Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Структура боковых петель РНК и их чувствительность к расщеплению (Обзор литературы) 9
1.1. Основные элементы вторичной структуры РНК 9
1.2. Методы исследования структуры баковых петель в ДНК- и РНК-дуплексах 12
1.3. Структура боковых петель в составе РНК 12
1.3.1. Боковая петля, состоящая из одного основания 12
1.3.1.1 Структура однозвенных А петель, полученная с помощью ЯМР и РСА 13
1.3.1.2. Структура однозвенной А петли в составе ДНК:РНК дуплекса 14
1.3.1.3. Расчетная конформация однозвенной А петли в составе дуплекса 15
1.3.2. Однозвенные G-содержащие петли 16
1.3.3. Однозвенные U-содержащие петли 17
1.3.4. Однозвенные С-содержащие петли 20
1.3.5. Структура петель, содержащих более одного нуклеотида 20
1.3.6. Влияние ионов Мд2+ на структуру боковой петли 22
1.4. Изучение структуры РНК, содержащих петли, с помощью электрофореза в нативных условиях и метода индуцированного электрическим полем временного двулучепреломления (transient electric birefringence) 24
1.5. Термодинамические характеристики дуплексов, содержащих боковые петли 25
1.6. Чувствительность фосфодиэфирных связей в боковых петлях РНК к расщеплению 27
1.6.1. Зависимость стабильности РНК от геометрических параметров межнулеотидной связи 27
1.6.2. Расщепление РНК в боковых петлях 30
1.6.2.1. Расщепление боковых петель РНК ионами металлов 30
1.6.2.2. Расщепление искусственных боковых петель РНК конъюгатами олигонуклеотидое и комплексов металлов 34
Заключение 39
Глава 2. Экспериментальная часть 41
2.1. Материалы 41
2.1.1. Реактивы и препараты 41
2.1.2. Плазмиды 42
2.1.3. Олигорибонуклеотиды и РНК 42
2.1.4. Олигодезоксирибонуклеотиды 42
2.1.5. Буферные растворы, использованные в работе 43
2.2. Методы 45
2.2.1. Гель-электофореэ 45
2.2.1.1. Электрофорез в ПААГ в денатурирующих условиях 45
2.2.1.2. Электрофорез в агарозном геле 45
2.2.2. Приготовление компетентных клеток 46
2.2.3. Трансформация компетентных клеток плазмидной ДНК pSVK3M2 46
2.2.4. Выделение плазмидной ДНК (аналитический вариант) 46
2.2.5. Выделение плазмидной ДНК (препаративный вариант) 47
2.2.6. Получение РНК с помощью реакции транскрипции in vitro 48
2.2.6.1. Получение линейной формы плазмиды 48
2.2.6.2. Амплификация фрагмента М2 РНК вируса гриппа 49
2.2.6.3. Очистка ПЦР-продукта 49
2.2.6.4. Транскрипция in vitro 49
2.2.6.5. Очистка РНК-транскриптов 50
2.2.7. Получение радиоактивно меченых препаратов РНК и олигонуклеотвдов 50
2.2.7.1. Введение [33Р]-метки по З'-ОН группе TPHKptie 50
2.2.7.2. Введение [згР]-метки по 5'-концу РНК 50
2.2.8. Пробинг вторичной структуры РНК в растворе 50
2.2.8.1. Пробинг вторичной структуры фрагмента М2 РНК вируса гриппа 51
2.2.8.2. Частичный гидролиз РНК в денатурирующих условиях 51
2.2.8.3. Пробинг вторичной структуры мини-тРНК и комплексов М2-96 РНК: олигонуклеотид в имидазольном и метилимидазольном буферах 52
2.2.9. Пробинг дуплексов РНК:олигонуклеотид РНКазой Н 52
2.2.10. Пробинг дуплексов РНК:олигонуклеотид РНКазой А 52
2.2.11. Компьютерное моделирование вторичной структуры М2-96 РНК 53
2.2.12. Исследование гибридизации олигонуклеотидов с М2-96 РНК методом задержки в геле 53
2.2.13. Расщепление РНК искусственными рибонуклеазами 53
2.2.14. Расщепление М2-96 РНК в комплексе с олигодезоксирибонуклеотидами с помощью химических рибонуклеаз 54
Глава 3. Расщепление различных структурных элементов РНК под действием химических рибонуклеаз (Результаты и обсуждение) 55
3.1. Рибонуклеазная активность коротких синтетических пептидов, состоящих из остатков лизина и гистамина 55
3.1.1. Дизайн химических рибонуклеаз серии nLm 55
3.1.2. РНК-мишени 58
3.1.3. Зависимость эффективности расщепления РНК под действием соединенийп[ т от длины и вторичной структуры субстрата 61
3.1.4. Специфичность расщепления РНК соединениями nLm 64
3.1.5. Влияние концентрации соединений nLm на их рибонуклеазную активность 68
3.1.6. Влияние природы буфера на расщепление РНК соединениями nLm 70
3.1.7. Механизм расщепления РНК соединениями nLm 72
3.1.8. Сравнение рибонуклеазной активности соединений nLm и ABLkCm 72
3.2. Рибонуклеазная активность трипептидов, состоящих из аминокислот, входящих в состав активных центров природных рибонуклеаз А и Т1 75
3.2.1. Дизайн трипептидов 75
3.2.2. РНК-мишени 75
3.2.3. Изучение РНК-расщелляющей активности трипептидов 77
3.2.4. Специфичность расщепления РНК трипептидами 79
3.2.5. Влияние концентрации трипептидов на их рибонуклеазную активность 80
3.3. Рибонуклеазные свойства соединений на основе соединенных жестким линкером двух остатков 1,4-диазабицикло[2.2.2]сктана, несущих липофильные фрагменты на четвертизованных атомах азота 82
3.3.1. Дизайн соединений Dxn 82
3.3.2. РНК-мишени 82
3.3.3. Расщепление ON21 соединениями серии Dxn 83
3.3.4. Концентрационные зависимости расщепления РНК соединениями Dxn 86
3.3.5. Кинетика расщепления РНК под действием соединений Dxn 90
3.3.6. Специфичность расщепления РНК под действием соединений Dxn 94
3.3.7. Влияние имидазола на РНК-расщепляющую активность соединения Dpi 2 96
3.3.8. Сравнение PHK-расщєпляющей активности соединений серии Dxn с соединением ABL4C3 97
3.4. Направленное расщеппение РНК химическими рибонуклеазами по фосфодиэфирным связям в боковых петлях 99
3.4.1. РНК-мишень 99
3.4.1.1. Изучение вторичной структуры М2-96 РНК 99
3.4.2. Олигонукпеотиды и РНК-расщепляющие конструкции 103
3.4.3. Образование искусственных петель 106
3.4.3.1. Закономерности образования комплексов М2-96 РНКюлигонуклеотид 106
3.4.3.2. Пробинг комплексов М2-96 РНК;олигонуклеотид с помощью РНКазы Н 108
3.4.3.3. Пробинг комплексов М2-96 РНКюлигонуклеотид РНКазой А 109
3.4.3.4. Расщепление комплексов М2-96 РНК:олигонуклеотид в 2 М имидазольном буфере 111
3.4.4. Расщепление фосфодиэфирных связей в искусственных петлях соединениями KHR, 2L2, Dpi 2 и ABL4C3 112
3.4.5. Эффективность и селективность расщепления комплексов М2-96 РНК:олигонуклеотид соединением KHR 115
3.4.6. Эффективность и селективность расщепления комплексов М2-96 РНК:олигонуклеотид соединением Dp 12 118
3.4.7. Эффективность и селективность расщепления комплексов М2-96 РНКюлигонукпеотид соединением ABL4C3 119
3.4.8. Расщепление комплексов М2-96 РНКюлигонукпеотид соединениями ABL4C3, Dp12 и KHR в присутствии 10 мМ MgCI2 120
Выводы 128
Список литературы 130
- Однозвенные U-содержащие петли
- Расщепление боковых петель РНК ионами металлов
- Зависимость эффективности расщепления РНК под действием соединенийп[ т от длины и вторичной структуры субстрата
- Расщепление фосфодиэфирных связей в искусственных петлях соединениями KHR, 2L2, Dpi 2 и ABL4C3
Введение к работе
Молекулы РНК выполняют в организме множество разноплановых функций от переноса генетической информации до катализа биохимических реакций [1-4]. Геномы вироидов и многих вирусов представляют собой молекулы РНК [5,6]. В связи с важной биологической ролью РНК, крайне актуальной является задача разработки методов направленного воздействия на РНК с целью регуляции биологических процессов в клетке в терапевтических целях и с целью инактивации геномов вирусов. Интерес также представляет создание низкомолекулярных химических соединений, способных расщеплять РНК по определенным нуклеотидным последовательностям или в пределах определенных элементов чувствительных структур РНК. Изучение свойств таких соединений, получивших название искусственных или химических рибонуклеаз, может помочь выявить роль факторов, обеспечивающих высокую эффективность катализа, осуществляемого природными ферментами. Соединения, способные расщеплять РНК, представляют интерес в качестве реагентов для исследования структуры РНК, для целей биотехнологии.
Химические рибонуклеазы могут быть использованы в качестве каталитических доменов в конъюгатах олигонуклеотидов для сайт-направленного расщепления РНК. Химические соединения, катализирующие расщепление определенных РНК и способные проникать в клетки, служить в качестве регуляторов экспрессии генов, а также противовирусными агентами, инактивирующими РНК-содержаще вирусы (вирус HIV 1, вирус клещевого энцефалита, вирус гриппа и т. д.).
В последние годы было создано большое число низкомолекулярных соединений, способных расщеплять РНК в физиологических условиях [7]. В их число входят комплексы некоторых металлов [8,9], органические соединения, содержащие низкоосновные аминосоединения [10,11] и остатки имидазола [12,13], а также конструкции на основе олиго- и полипептидов [14-16]. Несмотря на интенсивные исследования, ведущиеся с целью создания химических рибонуклеаз, до настоящего времени не удалось получить эффективных конструкций для расщепления РНК, обладающих активностью, близкой к активности природных катализаторов. Сегодня еще не установлены механизмы, обуславливающие различия в реакционной способности фосфодиэфирных связей в различных нуклеотидных последовательностях: по невыясненным причинам различные катализаторы преимущественно расщепляют РНК по фосфодиэфирным связям, находящимся в Pyr-А последовательностях [17,18]. Исследование факторов, определяющих специфичность и эффективность расщепления РНК химическими рибонуклеазами, является актуальным для создания высокоэффективных искусственных рибонуклеаз, способных расщеплять молекулы РНК со скоростью, близкой к расщеплению природными ферментами.
Целью настоящей работы являлось изучение расщепления структурных элементов РНК искусственными рибонуклеазами различной природы. В ходе исследования решались следующие задачи: определение рибонуклеазной активности химических рибонуклеаз, представляющих собой короткие катионные пептиды и соединения на основе 1,4-диаз аби цикло[2.2.2] октана; изучение влияния последовательности и пространственной структуры РНК на эффективность реакции трансэтерификации под действием этих химических рибонуклеаз; изучение расщепления фосфодиэфирных связей в боковых петлях РНК под действием химических рибонуклеаз.
Однозвенные U-содержащие петли
Известно, что ионы Мд2+ стабилизируют структуру РНК, делая ее менее подвижной [65]. В частности, ионы Мд2+ ограничивают подвижность боковых петель РНК. Боковая петля вносит изгиб между двумя ограничивающими ее стыкующимися двуцепочечными спиралями и, таким образом, придает большую подвижность молекуле РНК. Степень подвижности также зависит от присутствия ионов магния. Например, для боковой петли в составе HIV-1 TAR РНК, состоящей из трех нуклеотидов, с помощью метода ЯМР было показано, что в отсутствие ионов Мд2+, оси прилегающих к ней двуцепочечных спиралей очень подвижны относительно друг друга и угол между ними может составлять до 47 (Рис. 11 А) [97]. В присутствии ионов Мд2+ подвижность боковой петли резко падает: добавление 3 мМ Мд2+ и в присутствии (Б) ионов Мд2+ [97]. уменьшает угол между осями спиралей, прилегающими к боковой петле, до 12, а в присутствии 4.5 мМ Мд3" этот угол составляет не более 5 (Рис. 11 Б). Различия в структуре боковой петли а присутствии и в отсутствие ионов Мдг+ была также подтверждена и с помощью РСА на примере дуплекса, содержащего однонуклеотидную боковую петлю (bulge А) [77],
Таким образом, анализируя накопленные данные, полученные с помощью рентгеноструктурного и ЯМР анализа, можно сказать, что для однозвенных U, G и С боковых петель более характерна вывернутая наружу конформация, чем встраивание (стэкинг) внутрь спирали. Боковые однонуклеотидные А-петли обладают большой подвижностью и могут находиться в разных конформациях. Двуцепочечные участки РНК, содержащие боковые петли, имеют высокую подвижность, большая бороздка А-спирали в области петли расширена, преимущественно с 5 стороны от петли, что делает ее доступной для взаимодействия с другими молекулами; кроме того, наблюдается изгиб оси спирали в области петли. Известна большое количество всевозможных боковых петель, содержащих несколько нуклеотидных остатков, однако, за исключением Kurn мотива, не найдено четких закономерностей, позволяющих предсказать пространственную структуру петли произвольной последовательности. 1.4. Изучение структуры РНК, содержащих петли, с помощью электрофореза в нашивных условиях и метода индуцированного электрическим полем временного двулучепреломления (transient electric birefringence)
Одной из природных функций петель является организация третичной структуры РНК, а именно ориентация двух прилегающих двуцепочечных участков РНК относительно друг друга. В 1989 году было показано, что скорость движения двуцепочечной РНК, содержащей петлю, зависит от угла излома оси спирали РНК, который вносит боковая петля [98]. До этого момента такие исследования проводились только с ДНК [99,100]. Было показано, что электрофоретическая подвижность РНК:РНК и РНК:ДНК дуплексов, содержащих 5-звенную боковую петлю As, меняется меньше относительно соответствующих контролей, чем в случае ДНК:ДНК дуплекса. Электрофоретическая подвижность РНК:РНК дуплексов, содержащих боковую петлю и, соответственно, угол излома оси спирали зависят как от длины петли, так и от ее последовательности. Анализ Ап и Un петель (n = 1, 3, 5 и 7 нуклеотидов) показал, что при увеличении длины петли электрофоретическая подвижность дуплексов уменьшается, а дуплексы с Un петлями всегда обладали большей электрофоретической подвижностью по сравнению с дуплексами с А„ петлями. Эти данные по изменению угла излома оси спирали были подтверждены в экспериментах, основанных на разгорании флюоресценции FRET [101].
Для количественного измерения угла излома спирали дуплекса был использован метод индуцированного электрическим полем временного двулучепреломления transient electric birefringence (ТЕВ) [102]. В методе ТЕВ молекулы ДНК или РНК частично (и кратковременно) ориентируются под влиянием импульса электрического поля. В результате ориентация исследуемых молекул нуклеиновых кислот друг относительно друга изменяется, и раствор становится оптически анизотропным, что выражается в повышении лоляризационно-зависимого индекса рефракции. После снятия электрического поля происходит рандомизация ориентации молекул из-за диффузии, что приводит к уменьшению поляризационно зависимого индекса рефракции. Регистрация времени спада двойной поляризации позволяет получить количественные данные о конформации нуклеиновых кислот. С помощью метода ТЕВ в группе Хагермана [102] было проведено сопоставление скорости движения дуплексов в геле со значениями угла излома оси спирали дуплексов, содержащих боковые петли состава А и U„, где 0 п 6. Результаты анализа показали прямую корреляцию данных, полученных с помощью метода задержки в геле и с помощью ТЕВ. Излом оси дуплексов, содержащих петли А„, всегда был больше, чем у дуплексов с петлями Un. Угол изгиба оси постепенно возрастал от 15 и 10 (для петель At и Ui, соответственно) до 93 и 81 (для As и U6l соответственно). Наибольшая разница в угле изгиба при увеличении длины петли наблюдалась при переходе от петли А, кАг: (т - 27 и т = 30, соответственно). Авторы предполагают, в случае А,-петли нукпеотид может находиться как в стэкинге, так и в вывернутом наружу состоянии, что определяет в среднем малый угол излома {х = 15 ± 5). В случае Ut наблюдается угол 10 ± 5, который возможен только в случае вывернутого наружу основания, поскольку из теоретических расчетов угол излома оси в случае стэкинга bulge U внутрь спирали должен составлять не менее 16.
В работе [71] было проведено систематическое исследование влияния нукпеотид ной последовательности петли на угол излома оси спирали. В качестве объекта была выбрана петля І интрона рибозимa Tetrahymena thermophila, которая расположена через 23 нуклеотида от каталитического кора. Высокая консервативность последовательности и положения этой боковой петли натолкнула авторов на мысль, что эта боковая петля определяет угол между прилегающими стеблями и играет важную роль в катализе. Для того, чтобы выяснить, насколько важна последовательность петли для достижения определенного излома спирали, авторы проанализировали все возможные комбинации нуклеотидов 5 звенной петли, сравнивая их с электрофоретической подвижностью фрагмента с природной последовательностью, а также фрагментов, несущих петли As и U5. Оказалось, что самой высокой электрофоретической подвижностью обладал РНК дуплекс, содержащий боковую петлю U5l что соответствует самому малому углу излома спирали (т = 43 ± 5). Большинство 5 звенных петель (85%) изгибали ось спирали на угол от 60% до 80%. Все петли, изгибающие ось спирали на малый угол (т 60), относились к пиримидин-богатым. Угол излома в природной РНК Tetrahymena thermophila, создаваемый петлей AUAAG, составляет 69 + 5, что совпадает с углом излома, создаваемым петлей А5.
Таким образом, оказалось, что угол излома оси спирали, содержащей боковую петлю, зависит от двух параметров - длины петли {при увеличении количества нуклеотидов в петле угол излома увеличивается) и ее нуклеотидного состава (Ри-богатые петли изгибают ось спирали меньше, чем Ру-богатые).
Расщепление боковых петель РНК ионами металлов
Однозвенные А-петли (bulge А), фланкированные G:C парами с обеих сторон, не расщеплялись ионами РЬ2+. Замена фланкирующих пар показала, что эффективность расщепления в петле зависит от последовательности петли и прилегающих к ней оснований: если с б -стороны от петли находится уридин (U:A или U:G пары), то расщепление в петле проходит более эффективно, по сравнению с петлей, фланкированной с 5 стороны цитидином или гуанозином (G:C или C;G парами). Этот факт авторы объясняют различиями в стэкинг-взаимодействии выпетленного основания с фланкирующими его основаниями. Известно, что сила стэкинг-взаимодействии падает в ряду Pu-Pu Py-Pu Ру-Ру, причем основание с б -стороны вносит наибольший вклад в стэкинг-взаимодействия [52]. В случае, если основание в петле находится в стзкинге с соседними основаниями, фосфодиэфирные связи нуклеотида в петле принимают конформацию, подобную конформации в двуцепочечной РНК, и становятся малочувствительными к расщеплению. Двухзвенные боковые петли (UU, СС, АА и СА), расположенные между двумя G:C парами оснований, подвергались расщеплению ионами РЬ2 одинаково: расщеплению подвергались все три фосфодиэфирные связи расположенные в петле, причем наиболее эффективно расщеплялась связь в середине петли. Такая же закономерность наблюдалась и для трехзвенных боковых петель. Сравнение расщепления РНК в боковых петлях и петлях шпилек, содержащих одинаковые последовательности, показало, что чувствительность к расщеплению этих структурных элементов сильно отличается. Так, последовательность UUCG стабильна и не подвергается расщеплению в составе апикальной петли шпильки, но становится очень чувствительна к расщеплению ионами РЬ2 в составе боковой петли.
В работе [119] была изучена чувствительность связей в боковых петлях РНК к расщеплению ионами магния. Образование боковых петель длиной 1-4 нуклеотида в 5 -концевой области 132-звенной РНК индуцировали гибридизацией с олигодезоксирибонуклеотидами. Известно, что ионы магния в концентрации 2.5 мМ в слабощелочных условиях (рН 8,0) при температуре 60С способны эффективно расщеплять РНК по одноцепочечным участкам. Все боковые петли в составе комплексов РНК:олигонукпеотид расщеплялись ионами Мдг+ (Рис. 15Б). В однонуклеотидных боковых петлях расщепление проходило преимущественно по фосфодиэфирным связям с З -стороны от выпетленных нуклеозидов. С 5 -стороны от выпетленных нуклеотидов наблюдалось менее интенсивное расщепление. Появление вторичных расщеплений с 5 -стороны боковой петли авторы объяснили повышением подвижности петлевого нуклеотида после первичного расщепления. В случаях, когда с З -стороны боковую петлю фланкировали A:U(T) пары, вторичные сайты расщепления наблюдались и в участках, участвующих в комплексообраэовании с олигонуклеотидом, что объясняется недостаточной стабильностью гетеродуплекса с точечным разрывом. Однако, в отличие от расщепления боковых петель ионами РЬ2 , все однозвенные петли расщеплялись ионами магния с одинаковой интенсивностью вне зависимости от типа основания в петле и фланкирующих его пар оснований. При увеличении длины искусственной петли до 2 - 4 нуклеотидов, наряду с первичным расщеплением по фосфодиэфирной связи с З -стороны петли, интенсивное расщепление происходило и с 5 -стороны петли, и в двуцепочечном участке, прилегающем к петле. Следует отметить, что, наряду с расщеплением в искусственных боковых петлях, расщепление проходило и по всем остальным одноцепочечным участкам в составе 132-звенной РНК. Сравнение расщепления РНК в боковых петлях с расщеплением в искусственных мисматчах показало, что в отличие от боковых петель, в случае мисматчей происходит индукция расщепления последовательностей, фланкирующих мисматч [119].
РСА однозвенной А-петли в составе дуплекса (d(GCG)r(A)d(TATACGC))2 показал [77], что в присутствии ионов Мд2+ фосфодиэфирная связь петлевого аденозина принимает конформацию, близкую к линейной, в отличие от конформации, наблюдаемой в кристалле, полученном в присутствии спермидина. По-видимому, ионы Мд2+ способны стабилизировать структуру боковой петли, облегчающую протекание реакции трансэтерификации.
Расщепление боковых петель ионами Zn2+ исследовали, используя в качестве субстрата 2 -0-метильные олигорибонуклеотиды, содержащие боковые петли длиной 1-5 нуклеотидов, в которых одно из звеньев в петле не содержало 2 -0-модификацию [120]. Поскольку 2 -0-метильные олигорибонуклеотиды не расщепляются РН«-расщепляющими агентами, такие модельные РНК позволили авторам проанализировать чувствительность фосфодиэфирных связей в боковых петлях по отдельности. Наиболее эффективное расщепление наблюдалось в случае пятизвенной боковой петли, содержащей немодифицированный уридин (rU) в центре. Связь, образованная этим уридином, расщеплялась в два раза быстрее, чем аналогичная связь а составе полностью одноцепочечного олигорибонуклеотида. 4 и 3 Звенные петли, содержащие рибоаденозин, либо рибоуридин в апикальной позиции, расщеплялись ионами Zn2 примерно с такой же скоростью. В случае 1 и 2 звенных боковых петель наблюдалось резкое падение скорости расщепления. Компьютерный анализ структуры олигорибонуклеотидов, содержащих боковые петли, показал, что 5 заенные петли, с рибонуклеотидом в апикальной позиции или ближе к 5 -концу петли, имеют одинаковую конформацию, в которой все нуклеотиды находятся внутри спирали. Такая же структура была получена и для 2-х звенной петли, однако скорости расщепления для 5 звенной петли с рибонуклеотидом ближе к 5 концу петли и 2 звенной петли были ниже по сравнению с 5 звенной петлей с апикальным рибонуклеотидом, в 3 и 6 раз, соответственно. Значения параметров фосфодиэфирных связей, полученных из экспериментов по моделированию, для всех типов петель сильно отличались от значений, характерных для линейной конформации. Авторы заключили, что наиболее важным аспектом, определяющим чувствительность фосфодиэфирных связей к расщеплению, является их подвижность.
Таким образом, можно сделать вывод, что большинство боковых петель в РНК или в РНК:ДНК комплексах способны расщепляться ионами двухвалентных металлов, причем направленность расщепления отличается от расщепления мисматчей и апикальных петель шпилек. Расщепление носит статистический характер: расщепляются связи, расположенные с 3 - (и в некоторых случаях с 5 -) стороны от всех нуклеотидов в петлях, кроме того, могут подвергаться расщеплению связи вблизи боковой петли, но входящие в состав РНК:ДНК дуплекса. Расщепление РНК в боковых петлях чаще всего не влияет на характер (интенсивность) расщепления по другим одноцепочечным участкам в составе РНК [119].
Зависимость эффективности расщепления РНК под действием соединенийп[ т от длины и вторичной структуры субстрата
Для получения статистически достоверных данных о специфичности действия соединений nLrn на РНК были проведены эксперименты с тРНКр,1е из дрожжей. На рис. 21 в качестве примера показано типичное разделение продуктов расщепления 3 -[32Р]-тРНКР(1е химическими нуклеазами 2L2 и 2L4 в стандартных условиях. В этой РНК фосфодиэфирные связи С63-А64 и С75-А76 проявляли наибольшую чувствительность к расщеплению, с меньшей скоростью расщепление проходило по связям U8-A9, С13-А14, Y37-A38, С61-А62, С72-А73. Все перечисленные фосфодиэфирные связи находятся в одноцепочечных участках, за исключением связей С61-А62 и С63-А64, расположенных в ТТС-стебле. Однако, согласно литературным данным [13,148], в отсутствие ионов Мд2+ этот участок "PFC стебля проявляет повышенную чувствительность к большому спектру природных и химических расщепляющих агентов. Аналогичная специфичность расщепления РНК наблюдалась для всех соединений серии nLm преимущественно по одноцепочечным участкам.
Различия в эффективности расщепления между фосфодиэфирными связями в одинаковых мотивах могут быть связаны с влиянием ряда факторов: различной эффективностью взаимодействия искусственных РНКаз с различными участками РНК, влиянием «ближайших соседей» (контекста) на скорость расщепления фосфодиэфирных связей или влияния пространственной структуры РНК. Расположение связей, расщепляемых исследованными соединениями, свидетельствует об их чувствительности к пространственной струїсгуре РНК. Все соединения nLm, хотя и с разной скоростью, расщепляют фосфодиэфирные связи в СА и UA последовательностях, находящихся в одноцепочечных участках РНК. Расщеплению подвергаются фосфодиэфирные связи, локализованные в областях резких изгибов РНК (переход стебель-петля) (U8-A9, С13-А14, Y37-A38 в случае тРНКРМе и C20-G21 в случае мини-тРНК). Следует отметить, что хотя соединения nLm обладают различными по структуре РНК-связывающими фрагментами, все эти соединения с максимальной эффективностью расщепляют связи в последовательностях UA, CA CG.
Для того чтобы выяснить, какая именно последовательность (СА, UG или UA) является более чувствительной к расщеплению химическими нуклеазами nLm, независимо от ее положения во вторичной структуре РНК (одноцепочечный, участок, петля шпильки, боковая петля или петля псевдоузла), в качестве субстрата был использован линейный 10-звенный олигорибонуклеотид [5"-32P]-UUCAUGUAAA. Как видно из рис. 22, соединения, проявляющие рибонуклеазную активность (1L0, 1L3, 1L4, 2L3 и 3L4) расщепляли ON10 по связям СЗ-А4 и U8-A9, тогда как расщепления связи U5-G6 не наблюдалось ни для одного из соединений. В таблице 6 представлены количественные данные по специфичности расщепления ON10 соединениями nLm. Во всех случаях фосфодиэфирная связь СЗ-А4 расщеплялась примерно в 1.5-2 раза быстрее, чем U8-A9. Соединения 1L4 и 1L3 проявляли наибольшую активность, а соединения 2L3, 1L0 и 3L4 были менее активны. Следует отметить, что в случае наиболее активных соединений 1L4 и 2L3 наблюдалось незначительное расщепление по связи U2-C3. Эти данные свидетельствуют о том, что в РНК, не обладающей определенной вторичной структурой, мотив СА является лучшим субстратом для соединений nl_m, чем UA или UG мотивы. Ранее такая же закономерность была показана для имидазол-содержащих конструкций серии ABLkCm [161 J. Надо отметить, что такое предпочтительное расщепление СА связей является одним из характерных свойств имидазол-содержащих соединений .от ионов металлов, для которых характерно преимущественное расщепление по UA мотивам [17]. Нет никаких оснований предполагать наличие предпочтительного связывания искусственных нуклеаз в первую очередь с фосфатами данных мотивов перед другими межнуклеотидными фосфатами. Повышенная чувствительность последовательности 5 -Ру-Ри-3 к гидролизу РНКазами хорошо известна [17]. Именно такие мотивы являются точками спонтанного гидролиза РНК. Природа повышенной чувствительности фосфодиэфирных связей в последовательностях СА и UA к гидролизу до сих пор не вполне понятна. При изучении спонтанного гидролиза РНК на модельных соединениях было показано, что скорость расщепления фосфодиэфирных связей в UA мотиве в 1.5 - 2 раза выше, чем в СА, и сильно зависит как от пространственной структуры РНК, так и от прилегающих к ней нуклеотидов [17].
Зависимость эффективности расщепления РНК от концентрации соединений nLm анализировали на мини-тРНК и тРНКРґ1е. В качестве примера представлены первичные данные для соединений 2L2 и 2L4 с использованием тРНКРЬе в качестве субстрата (Рис. 21) и соединений 1L2 и 1L3 с использованием мини-тРНК (Рис. 24). Количественные данные для всех соединений nLm представлены на рис. 25. Зависимость эффективности расщепления РНК от концентрации соединений nLm имеет сложный характер. Для соединений 1L0r 2L2, 1L4 и 3L4 наблюдается S-образная зависимость степени расщепления от концентрации соединения, однако характер этой зависимости для мини-тРНК и тРНК 6 несколько различается (Рис. 25А, Г)- В случае мини-тРНК для всех перечисленных соединений происходит резкое увеличение степени расщепления при увеличении концентрации соединения от 0.5 мМ до 1 мМ, а при более высокой концентрации степень расщепления почти не меняется (Рис. 25А). В случае тРНК такой характер кривой наблюдается только для соединения 2L2, а для соединений 1L0, 1L4 и 3L4 происходит плавное нарастание степени расщепления РНК с увеличением концентрации соединений (Рис. 25Г)- Для соединений 1L3 и 2L3 наблюдается линейная зависимость степени расщепления РНК от их концентрации (Рис. 25Б, Д). Для соединения 1L2 в случае мини-тРНК наблюдается кол околообразная зависимость эффективности расщепления от концентрации соединения с максимумом при концентрации 5x10-4 М (Рис, 25В), а
в случае тРНК расщепление наблюдается только при максимальной использованной концентрации 5 мМ (Рис. 25Д). Колоколообразная зависимость была показана для ранее изученных соединений серии ABLkCm (Таб. 3), однако, в случае этих соединений характер концентрационной кривой не менялся в зависимости от РНК-субстрата. Различия во влиянии концентрации соединения на эффективность расщепления РНК объясняются, по-видимому, совокупным действием различных факторов: пространственной структурой РНК-субстрата, эффективностью связывания искусственных нуклеаз с РНК и взаимодействием реакционноспособных групп (имидазол синтетической конструкции и имидазол буфера) с межнуклеотидным фосфатом. Представленные данные свидетельствуют о том, что все синтезированные молекулы способны эффективно расщеплять РНК-субстрат. В оптимальных условиях РНК деполимеризуется под действием этих соединений количественно.
Расщепление фосфодиэфирных связей в искусственных петлях соединениями KHR, 2L2, Dpi 2 и ABL4C3
Для изучения чувствительности боковых петель к расщеплению были использованы наиболее активные соединения из серий искусственных рибонуклеаз Dxn, ABLkCm и коротких катионных пептидов: Dpi2, ABL4C3, 2L2 и KHR. Анализ чувствительности фосфодиэфирных связей в искусственных петлях к РНК-расщепляющим соединениям проводили по общей схеме: 10"7 М (5 -32Р]-М2-96 РНК инкубировали с соответствующим олигонуклеотидом (1СГ6 М) в 50 мМ Трис-НСІ буфере, рН 7.0, содержащем 0.2 М KCI, 0.5 мМ EDTA (буфер Т) и 0.1 мкг/мкл РНК-носителя. Через 1 час к реакционной смеси добавляли соединение до конечной оптимальной концентрации (10 5 М Dpi 2, 5x10"4 М ABL4C3, 10"3 М 2L2 и Ю-3 М KHR) и инкубировали комплекс в присутствии соединения в течение 8 - 24 ч при 37С. Реакцию останавливали осаждением РНК 2%-ным LiCIO в ацетоне, продукты реакции анализировали с помощью электрофореза в 18% ПААҐ в денатурирующих условиях.
На рис. 47, 48 и 49 представлены радиоавтографы гелей после разделения продуктов расщепления комплексов М2-96 PHK:ON соединениями KHR, Dpi2 и ABL4C3, соответственно. Как видно из рисунков, во всех случаях в отсутствие олигонуклеотидов М2-96 РНК расщепляется по трем основным сайтам: U20-A21, U30-A31 и U43-A44 (дорожка К1 на рис. 47 - 49). Менее интенсивное расщепление проходит по фосфодиэфирным связям после А21, С22, U24, U28, С29, U32, G33 и С46. Чувствительность к расщеплению связей С55-А56 и С58-А59, расположенных в нативной М2-96 РНК в стебле шпильки, зависит от типа РНК-pa оцепляющего агента; в случае соединений ABL4C3 и KHR степень расщепления РНК по этим связям в 2 -5 раз меньше, чем в среднем по основным сайтам, а в случае соединения Dp12 степень расщепления по этим связям была примерно равной расщеплению по связям U20-A21 и U30-A31. Очевидно, это объясняется повышенной способностью соединения Dpi2 расщеплять РНК по связям в двуцепочечных участках (см. раздел 3.3.8). В присутствии контрольного олигонуклеотида ON1(0), полностью комплементарного последовательности 50-65 М2-96 РНК, происходит полное ингибирование расщепления по связям С55-А56 и С58-А59 и появляется новый сайт расщепления U78-G79. Это свидетельствует о том, что олигонуклеотид образует с РНК прочный комплекс, полностью защищающий связи С55-А56 и С58-А59 от расщепления, и в то же время разворачивает шпильку A54-G68, делая связь U78-G79 доступной для расщепления. Соединения Dpi2, ABL4C3 и KHR, как и РНКаза А, не расщепляют связи в однозвенных боковых петлях (комплексы М2-96 РНК с олигонуклеотидами ON2(1/-), ON3(1/+) и ON4(1/-)), за исключением следовых количеств продуктов расщепления связи С58-А59 в комплексе М2-96 PHK:ON4(1/-) под действием соединений ABL4C3 и Dp12. Боковые петли, образованные в присутствии всех остальных олигонуклеотидов, расщепляются всеми соединениями (Dpi2, и KHR и ABL4C3). Расщепление РНК происходит строго по связям С55-А56 и/или С58-А59 в петле (Рис. 47 - 49). В отличие от расщепления 2 М имидазольным буфером (см. раздел 3.4.4) и ионами двухвалентных металлов [119], расщепление по другим связям в петле или вблизи петли не наблюдается.
К удивлению, соединение 2L2 не проявляет активности по отношению к фосфодиэфирным связям в петлях в комплексах М2-96 РНК с олигонуклеотидами. Степень расщепления по связям С55-А56 и С58-А59 во всех комплексах РНК:олигонуклеотид была одинаковая и не отличалась от контроля (М2-96 РНК в свободном состоянии). инкубация М2-96 РНК в отсутствие соединения KHR. Дорожки L и Т1 - имидазольный лэддер и расщепление РНК под действием РНКазы Т1 в денатурирующих условиях, соответственно. Номера олигонуклеотидов обозначены сверху над дорожками. Связи, расщепляемые РНКазой Т1 и KHR обозначены слева и справа, соответственно. (Б) и (В). Количественный анализ данных, представленных в (А). Темно-серая часть столбцов соответствует степени расщепления в искусственной петле. Селективность расщепления (В) определяли как отношение степени расщепления в искусственной боковой петле к суммарной степени расщепления М2-96 РНК.
3.4.5. Эффективность и селективность расщепления комплексов М2-96 РНК:олигонукпеотид соединением KHR
Количественный анализ данных по расщеплению комплексов М2-96 PHK:ON соединением KHR приведен на рис. 47Б. Суммарная степень расщепления комплексов, содержащих петлю длиной до трех нуклеотидов, примерно равна степени расщепления нативной М2-96 РНК (20%). Степень расщепления РНК по связям в 2- и 3-звенных боковых петлях составила 0.5 - 1.5%. При увеличении длины боковой петли наблюдалось увеличение как эффективности расщепления связей в петле, так и увеличение общей эффективности расщепления М2-96 РНК. Согласно расчетам, связывание олигонуклеотидов в области 45-69 не . должно менять вторичную структуру РНК в остальной молекуле, например, в области U20-A21 и U30-А31, однако, в случае комплексов РНК с ON 11 (4/-), ON14(4/-), ON20(6/-), ON23(7/-) и ON24(7/-) наблюдается 2-4 кратное увеличение эффективности расщепления по этим связям по сравнению с контролем (РНК в отсутствие олигонуклеотидов) (К1). Для того, чтобы оценить, насколько чувствительность фосфодиэфирных связей в искусственных боковых петлях отличается от остальных расщепляемых связей в М2-96 РНК, мы ввели понятие «селективность» - отношение степени расщепления РНК по связям в искусственной петле к суммарной степени расщепления РНК в данном комплексе. Значения селективности расщепления РНК соединением KHR для всех исследованных комплексов представлены на рис. 47В. Как видно из гистограммы, чувствительность связей к расщеплению увеличивается с увеличением длины петли.
В комплексах, где олигонуклеотид содержит некомплементарный аденозин напротив петли (ONm(n/+)), селективность расщепления всегда выше, чем в комплексах ONn(m/-). Надо отметить, что связывание олигонуклеотидов, содержащих дополнительный аденозин, не отличается от связывания олигонуклеотид а без некомплементарного аденозина (Рис. 44 Ґ, 45). Следовательно, разница в селективности расщепления в петле может быть обусловлена более гибкой структурой петли, образующейся напротив дополнительного аденина, которая является более предпочтительной для реакции трансэтерификации.
Петли длиной до 3 нуклеотидов содержали только один С-А мотив, часть 4- и 5-звенных петель также содержала одну С-А связь (ON11(4/-), ON12(4/+) и ON17(5/-)), а остальные 4- и 5-ззенные петли - обе С-А связи (ON13(4/-), ON14(4/-), ON15(5/-) и ON16(5/+)), причем одно из оснований последовательности CAGCA (С или А) находилось в составе РНК:ДНК дуплекса. 6- и 7-звенные петли содержали обе С55-А56 и С58-А59 связи в петле. Максимальная селективность расщепления (0.15) одной СА связи наблюдалась в случае четырехзвенной петли, содержащей С55-А56 связь в апикальном положении (комплекс М2-96 PHK:ON12(4/+)). Присутствие в петле второго СА мотива увеличивает селективность расщепления в петле до 0.21 (комплекс РНК с ON19(6/+)). Сопоставление суммарной степени расщепления комплексов и селективности расщепления РНК по соответствующим петлям (Рис. 47 Б, В) показывает, что в комплексах, в которых наблюдается высокая суммарная степень расщепления (ON23(7/-) и ON24(7/-)), значения селективности низкие.
