетки в цитоплазме (19, 31, 84). В последние годы появились работы (I, 24) показывающие что в механизме действия белковых гормонов кон-цепция о мембранной локализации рецепторв в клетках адишенях может и должна быть дополнена этапом внутриклеточного существо» вания (цитоплазматического и даже ядерного) белкового гормона, скорее всего в комплексе со специфическим рецепторним белком. Поскольку предметом нашего исследования является рецепция сте# роидных гормонов, и специально, андрогенных гормонов, то мы ограничимся лишь вышеупомянутыми сведениями по проблеме рецепт ции белковых гормонов и более детально остановимся на основном предмете работы.
В обстоятельной монографии Мейнуоринга (19), посвященной механизму действия андрогенов, построена схема» модель механизма реализации эффекта этих гормонов на ткани органов - мишеней. Её сущность состоит в определенной последовательности биохимических явлений, обеспечивающих: 1) контакт андрогена с цитоплазматическим белком, специ« фически взаимодействующим с гормоном; 2) транслокацию гормонрецепторного комплекса в ядро клетки» мишени; 3) лимитированное во времени взаимодействие активированно го комплекса со специфическими участками хроматина и индукцию биохимических процессов путем активации соответствующей матриц - 11 цы ДНК; 4) снятие эффекта действия гормона в результате деграда ции и элиминации из клетки продуктов гормонрецепторного комп» лекса. Модель механизма действия андрогенов в том виде, как ее себе представляет Мейнуоринг, приведена на рисунке 2.1. Данные современной литературы в области биохимии стероид ных гормонов позволяют прийти к общему заключению, что биоло -гический эффект андрогенов в отличие от эффекта эстрогенов, прогестинов и кортикостероидов реализуется при обязательном их включении в метаболический процесс. При этом, согласно Хор , тон и сотр.,(79), периферический метаболизм андрогенов охватывает и процесс взаимопревращения андростендиона в тестостерон. Учитывая то, что основным андрогеноподобным стероидом, секре-тируемым надпочечниками, является андростендион, становится очевидной возможность обеспечения потребностей организма в андрогенах в определенных пределах за счет надпочечников благо даря периферическому метаболизму. Однако процесс образования тестостерона из андростендиона осуществляется не у всех животных и не во всех тканях.(19). Важную роль в механизме действия андрогенов с участием периферического метаболизма играет превращение андрогенов в эстрогены (26). Доказательством реальности такого положения являются работы Нимрод и сотр. (117), Нафтолин и сотр.,(115), Киршнер и сотр. (93), Швейкерт и сотр. 146), Редди и сотр. (129), Виттак и сотр.
Определение величины связывания андрогенов ядрами скелетных мышц
Одним из клинических признаков, отличающих мужской организм от женского, является более выраженное развитие мышечной системы. Уже эти данные послужили основанием клиницистам и экспериментаторам допустить наличие связи между мужскими половыми гормонами и активностью мышечной деятельности. Подтверждение этому представлению можно видеть на примере генотипичес-ких женщин, больных адреногенительным синдромом, у которых мужской фонотип с активным развитием мускулатуры возникает в результате гиперсекреции корой надпочечников андрогеноактив-ных фракций стероидов (25).
На связь состояния скелетной мускулатуры с андрогенными гормонами можно найти указание в экспериментах Дональдсона и сотр. (64, 65), в которых авторы установили, что систематическая физическая нагрузка у белых крыс, приводящая к увеличению массы скелетных мышц, сопровождается и увеличением массы семенников. Подтвердив данные Дональдсона и сотр. о повышении массы семенников при мышечной деятельности, Русин (32, 34), используя метод экстирпации половых желез, получил дополнительные доказательства зависимости мышечной деятельности от интенсивности продукции и секреции андрогенов. Кастрация мышей приводила к снижению адаптации животных- к мышечной деятельности.
В исследованиях Куоппасалами и сотр. (98), Лангер и сотр. (99), выполненных на спортсменах, было установлено повышение уровня тестостерона и андростендиола в крови во время интенсивной мышечной работы. Авторы исследовали различные по интенсивности и длительности физические нагрузки.
Прямым определением андрогенов в крови радиоиммунологическими методами у крыс, выполнявших систематические физические упражнения, Коцегуб и Фельдкорен (15) также показали усиление андрогенной активности. Авторами было обнаружено повышение уровня тестостерона в крови на 30-50%, при этом отмечена положительная связь между степенью тренированности и концентрацией гормона. Обратную зависимость - снижение содержания тестостерона в крови при физических нагрузках выявили в своих исследованиях Геценеч и сотр.(76); правда, нагрузки в данных наблюдениях рассматривались как длительные (до 7 часов).
Каков механизм возрастания уровня андрогенов при выполнении физических нагрузок, в настоящее время с полной уверенноетью невозможно определить. Как уже указывалось ранее, ведущую роль в этом процессе играют половые железы. Однако, опираясь на работы ряда авторов (98, 99), можно признать, что повышение андрогенной активности семенников в процессе физической нагрузки не связано с активацией лютеинизирующей функции гипофиза, то есть активация системы гипофиз - гонады не является единственным процессом, обеспечивающим гиперандрогенемию.
Возможно, увеличение концентрации андрогенов связано с уменьшением объема крови при физических нагрузках (160), но может быть обусловлено и какими-то другими механизмами. В частности, не исключена возможность роли периферического механизма образования андрогенов.
Возвращаясь к адреногенитальному синдрому, рассматривая его как естественную модель гиперандрогенизации надпочечниково-го происхождения, вполне обосновано допустить, что система гипоталамус - гипофиз - надпочечники вносит существенный вклад в механизм повышения концентрации андрогенов в периферической крови в процессе выполнения мышечной работы, как проявление адаптивной реакции целостного организма к физическим нагрузкам. Хотя надпочечниками продуцируется в основном андростендион, в периферических тканях и в крови он может активно превращаться в тестостерон (19). Система белков крови, связывающих половые стероиды, в ситуации повышенной функции многих систем организма в период усиленной мышечной работы образует комплексы с андрогенами. Это предохраняет клетки органов и систем организма от повреждающего действия избыточной концентрации свободного гормона.
На значительную активацию гипоталамо-гипофизарно-надпо-чечниковой системы у спортсменов, специализирующихся в различных видах спорта, и у экспериментальных животных при физических нагрузках указывают работы Виру (6 - 9), что подтверждает объективность нашей трактовки роли надпочечниковой системы в ге-незе гиперандрогенемии при мышечной деятельности.
В анализе функционального значения повышенного уровня тестостерона в периферической крови при физических нагрузках чрезвычайно важным фактом является фазность в динамике содержания гормона после мышечной работы, выявленная в лаборатории гормональной регуляции Ленинградского НИИ физической культуры (15). В опытах на белых крысах, выполнявших систематические физические нагрузки, авторами было установлено, что через 1,5-2 часа отдыха концентрация тестостерона в крови снижается до минимальных величин с последующим возрастанием и достижением максимума к б - 7 часу периода восстановления. При этом в восстановительный период имеет место увеличение индивидуальной вариабельности показателя концентрации тестостерона, зависящее от степени тренированности животных. Одновременно в литературе появились данные зарубежных авторов (98), полученные при обследовании спортсменов, в которых также указывается на изменение уровня тестостерона в крови в процессе тренировок. Однако максимум повышения уровня гормона у людей достигается к 24 - 48 часам восстановительного периода.
Экстрагируемость связанного с ядрами -стероида растворами КС1 различной концентрации
Для разделения свободного и белоксвязанного стероида нами были использованы трехкратная промывка буфером, сорбция свободного стероида на декстран-угла и разделение свободного 1 и связанного стероида на сефадексе ьн-20 . В таблице 3.4 приведены количественные характеристики каждого из этих методов.
Промывка ядер. Это наиболее простой метод, не требующий дополнительно никаких реактивов и оборудования и, соответственно, затрат времени на их подготовку. Однако он имеет существенные недостатки, также как высокий процент неспецифического связывания (63,9 2,8$) при относительно небольшом общем связывании 3Н-стероида (500-2000 имп/мин.). Кроме того, при этом происходит частичная потеря ядер и вышедших из них при инкубации рецепторов.
Обработка декстран-углем. При применении этого метода обеспечивается более высокая величина общего связывания 3Н-стероида (1200 - 4000 имп/мин) и отсутствуют упомянутые выше потери ядер и рецепторов. Однако доля не специфического связывания при этом остается столь же высокой (66,4 2,6$), затраты времени не сокращаются.
Разделение на сефадексе ьн-20 . Метод гельфильтрации дает наилучшие результаты, поскольку обеспечивает наибольшую долю специфического связывания (76,5+2,6$) и, следовательно, более точное его измерение при снижении почти в три раза доли неспецифического связывания (23,5+2,6$) по сравнению с предыдущими методами. Потери ядер и рецепторов при этом отсутствуют. К недостаткам этого метода относятся использование большого числа колонок, импортных реактивов и практически полное отсутствие возможности механизировать процесс сбора фракций. Кроме того, приготовление колонок и регенерация сефадекса после их использования занимают значительное время. Однако, несмотря на эти недостатки, в большинстве экспериментов нами был использован именно этот метод.
На рисунке 3.2 представлена зависимость количества 3Н-19-нортестостерона, экстрагированного из ядер раствором КС1 . от: концентрации последнего. Как видно из рисунка, значительная (до 30%) часть белоксвязанного стероида экстрагируется инкубационным буфером (0,025 М КС1 ), то есть происходит его солюбилизация в процессе инкубации. При увеличении концентрации ксі до 0,3 М количество специфически связанного стероида в экстракте возрастает, а при ее дальнейшем увеличении не изменяется. Возрастание общего количества радиоактивности в экстракте в последнем случае происходит только за счет увеличения неспепнфического связывания. Следует отметить, что при экстракции ядер растворами ксі в концентрации выше 0,4 М из ядер выходит большое количество ДНК, образуя желеобразный осадок, от которого очень трудно освободиться центрифугированием. В силу указанных причин для экстракции белоксвязанного стероида из ядер мы применяли 0,4 М К01
Нами было изучено влияние предварительной обработки ядер ДНКазой на экстракцию белоксвязанного стероида (таблица 3.5). Установлено, что чем ниже концентрация КС1 в экстрагирующем растворе, тем больший эффект оказывает ДНКаза на экстракцию 3Н-стероида. Так, при экстракции инкубационным буфером обработка ДНКазой приводит к увеличению белоксвязанной радиоактивности в экстракте в 1,9 раза по сравнению с контролем, тогда как при экстракции 0,4 М ксі такая обработка увеличивает этот показатель в среднем всего на 5%,
Исследования показали, что раствором 0,4 М ксі экстрагируется лишь около половины связанной ядрами радиоактивности. Полностью солюбилизировать белоксвязанный 3Н-стероид удается лишь растворением ядер в 2М КС1 - 5 М мочевине, Обработка ядер ДНКазой в этом случае непосредственно не приводит к увеличению белоксвязанной радиоактивности, но предотвращает образование желеобразной массы ДНК, чем способствует улучшениюзсловий для последующей гельфильтрации.
Температурно-временная зависимость связывания андрогенов ядрами скелетных мышц представлена на рисунке 3.3. Установлено, что максимальное связывание наблюдается при 18 часовой инкубации при 0С. При этих условиях достигается близкое к равновесию состояние системы. В дальнейшем связывание снижается до 80% к 24 часам инкубации, а к 42 часам эта величина составляет 68%, При повышенных (20 - 25С) температурах удается достичь величины связывания, составляющего 62 - 65% от максимально возможного, через I час инкубации. В дальнейшем связывание снижается, причем чем выше температура, тем быстрее происходит снижение. К 3 часам инкубации количество связанного ядрами 3Н-стероида составляет всего 9 - 11$ от максимального. Это свидетельствует о том, что при повышении температуры существенное влияние начинают оказывать процессы инактивации рецепторов андрогенов в ядрах скелетных мышц. Поэтому в качестве основных условий определения связывания андрогенов ядрами нами были приняты температура инкубации - 0С, время инкубации - 18 часов.
Для анализа связывания андрогенов были использованы два подхода: инкубация ядер и их экстракта 0,4 М КС1 с возрастающими концентрациями 3Н-стероида. Характерные кривые, полученные в этих экспериментах, представлены на рисунках 3.4 и 3.5. Как видно из рисунка 3.4, связывание 3Н-19-нортестосте-рона изолированными ядрами скелетных мышц имеет насыщающий характер. Форма кривой характерна для рецепторного связывания. Аналогичные результаты получены при инкубации экстракта ядер раствором 0,4 М КС1 с 3Н-19-нортестостероном (рисунок 3.5). Следует отметить, что в этом случае наблюдается более высокая величина неспецифического связывания, и ее колебания сильнее [ сказываются на точности измерений, чем при инкубации ядер. На рисунке 3.6 представлены данные рисунков 3.4 и 3.5 в координатах Скэтчарда.
Диссоциация и инактивация ядерных андрогенрецеп-торных комплексов в скелетных мышцах
Полученные нами экспериментальные данные убедительно свидетельствуют, что в условиях in vitro изолированные ядра скелетных мышц крысы обладают системой, активно связывающей андрогенные гормоны. Анализ специфичности гормон-рецеп-торного взаимодействия с использованием метода насыщения системы нерадиоактивным лигандом показал следующий порядок сродства рецептора к лигандам: 5 - дигидротестостерон 3 19-нортестостерон тестостерон - эстрадиол е& прогестерон -дексаметазон кортикостерон.
Сходные результаты были получены и другими авторами, работавшими с цитоплазматическими рецепторами мышечной ткани (40, 62, 63) и цитоплазматическими и ядерными рецепторами тканей органов-мишеней (19, 53, 118, 130, 136, 154). Следует отметить, что в исследованиях, выполненных на тканях половой сферы было установлено большее сродство рецепторов как цито-плазматических, так и ядерных к 5 оС -дигидротестостерону и тестостерону, чем к 19-нортестостерону (53, 118, 130, 136). Однако, в работах Стенстада (147) и Тот (154) было показано различие в метаболизме андрогенов в мышцах и тканях органов-мишеней половой сферы. Согласно данным Тот (154), принявшим во внимание включение гормона в обменные процессы, лигандная специфичность рецепторов андрогенов в органах-мишенях и в скелетных мышцах оказалась идентичной.
Величина константы диссоциации ( Кд ) андрогенрецептор-ных комплексов в ядрах скелетных мышц, характеризующая сродство (аффиность) рецептора к гормону, в наших экспериментах была в пределах 10 - 12 нМ (для 19-нортестостерона). Это на порядок выше соответствующей величины для цитоплазматических рецепторов андрогенов мышечной ткани. В работах большинства авторов этот показатель для цитоплазматических и ядерных рецепторов, по-сутцеству, не различается, чем и доказывается природная идентичность рецепторов данного стероида.
Следует отметить, что полученные нами данные:, о величине Kd для ядерного рецептора андрогенов скелетной мышцы не выходят за пределы данных, приводимых другими авторами для ядерных рецепторов других тканей. Нам представляется, что причиной столь большого различия в величине Кд цитоплазматических и ядерных рецепторов, нехарактерного для большинства исследованных тканей, возможно, является наличие быстро диссоциирующих комплексов андрогенов с макромолекулами в ядрах скелетных мышц. "
В пользу этого представления говорят наши исследования по изучению процессов диссоциации и деградации гормонрецеп-торных комплексов. В то время, как. основная часть гормон-рецепторных комплексов практически не диссоциирует при любых условиях, быстро диссоциирующие комплексы распадаются в течение I часа при 0С, приводя к существенному завышению определяемой величины Kd . Определенный вклад в этот процесс может вносить также крайне низкая температурная устойчивость рецепторов андрогенов, особенно, ядерных. С повышениемтемпературы скорость инактивации рецепторов сильно увеличивается, что обуславливает быстрое снижение количества связанных ядрами андрогенов.
Полученные данные свидетельствуют о том, что при инкубации ядер с 3Н-19-нортестостероном при 0С его связывание ядрами определяется только неоккупированными эндогенным стероидом рецепторами андрогенов, а также фракцией рецепторов, образующих быстро диссоциирующие гормон-рецепторные комплексы. Попытки использовать для определения общего количества ядерных рецепторов повышенную температуру инкубации или 0,5 М HaSCN , применяемые рядом авторов (51, 109, 121), оказались безуспешными.
Учитывая эти результаты, полученный нами большой разброс в величине максимального связывания андрогенов методом Скэт-чарда (73) можно объяснить тем, что количество связывающих мест в системе определялось освободившимися в процессе рецепторного цикла молекулами рецепторов, так как в данных экспериментах были использованы животные, которым за I - 1,5 часа до забоя был введен 19-нортестостерон.
Исходя из данных литературы о единой природе цитозоль-ных и ядерных рецепторов стероидных гормонов, следует полагать, что обнаруженный в наших экспериментах андрогенсвязыва-ющий компонент в изолированных ядрах скелетных мышц также является белком. Поскольку экспериментальных данных по этому вопросу применительно к ядрам скелетных мышц в литературе мы не нашли, то провели серию экспериментов по обработке ферментами ядер и 0,4 М ксі экстракта из ядер скелетных мышц крыс и установили, что андрогены связываются белковым компонентом ядра или, по крайней мере, белковая часть его играет ведущую роль в процессе связывания стероида. В пользу такого вывода говорят результаты о почти полном подавлении связывания 19-нортестостерона как изолированными ядрами, так и экстрактом из ядер после ферментативной обработки.
Таким образом, нами впервые установлена белковая природа рецепторов андрогенов в ядрах скелетных мышц и получены новые дополнительные данные в пользу общей концепции о белковой природе рецепторов андрогенов.
Результаты экспериментов по обработке ядер и их экстрактов ДНКазой дают нам основание допустить возможность, что ДНК оказывает на рецепторы стабилизирующее действие, поскольку инкубация обработанного ДНКазой экстракта ядер в течение длительного времени (18 часов) приводит к снижению связывания андрогенов. Эти результаты хорошо согласуются с представлениями ряда авторов, что при связывании с различными естественными (хроматин) и искусственными (ДНК-целлюлоза, гидроксил-апатит) структурами происходит стабилизация рецепторов (30, 106, 158).
