Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 13
1.1. Метод SELEX 14
1.1.2. Укороченные аптамеры 21
1.1.3. Сравнение свойств антител с аптамерами
1.2. Аптамеры как инструменты в биохимических исследованиях 26
1.3. Аптамеры к антибиотикам
1.3.1. Аптамеры к тетрациклину 32
1.3.2. Аптамеры к стрептомицину 35
1.3.3. Аптамеры к хлорамфениколу 37
1.3.4 Аптамеры к аминогликозидам 39
1.4. Аптамеры как биосенсоры 39
1.5.Свойства аптамеров, ингибирующих биологическую активность белков 42
1.6. Аптамеры к белкам, не связывающим нуклеиновые кислоты 47
1.6.1. Аптамеры к тромбину 47
1.6.2. Аптамеры к фактору Vila 57
1.6.3. Аптамеры к фактору 1Ха 58
1.6.4. Аптамеры к протеиназе вируса гепатита С - NS3 (HSV-NS3) 61
1.6.5. Аптамеры к эластазе нейтрофилов человека 62
1.6.6. Аптамеры к VEGF 63
1.6.7. Аптамеры к основному ростовому фактору фибробластов 67
1.6.8. Аптамеры к ростовому фактору PDGF 68
1.6.9. Аптамеры к интерферону у человека
1.6.10. Аптамеры к ангиопоэтину-2 70
1.6.11. Аптамеры к белкам вируса гриппа 70
1.7. Аптамеры к белкам, связывающим нуклеиновые кислоты
1.7.1. Аптамеры к Tat-белку 72
1.7.2. Аптамеры к HIV-1 Rev (ревертаза) 74
1.7.3. Аптамеры к ШУ обратной транскриптазе 74
1.7.4. Транскрипционный фактор E2F 75
1.7.5 Аптамеры к фактору NF-kB 77
1.8. Аптамеры к антителам, к иммуноглобулинам 78
1.8.1. Аптамеры к антителу МА20 к инсулиновому рецептору 78
1.8.2. Аптамеры к моноклональному антителу (Mab) к ацетилхолиновому рецептору 79
1.8.3.Аптамеры к иммуноглобулину Е 80
1.8.4.Аптамеры к цитотоксичному антигену Т4 81
1.9.Аптамеры к адгезивным молекулам 81
1.9.1.Аптамеры к Р-Селектину 81
1.9.2.АптамерыкЬ-селектину 82
1.10.Аптамеры к антигену PSMA 83
1.11-Аптамеры к белкам комплемента С5 человека 83
1.12.Аптамеры к липопротеинам (не-панкреатическая секреторная фосфолипаза А2 человека 84
ЫЗ.Аптамеры к прионовым белкам -PrPsc 84
1.14.Аптамеры к патогенам (к трипанозоме) 85
2. Результаты и обсуждение 87
2.1. Компьютерная аннотация зоны контакта белка TthS7 с Tth 16S рРНК в составе Tth30S, компьютерное моделирование третичной структуры белка EcoS7 87
2.2. Изучения структуры и термодинамики природной системы, дифференциального узнавания различных РНК рибосомным белком S7 прокариот
2.2.2. Создание суперпродуцентов рибосомных белков S7 из различных организмов: Escherichia coli (EcoS7), Thermus thermophilus (TthS7).
Отработка методов сворачивания белковой молекулы 92
2.2.3. Изучение комплексообразование рибосомных белков S7 из Escherichia coli (EcoS7) и Thermus thermophilus (TthS7) с фрагментами 16S pPHK Е. coli и делеционными фрагментами strмРНК Е. coli 94
2.2.3.1. Взаимодействие фрагмента Ecol6S pPHK с белками EcoS7, TthS7 95
2.2.3.2. Изучение влияния белков EcoS7 и TthS7 на структуру фрагмента Ecol6SpPHK 98
2.2.3.3. Взаимодействие фрагмента EcoStr мРНК с белками EcoS7 и TthS7 99
2.2.3.4. Изучение влияния белков EcoS7 и TthS7 на структуру фрагмента
EcoStr мРНК 104
2.2.4. Делеционный анализ strMPHKii. Coli 106
2.2.5. Анализ связывания делеционных фрагментов межцистрона str мРНК Е. coli с белками EcoS7 и TthS7 108
2.2.6. Селекция аптамеров РНК на основе фрагмента EcoStr мРНК 109
2.2. Создание аптамерных ДНК к тромбину, обладающих стабильной пространственной структурой и способностью связывать тромбин с высокой эффективностью и специфичностью in vitro. Оценка эффективности ингибирующего действия аптамеров на активность тромбина в реакциях фибринолиза и агрегации тромбоцитов в условиях in vitro 114
2.2.1. Создание ДНК-аптамеров к тромбину 117
2.2.2. Компьютерное моделирование структур ДНК-аптамеров 118
2.2.3. Изучение ДНК-аптамеров методом кругового дихроизма 121
2.2.4. Комплексы ДНК-аптамеров с тромбином 129
2.2.5. Изучение взаимодействия аптамера RE31 с тромбином методом плазмонного резонанса (ППР) 134
2.2.6. Тромбин - ключевой белок свертывания крови 136
2.2.7. Ингибирование процессов свертывания крови ДНК-аптамерами 141
2.2.8. Влияние мутантного аптамера на процесс свертывания крови 144
2.2.9. Влияние аптамеров на агрегацию тромбоцитов 144
2.3.Создание модифицированных производных аптамеров. Оценка эффективности ингибирующего действия модифицированных аптамеров на активность тромбина и возможность подавления тромбообразования в модели in vivo 146
2.3.1. Свойства модифицированных аптамеров 147
2.3.2. Действие модифицированных аптамеров на тромбин индуцированную агрегацию тромбоцитов 149
2.3.3.Изучение влияния ДІЖ-аптамеров на коагуляционнуїо способность плазмы крови на животных моделях 150
2.3.4. Оценка ингибирующего действия модифицированных аптамеров на модели артериального тромбоза in vivo 152
2.4. Создание антидота к аптамерной ДНК. Изучение конкурентного взаимодействия аптамера к тромбину с антидотом в нуклеопротеидном комплексе аптамер-тромбин 153
2.4.1. Структура антидота 154
2.4.2. Изучение конкурентного взаимодействия аптамера к тромбину с антидотом в нуклеопротеидном комплексе аптамер-тромбин 155
3. Материалы и методы 157
3.1. Программы и схемы, использованные при компьютерном моделировании рибосомного белка EcoS7 158
3.2. Клонирование рибосомных белков
3.2.1. Клонирование TthS7 159
3.2.2. Клонирование EcoS7 159
3.3. Подготовка компетентных іслеток и трансформация рекомбинантными плазмидами 160
3.4. Определение наличия вставки в векторе 161
3.5. Выделение рибосомных белков EcoS7 TthS7 161
3.6. Синтез РНК in vitro с фрагментов ДНК, полученных ПЦР 164
3.7. Выделение фрагмента 16S рРНК и фрагментов EcoStr мРНК Е. coli 165
3.8. Работа с комбинаторной библиотекой РНК 166
3.9. Комплексообразование РНК с рибосомным белком
3.10. Определение нуклеотидной последовательности фрагментов РНК через секвенирование ДНК по Сэнгеру 167
3.11. Реакции радиоактивного мечения олигодезоксирибонуклеотидов 168
3.12. Химическая модификация РНК 168
3.13. Картирование модификаций и расщепления РНК, а также контрольное секвенирование 169
3.14. УФ - индуцируемое «сшивание» комплекса РНК с белком 170
3.15. Иммобилизация тромбина на CNBr-активированной сефарозе 170
3.16. Работа с комбинаторной библиотекой ДНК 171
3.17. Анализ фрагментов ДНК электрофорезом в агарозном геле 173
3.18. Разделение цепей ДНК с помощью стрептавидиновых частиц 173
3.19. Селектирование аптамеров к тромбину первым способом 174
3.20. Селекция аптамеров ктромбину вторым способом 174
3.21. Определение степени комплексообразования ДНК с тромбином 176
3.22. Рестрикция нуклеиновых кислот 176
3.23. Лигирование обогащенной фракции аптамеров с плазмидными ДНК 177
3.24. Секвенирование аптамеров в составе плазмид 177
3.25. Дизайн и структура базовых ДНК-аптамеров, взаимодействующих с тромбином 178
3.26. Аптамеры к тромбину 179
3.27. Исследования структур аптамеров с помощью метода кругового дихроизма 181
3.28. Работа с тромбином 182
3.29. Методика исследования связывания аптамеров с тромбином 184
3.30. Иммобилизация аптамера RE31 185
3.31 Модель артериального тромбоза у животных 186
Выводы 188
Список литературы 191
Приложение
- Аптамеры как инструменты в биохимических исследованиях
- Аптамеры к моноклональному антителу (Mab) к ацетилхолиновому рецептору
- Анализ связывания делеционных фрагментов межцистрона str мРНК Е. coli с белками EcoS7 и TthS7
- Определение нуклеотидной последовательности фрагментов РНК через секвенирование ДНК по Сэнгеру
Введение к работе
Актуальность проблемы. Прошедшее десятилетие ознаменовалось существенным прорывом в использовании фундаментальных знаний о ДНК/РНК в прикладных работах. Бурный прогресс был связан с тем, что эти молекулы участвуют в хранении и передаче наследственной информации последующим поколениям. До недавнего времени нуклеиновые кислоты (НК) рассматривали как ленточные структуры, способные только к приему и передаче генетической информации. Открытие энзиматических функций, а теперь и регуляторных (ингибирующих), показало, что третичные структуры НК имеют сложную конфигурацию, что придает им новые свойства (функции) в комплексах с белками. В клетке ДНК/РНК-белковые взаимодействия служат основой её жизнедеятельности: экспрессия генома, синтез РНК в клетке, синтез белка, поэтому изучение структуры и функции нуклеопротеидных комплексов, с одной стороны, является актуальной фундаментальной задачей. С другой стороны, использование специфичности взаимодействия белков с нуклеиновыми кислотами в прикладных задачах стало приоритетным направлением в разработке различных тест-систем (биосенсоры), лекарственных препаратов.
В том, что две сложно организованные в пространстве макромолекулы (однотяжевая ДНК/РНК и белок) могут «узнавать» друг друга, нет ничего удивительного. Именно трехмерная структура биополимера определяет «узнавание» и является предметом исследования с помощью физических и физико-химических методов. Однако в ряде случаев различные по структуре природные РНК способны «узнавать» один и тот же белок, участвуя тем самым в регуляции ряда процессов.
Изучение комплексообразования и стабильности бинарных модельных комплексов позволяет упростить задачи в биофизических исследованиях нуклеиново-белкового узнавания в сложных клеточных органеллах и разработать системы прикладного характера, например, технологии микро-матриц, биосенсоров и т.д.
Способность НК образовывать разнообразные сложные третичные структуры с новыми функциями позволила разработать метод SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment). Метод позволяет создавать искусственные бинарные нуклеопротеидные комплексы, в которых целевые фрагменты нуклеиновых кислот (аптамеры) могут проявлять новые функции, например, играть роль ингибиторов ферментов, регулировать экспрессию ряда генов (Gold, 1990; Szostak 1990).
Аптамеры (от лат. Aptus – подходящий) представляют собой однотяжевые молекулы ДНК и РНК длиной 40-100 нуклеотидов с достаточно сложной трехмерной структурой. Именно она обеспечивает способность аптамеров специфически связывать различные молекулы, в том числе и белки. Специфичность данного комплексообразования сравнивают со сложнейшим процессом биосинтеза белковых "узнающих элементов" – антител, которые созданы природой в течение длительной эволюции.
В настоящее время в мировой практике комплекс антиген-антитело рассматривается как «золотой стандарт» специфического взаимодействия биомолекул. Это определило использование антител в медицинской диагностике и терапии. По способности образовывать специфический комплекс аптамеры, по сути, представляют собой функциональные аналоги антител, поэтому создание аптамеров, обладающих ингибирующим или активирующим воздействием на белки, совершенно актуально. Специфичность взаимодействия искусственного комплекса аптамер-белок, как правило, сравнивают с природным специфическим комплексом антиген-антитело. Константа диссоциации таких комплексов лежит в пределах 10-50 нМ.
В отличие от антител аптамеры мало иммуногенны, и их создание не требует использования живых систем.
Метод SELEX предоставляет принципиально иной путь биофизического поиска партнера c новой функцией. В настоящее время небольшие ДНК/РНК-аптамеры выделены для огромного числа белков. Поэтому генерация лекарственных форм на основе аптамеров представляется актуальнейшей проблемой. К достоинству аптамеров можно отнести и получение антидота к ним. Комплементарная последовательность к данному ДНК/РНК-аптамеру может служить антидотом, который будет приостанавливать действие аптамера в случае его передозировки.
Рассматривая аптамеры как перспективный класс новых медицинских препаратов, проводятся многочисленные биофизические, биохимические и медицинские исследования с целью дальнейшего их терапевтического применения. Аптамеры к VEGF (эндотелиальный фактор роста сосудов) уже используются при лечении ретинопатии глаз человека. Аптамеры к фактору Вилле-Бранда (участнику процесса свёртывания крови) проходят клинические испытания III фазы.
Цель и задачи исследования. Целью данной работы было cоздание ДНК/РНК аптамеров, изучение их структуры с помощью компьютерного моделирования, спектральных методов. Исследование процессов комплексообразования аптамеров с белками с использованием различных видов хроматографии, электрофорезов, поверхностного плазмонного резонанса, методов меченых атомов,
Было поставлено две задачи: во-первых, исследовать структуру природных комплексов рибосомных белков S7, которые специфически связываются с РНК, и с помощью метода SELEX сконструировать РНК-аптамеры к термофильному белку, тем самым, отработав методические подходы. Во-вторых, используя метод SELEX, создать бинарные комплексы ДНК с ферментом тромбином, который не взаимодействует с нуклеиновой кислотой, изучить структуру полученных ДНК-аптамеров, ингибирующих активность фермента. Тромбин служит центральным звеном в реакциях свертывания крови. Его избыточная активность создает угрозу развития тромбозов.
Рибосомный белок S7, ключевой белок сборки и функционирования малой субчастицы прокариотических рибосом, образует природные комплексы с двумя различными по структуре молекулами РНК. Он связывается с 16S рРНК и инициирует сборку малой субчастицы рибосомы 30S, а также связывается с межцистронным фрагментом (МЦФ) матричной РНК (мРНК) стрептомицинового оперона, регулируя свой собственный синтез.
В работе были использованы два рибосомных белка из Escherichia coli (EcoS7) и Thermus thermophilus (TthS7). Термофильный белок TthS7 был выбран в качестве объекта, так как представляет собой природный мутант к белку EcoS7, а также в связи с отсутствием данных о регуляции синтеза данного белка в термофильных бактериях.
Вторую задачу решали, используя тромбин, сериновую протеиназу, которая играет ключевую роль в процессе свертывания крови. Тромбин не имеет природных комплексов с нуклеиновой кислотой. Ранее с помощью метода SELEX был получен 15-звенный фрагмент ДНК (Bock, 1992), который ингибировал фибриноген-гидролизующую активность тромбина. С помощью компьютерного моделирования была предложена 31-звенная нуклеотидная последовательность, которая также влияла на активность тромбина (Ikebukuro, 2005). Надо подчеркнуть, что тромбин обладает как прокоагулянтными, так и антикоагулянтными свойствами. Эти активности тромбина не были изучены в присутствии аптамерных ДНК. Наша задача состояла в исследовании структуры новых аптамеров, а также в изучении ингибирующих функций ДНК-аптамеров. Тромбин взаимодействует не только с фибриногеном, но и с клеточными PAR рецепторами (“Protease Activated Receptors”) тромбоцитов, которые участвуют в процессе свертывания крови, поэтому планировали исследовать влияние аптамерных ДНК на агрегацию тромбоцитов, в которой участвуют PAR рецепторы.
Планировали решить следующие задачи.
-
Для изучения структуры и термодинамики природной системы, дифференциального узнавания различных РНК рибосомным белком S7 провести компьютерную аннотацию зоны контакта рибосомного белка Thermus thermophilus (TthS7) с Tth16S рРНК в составе термофильной рибосомы, используя данные рентгеноструктурного анализа (РСА). Провести компьютерное моделирование третичной структуры рибосомного белка Escherichia coli (EcoS7).
-
Изучить комплексообразование рибосомных белков S7 из Escherichia coli (EcoS7) и TthS7 с фрагментами 16S рРНК E. Сoli и делеционными фрагментами str мРНК E. сoli. Получить аптамеры к термофильному белку TthS7, специфически связывающиеся с ним, с помощью метода SELEX, отработав методы селекции.
-
Создать аптамерные ДНК к тромбину, провести компьютерное моделирование их структуры, Оценить эффективность ингибирующего действия аптамеров и их производных на активность тромбина в реакциях фибринолиза и агрегации тромбоцитов в условиях in vitro и in vivo .
-
Создать модифицированные производные аптамеров для защиты от действия нуклеаз. Оценить эффективность ингибирующего действия модифицированных аптамеров на активность тромбина и возможность подавления тромбообразования в модели in vivo.
-
Создать структуру аптамерной ДНК (антидота) и изучить конкурентное взаимодействие нуклеопротеидного комплекса аптамер-тромбин с комплементарной ДНК к аптамеру.
Научная новизна и практическая значимость работы. В данной работе были использованы термодинамические подходы при изучении бинарных нуклеопротеидных комплексов. Впервые они охарактеризованы с помощью таких понятий, как аффинность, специфичность, конкурентное связывание. Для детального изучения ДНК/РНК-белковых комплексов очень большое значение имеет получение корректных характеристик, например, кажущихся констант диссоциации, которые позволяют сравнить комплексы по сродству между собой. С учетом того, что бинарный комплекс образуется при взаимодействии двух конформационно лабильных макромолекул – РНК/ДНК и белка – необходимо было особое внимание уделять унификации их конформации. Любой препарат РНК практически всегда представляет собой набор различных конформеров, описываемых, например, в терминах “конформационного ландшафта” РНК (Russell, 2002). Видимо, поэтому изотермы связывания для РНК-белковых комплексов никогда не достигают платовых значений в 100% - экспериментальный факт, который неоднократно, но без объяснений, констатировался в литературе. Конформационная гетерогенность может быть обусловлена не только процедурой выделения препарата РНК, белка. В связи с этим предложен подход, основанный на денатурации фрагментов рРНК, мРНК, РНК/ДНК-аптамеров при 90 0С с последующим резким охлаждением во льду. Для белков был предложен метод ступенчатого диализа с целью постепенной сборки нативной структуры. Были рассчитаны кажущиеся константы диссоциации, как для природных нуклеопротеидных комплексов, так и для искусственных. Стандартные изотермы комплексов рибосомного белка с различными РНК были подвергнуты дальнейшему анализу с помощью преобразований Скэтчарда.
Новизна работы состоит в использовании комбинаторных библиотек нуклеиновых кислот (НК).
К началу работы не было данных о комплексе термофильного рибосомного белка S7 с регуляторным межцистронным фрагментом (МЦФ) мРНК стрептомицинового оперона E.coli. Оперон назван так потому, что мутации в этом опероне вызывают появление устойчивости штаммов бактерий к действию антибиотика стрептомицина за счет мутаций в гене белка S12. Не было данных о регуляторном районе синтеза данного белка в клетке. На основе рентгеноструктурных данных была предложена модель термофильной 30S субчастицы рибосомы (Ramakrishnan, 1999), в состав которой входит белок S7, но все биохимические данные о связывании S7 с рРНК и с мРНК были получены для мезофильного белка S7 E.coli (Nomura, 1994; Cпирин, 1995).
Поэтому одной из задач было найти элементы связывания, ранее неизвестные, в структуре различных РНК с термофильным белком S7, используя комбинаторную библиотеку на основе мРНК. Надо отметить, что в методе SELEX используют небольшие фрагменты НК (30-100 нуклеотидных остатков), поэтому необходимо было отработать получение аптамеров, удовлетворяющих этим условиям. Методы и подходы, отработанные в экспериментах с комбинаторными библиотеками на белке, обладающем РНК-связывающей активностью, были применены к искусственным системам.
Развивая новое направление, создание лекарственных препаратов на основе нуклеиновых кислот, были получены и исследованы искусственные комплексы ДНК-аптамеров к тромбину. Используя опыт, полученный при селекции природной системы, был проведен отбор аптамеров к тромбину, и получены родственные нуклеотидные последовательности. Впервые найдено несколько аптамеров, обладающих высокой ингибирующей активностью к тромбину SG50, SG51, SG52, SG53, SG54, RSG55, RE31, ST43,. Их структура охарактеризована с помощью КД-спектроскопии, молекулярной динамики (МД). Впервые искусственный комплекс аптамерная ДНК-тромбин был охарактеризован как бинарный нуклеопротеидный комплекс.
Совместно с сотрудниками Российского кардиологического научно-производственного комплекса Росмедтехнологий (лаборатория проф. А.В. Мазурова) впервые было изучено влияние аптамеров на агрегацию тромбоцитов человека, что расширило представления о механизмах свертывания крови. Впервые исследованы изменения параметров коагуляции плазмы крови в присутствии аптамеров по четырем показателям: тромбиновое время, протромбиновое время, АЧТВ (частичное тромбопластиновое время), амидолитическая активность. Предложено использовать данные аптамеры как лекарственные препараты при внутрисосудистом тромбообразовании. Получены патенты РФ: № 2401306, дата приоритета 17 декабря 2008 г. и № 2410432, дата приоритета 23 ноября 2009 г.
Проведены эксперименты по ингибированию тромбозов у животных в присутствии новых аптамеров на моделях артериального тромбообразования.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на Международном конгрессе по антителам « BIT Life Sciences, Antibody-2010», (Пекин, Китай, 2010); на съездах Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Санкт-Петербург, 2002; Новосибирск, 2008); на съезде физиологов СНГ (Кишинев, Молдавия, 2008); на Международной конференции «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины» (Астрахань, Россия, 2008); на Международном форуме по нанотехнологиям (Москва, 2008); на Всероссийских конференциях по клинической гемостазиологии и гемореологии в сердечно-сосудистой хирургии (Москва, 2007, 2009, 2011); на симпозиумах по химии протеолитических ферментов (Москва, 2002, 2008); International Symposium «Strategies on the Development of New Biological Products» (Сеул, Южная Корея, 1999); на Международном симпозиуме XVIth International Symposium on bioelectrochemistry and bioenergetics (Bratislava, Slovakia, 2001); на Российском конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2001, 2007, 2008); на 7-ой конференции IUBMB “Receptor-Ligand Interactions. Molecular, Physiological and Pharmacological Aspects” (Bergen, Norway. 2002).
Личный вклад автора
В цикле исследований, составляющих диссертационную работу, автору принадлежит решающая роль в выборе направления исследований, разработке экспериментальных подходов, в обобщении полученных результатов. В работах, выполненных в соавторстве, личный вклад автора заключается в непосредственном участии во всех этапах исследования - от постановки задачи, проведения экспериментов до обсуждения и литературного оформления полученных результатов.
Основные положения, выносимые на защиту.
- Изучение структуры и термодинамики природной бинарной системы, дифференциального узнавания различных РНК рибосомным белком S7 прокариот.
- Создание плазмидных конструкций для получения фрагментов рибосомной и матричной РНК, проведение делеционного анализа межцистронного фрагмента мРНК E.coli, отработка метода SELEX при создании аптамерных РНК к термофильному рибосомному белку;
- Изучение структуры и термодинамики искусственной бинарной системы тромбин – аптамерная ДНК. Получение различных 31-звенных ДНК-аптамеров и их модифицированных аналогов;
- Изучение динамики и оптимальных условий сборки и стабильности базовых и модифицированных G-квартетов ДНК-аптамеров, которые ингибируют фибриноген-гидролитическую активность тромбина;
- Исследование ингибирующего воздействия аптамеров на две прокоагулянтные реакции тромбина – свертывание фибриногена и активацию PAR-1 рецепторов;
- Изучение аптамерных ДНК в качестве ингибиторов внутрисосудистого тромбообразования на модельных клеточных системах (тромбоцитах), а также на животных моделях.
Структура работы и объем работы. Диссертационная работа изложена на 246 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты и их обсуждение, материалы и методы, выводы и приложение. Материал иллюстрирован 75 рисунками и 8 таблицами. Библиографический указатель включает 248 ссылок.
Аптамеры как инструменты в биохимических исследованиях
В настоящее время в мировой практике комплекс антиген-антитело рассматривается как «золотой стандарт» специфического взаимодействия биомолекул. Это определило использование моноклональных антител (МА) в медицинской диагностике и терапии. По способности образовывать специфический комплекс аптамеры, по сути, являются функциональными аналогами антител, поэтому создание аптамеров, обладающих ингибирующим или активирующим воздействием на белки, совершенно актуально. Специфичность взаимодействия искусственного комплекса аптамер-белок, как правило, сравнивают с природным специфическим комплексом антиген-антитело. Константа диссоциации таких комплексов лежит в пределах 10-50 нМ. В работе Джейясона проведено сравнение свойств антител с аптамерами [18].
1. Процесс идентификации антител начинается с животных, поэтому наработка антител к таким молекулам как токсины становится мало реальной. Кроме того, получение антител против молекул, которые малоиммуногенны, очень затруднено. Аптамеры, напротив, получаются химическим синтезом, чисто теоретически аптамеры могут быть получены к любым мишеням. Так как животные не нужны для получения аптамеров, то к токсинам и другим ядовитым веществам могут быть получены аптамеры высокого сродства.
2. Создание гибридом, как правило, проводят на крысах или мышах, поэтому такие антитела можно использовать в диагностических наборах. При переходе к человеку требуется проводить дополнительные процедуры («хъюманизация»), Человеческие антитела, которые подобны антителам другого организма, могут потенциально связаться с другими белковыми молекулами, что приводит к артефактным результатам. Например, ревматоидные факторы и аутоиммунные антитела часто дают перекрестные реакции (интерферируют) в иммунном анализе.
3. Идентификация и получение моноклональных антител в лаборатории может быть очень дорогим процессом. Химический синтез аптамеров отработан на синтезаторах, стоимость одного шага не превышает 1 доллара.
4. Получение антител и их хранение требует особой тщательности. Замороженные культуры клеток, продуцирующие антитела, должны храниться в разных местах во избежание гибели клеток в одном из хранилищ по независящим от человека причинам. Типично высокий выход моноклональных антител получается при росте гибридомы перитональных животных и очистке антител от асцитной жидкости. Некоторые гибридомы трудны для выращивания in vivo, что резко сокращает выход антител. Аптамеры -стабильны, растворы аптамеров хранят в обычных холодильных камерах.
5. Получение антител от выделения к выделению меняет их активность, что каждый раз требует оценки иммуноанализом. Аптамеры синтезируют химическим синтезом с максимальной аккуратностью. Чистота синтеза проверяется ВЭЖХ и электрофорезом. Аптамеры могут быть повторно очищены, если возникают вопросы при работе с ними.
6. Хотя продукция антител есть предмет изучения in vivo, идентификация антител ограничена параметрами in vivo. Другими словами, оценить антитела в других нефизиологических условиях невозможно.
7. Кинетические параметры взаимодействий мишень - антитело не могут быть изменены по желанию. 8. Антитела чувствительны к температуре, при повышении температуры может происходить необратимая денатурация.
9. Преимущество аптамеров заключается в том, что селекция может быть выполнена при различных условиях, что позволяет использовать и нефизиологические условия (буфер, температура). Кинетические параметры, константы ассоциации и константы диссоциации, могут быть изменены по желанию.
10. Аптамеры неиммуногенны. Надо подчеркнуть, что в предклинических исследованиях в избытке 1000-кратных доз на животных моделях и на человеке терапевтическое применение аптамеров не вызывало аллергических реакций. [27, 28].
Подобно антителам аптамеры сворачиваются в сложные трехмерные структуры, образуя шпильки, петли. Как ДНК-, так и РНК-аптамеры связываются со своими белковыми мишенями с константой диссоциации от наномолярного до субнаномолярного уровней. Аптамеры различают родственные белки, состоящие из общего набора структурных доменов [29-32].
Свойства аптамеров, способных специфически связываться и «узнавать» свои мишени как антитела, делает их привлекательными в терапевтических целях, в тест-системах.
На рис. 5 приведены структуры аптамеров родственных молекул: к аденину, к АТФ и цАМФ. Все они содержат одно и тоже азотистое основание, но нуклеотидные последовательности и вторичная структура резко отличаются друг от друга. Непрерывный рост числа аптамеров, полученных к различным мишеням, способствовал развитию путей их использования в качестве биотехнологических инструментов для изучения специфических функций клеточных белков, для определения путей передачи сигналов, как диагностические инструменты in vitro и in vivo и т.д. [33].
Например, получены высокоспецифичные аптамеры к домену белка Rafl, который, связывая Ras белок, ингибирует киназный каскад передачи сигнала, индуцированного Ras белком. Аптамеры специфически ингибируют Ras/Rafl и, в отличие от антител или фрагментов антител, не влияют на связывание Ras с B-Raf (близко родственным белком) Ras/B-Rafl [34].
Аптамеры к моноклональному антителу (Mab) к ацетилхолиновому рецептору
Было проведено изучение структуры 15ТВА ЯМР, рентгеноструктурным анализом в комплексе с тромбином и отдельно, исследовали связывание аптамера с анион-связывающим участком тромбина (экзосайтом I) Г120-123] (рис. 16 А). 15ТВА влияет и на агрегацию тромбоцитов, стимулированную тромбином. Тромбин протеолитически активирует рецептор PAR-1 тромбоцитов, аптамер дозозависимо ингибирует гидролитический разрыв рецептора [124].
Антикоагуляционная активность аптамера была тестирована на обезьянах. Протромбиновое время (РТ), которое характеризует скорость образования сгустка при действии эндогенного тромбина, увеличивалось в 1,7 раза в течение 10 мин. и возвращалось к базовой линии через 10 мин. после окончания введения аптамера. 15ТВА также ингибировал агрегацию тромбоцитов и продлевал индуцированную тромбином активацию тромбоцитов [125].
Аптамер был изучен на антикоагуляционной модели в экстракорпоральной циркуляции на овцах. Значения РТ достигали 40-45 сек. (базовая линия 21,7сек.), в то время как контрольное РТ оставалось близким к базовой линии. В другом эксперименте 15ТВА был изучен на модели шунтирования легочной артерии (СРВ). Были исследованы антикоагулянтная активность, почечный клиренс аптамера, фармакокинетика [126].
Животные были разбиты на две группы, первая, получавшая инъекции гепарина (300 Ед/кг) и протамина болюсно, была использована для контроля активности по СРВ. Вторая группа животных получала 0,3 - 0,5 мг/кг веса/мин аптамера инфузией. У этих животных было отмечено увеличение РТ, активированного частичного тромбопластинового времени (аРТТ) и активированного времени образования тромба (ACT), которое затем возвращалось к базовой линии после остановки инфузии [126, 127].
Фармакокинетику изучали на модели СРВ и обнаружили, что время полужизни аптамера составляет 1,9 мин., однако, при 60 минутной инфузии время жизни увеличивалось до 7,7 мин. Эти результаты указывают на то, что аптамер мог бы функционировать в животной модели, но немодифицированные ДНК-аптамеры быстро выводятся из организма [127]. В настоящее время этот ДНК-аптамер проходит предклинические испытания в «Archemix Corp.» для подготовки экспериментов на человеке.
РНК-аптамеры против тромбина были получены с использованием библиотеки с 30-нуклеотидной рандомизированной последовательностью [128, 129]. После двенадцати раундов селекции были получены аптамеры против тромбина. Обогащенную фракцию клонировали в pUC18 и секвенировали; в результате были получены два семейства аптамеров. Консервативный мотив в 22 клонах первого набора представлял UCCGGAUCGAAGUUAGUAGGCGGA последовательность внутри вариабельной зоны. Один из лучших аптамеров в комплексе с тромбином имел сродство к белку IQ- 9,3=U,0 нМ. Представители второго семейства обладали более низким сродством Kd = 155±9,0 нМ. Конкурентный анализ с гепарином и гирудином показал, что гепарин вытесняет РНК-аптамер из комплекса с тромбином, а гирудин - нет. Это указывало на сродство данного аптамера к экзо-сайту II тромбина. Однако тесты на функциональную активность на животных моделях проделаны не были.
В предклинических испытаниях высоко-специфичные аптамеры, полученные к белкам человека, могут хуже связываться с белками — ортологами на животных моделях. Для преодоления этой проблемы был использован т.н. "toggle" подход, при котором 2л-фторпроизводные РНК инкубировали со смесью тромбина человека и свиньи в первом раунде селекции, а в последующих раундах использовали в качестве мишени тромбин человека и свиньи поочередно [91].
После 13-ти раундов селекции были выявлены клоны с консервативными последовательностями 5 -GGGAACAAAGCUGAAGUACUUACCC, которые перекрестно реагируют с тромбином человека и свиньи. Комплекс с тромбином человека имел константу диссоциации: Kd = 2,8 ± 0,7 нМ; с тромбином свиньи: Kd = 83±3 пкМ. Аптамер удваивал время свертывания (концентрация тромбина 10 нМ) плазмы крови от 11,6± 0,2 сек. до 22,6±1,4 сек. В плазме крови свиньи Tog-25 увеличивал время образования тромба в 4 раза от 15,7± 0,7 сек. до 61,9±1,2 сек. Улучшение тромбин-зависимой агрегации тромбоцитов с помощью аптамера происходило дозозависимо. При этом больший эффект достигали на тромбоцитах свиньи, приблизительно 10-кратный избыток Tog-25 ингибировал на 90% активность тромбина [91].
Анализ связывания делеционных фрагментов межцистрона str мРНК Е. coli с белками EcoS7 и TthS7
Терапевтическое использование аптамеров было предпринято при изучении репликации вируса иммунодефицита HIV. Вирусы иммунодефицита человека ВИЧ-1 и ВИЧ-2, относящиеся к подсемейству лентивирусов, избирательно поражают Т-хелперы. Вирусный регуляторный Tat-белок активирует вирусную репликацию. Элемент (TAR) длиной в 60 нуклеотидов, присутствующий во всех предсказанных вирусных транскриптах РНК, требуется для функционирования Tat-белка. Было предложено экспрессировать TAR последовательность с целью захвата Tat-белка, как в РНК-овую ловушку в 60 нуклеотидов длиной [159-161].
Природную последовательность TAR—транскрипта вируса HIV экспрессировали в клетках СЕМ SS. РНК-овая ловушка ингибировала до 99 % репликации вируса ГПУ in vitro. Ингибирование репликации протекало при экспрессии природных TAR аптамеров с высоким уровнем с тРНК-ого промотора в клетках CD4+. Изменение нуклеотидной последовательности шпильки или петель в структуре TAR-аптамера разрушало способность ловушки связывать Tat белок и нарушало ингибирование HIV [160, 161].
С помощью метода SELEX была выполнена селекция на Tat белок с целью получить искусственный аптамер, связывающий Tat белок. Используя 120-звенные рандомизированные библиотеки и проведя 11 раундов селекции, был получен укороченный вариант РНК-аптамера, названный RNATat, образующий комплекс с Tat белком с Kd =120 пМ. Этот 37-звенный аптамер ингибировал HIV-1 in vitro и снижал репликацию вируса на 70 % в культуре клеток [162] (рис. 22).
В других исследовательских группах также были получены РНК-вые ловушки, которые связывали Tat белок и ингибировали HIV-1 [163, 164]. A U G C G«C G»C т д д № G А A - Последовательность РНК-аптамера к Tat белку, Б - Вторичная структура данного аптамера в виде псевдоузла [162]. Но было отмечено существование несовместимости между TAR и Tat взаимодействиями HIV-1 и HIV-2, относящихся к разным подсемействам. В то время как Tat-І может трансактивировать HIV-2 через TAR-2, Tat-2 не взаимодействует с TAR-1 BHIV-1 [165]. 1.7.2. Аптамеры к HIV-1 Rev (ревертаза)
Вирусный белок Rev способствует транспорту молекул РНК, подвергнутых частичному сплайсингу, в цитоплазму, которые обеспечивают синтез обычных ретровирусных продуктов. RRE элемент (Rev Responsive Element), состоящий примерно из 234 нуклеотидных звеньев, образует сложную трехмерную структуру, с которой и связывается Rev белок [166]. Используя промотор тРНК для экспрессии RRE элемента, основного Rev-связывающего сайта в вирусе HIV-1, в клетках оценивали влияние избыточного синтеза данной конструкции. Экспрессией химерного тРНК- RRE аптамера была подавлена вирусная репликация более, чем на 90 % [167]. Аптамеры прошли 1 фазу клинических испытаний, в которых данная конструкция была перенесена in vitro в клетки CD34+ из клеток костного мозга пациента с HIV-1 с последующий реинфузией в объект. После введения аптамера не наблюдали никакого неблагоприятного отклика, однако отмечали невысокий уровень экспрессии гена RRE-аптамера, по-видимому, потому что был введен низкий уровень гена [168].
Обратная транскриптаза (RT) стала первой мишенью при разработке метода SELEX в HIV- терапии. Тюрк и Голд опубликовали основополагающую статью о SELEX. Они использовали обратную транскриптазу как мишень для выделения РНК-лигандов, которые бы ингибировали HIV репликацию [1]. Используя рандомизированную библиотеку по 32 позициям, после 9 раундов селекции авторы выделили РНК, которая специфически связывалась с обратной транскриптазой HIV и ингибировала её активность [169]. Структура РНК аптамера была впоследствии охарактеризована, и эксперименты на клетках показали уменьшение репликации HIV-1 на 90-99 % [170]. Кроме того, Т клетки, экспрессирующие аптамер, полностью блокировали распространение HIV в культуре [171].
Ингибирующая активность аптамера проиллюстрирована электрофореграммами, представленными на рисунке 23. toWWton «wfrwiligawl affected ШША {ск тЫ)ХНА Ингибирование HIV RT аптамером 1.1. Стартовая рандомизированная по 32 позициям библиотека РНК и выделенный аптамер 1.1 были введены в реакцию с RT. На рис. справа жирная верхняя полоса показывает продукт ферментативной реакции с помощью RT в присутствии стартовой библиотеки. На левом рис. отсутствие полосы, соответствующей продукту синтеза в присутствии аптамера с помощью RT, свидетельствует об ингибирующем эффекте аптамера 1.1 [169].
Пролиферация клеток сердечной мышцы и сосудов - это центральная проблема в развитии таких сердечно-сосудистых болезней, как гиперплазия, атеросклероз, злокачественные опухоли [172]. E2F является центральным в регуляции клеточной пролиферации. Белковьш фактор E2F связывается с высокой специфичностью с двутяжевой ДНК, содержащей восемь пар оснований TTTCGCGC. Был сконструирован 14-звенный ДНК-аптамер. Он содержал последовательность для связывания E2F и был тестирован на способность ингибировать активность E2F [173]. В клетках сосудов в мышщцах (VSMC), стимулированных EF2, 14-звенный олигонуклеотид (ODN) ингибировал пролиферацию клеток и экспрессию генов с-тус, cdc2, контролирующих клеточный цикл. In vivo 14-звенный ODN ввели трансфекцией на модели пересадки тканей в сонные артерии крысы и показали заметную репрессию образования фиброзной оболочки в сравнении с нетрансфицированными сегментами артерии. Кроме того, это ингибирование поддерживали в течение 8 недель после одной трансфекции [173]. С помощью метода SELEX были выделены ДНК аптамеры к E2F, которые ингибировали ДНК-связывающую активность белка [174].
Эти интересные результаты позволили группе Дзао провести испытания аптамера к E2F на человеке, чтобы определить, можно ли ограничить гиперплазию интимы при введении аптамера в вену [175]. E2F аптамер доставляли в паховую вену с помощью трансфекции. Эффективность клеточной трансфекции составляла 89 % , экспрессия гена с-тус уменьшалась до 73 %, в сравнении с контрольной группой. После 12-месячных осмотров только небольшое число стенозов было замечено в группе больных, получивших E2F аптамер, в сравнении с контрольной группой.
E2F аптамер был также использован для оценки длительности действия при гиперплазии неоинтимы и атеросклерозе. [176]. На модели гиперхолестеролэмии на кроликах вводили в шейную вену E2F аптамер и олигонуклеотид случайной последовательности. После 6 месяцев, когда животные находились на холестеринсодержащей диете, группа с E2F аптамером не имела бляшек, в то время как в группе животных, получавших олигонуклеотид со случайной последовательностью, и в контрольной группе имело место интенсивное образование холестериновых бляшек [176].
Определение нуклеотидной последовательности фрагментов РНК через секвенирование ДНК по Сэнгеру
Одним из современных методов, который позволяет получить не только равновесные характеристики связывания, но и кинетические, является метод поверхностного плазмонного резонанса (ППР), используемый в приборах Биакор (Biacore). Система Биакор использует явление ППР для измерения бимолекулярного взаимодействия в режиме реального времени без использования флуоресцентных или радиоактивных меток. ППР возникает на поверхности металла при условии полного внутреннего отражения, характеризуется определенным углом отражения и, следовательно, показателем преломления. Этот эффект, возникая на поверхности металлической пленки, распространяется вглубь раствора, затухая экспоненциально, как функция расстояния [233]. Взаимодействия между молекулами, сорбированными на поверхности, изменяют затухающую волну, что приводит к изменению характеристик поверхностного плазмона, которые выражаются в изменении резонансного угла и показателя преломления в поверхностном слое. По изменению показателя преломления судят о взаимодействии биомолекул.
Изменения ППР выражаются в резорансных единицах, RU, где одна RU л эквивалентна одному пикограмму вещества на квадратный миллиметр поверхности сенсора. В ходе эксперимента на приборе Биакор один из взаимодействующих партнеров, лиганд, иммобилизован на поверхности биосенсора (чипа), а другой, аналит, растворен в буфере, который протекает над поверхностью чипа. Образование и диссоциация комплекса между двумя взаимодействующими молекулами сопровождается ППР, который отражает изменение массы на поверхности чипа. Сигнал записывается в виде сенсограммы (рис 58.). Эта технология дает количественную информацию о кинетических параметрах и константу, характеризующую аффинность (кКД
Используя иммобилизованный тромбин на чипе СМ5, был получен сигнал с увеличением концентрации аптамера в аналите, но амплитуда сигнала была невелика. Было решено провести обратный эксперимент. Иммобилизовать аптамер на чипе, а в аналите пропускать тромбин различной концентрации. Аптамер был иммобилизован на поверхности стрептовидинового чипа, а раствор тромбина подавали в потоке над поверхностью чипа, тем самым оценивали тромбина в растворе. В систему вводили тромбин человека в диапазоне концентраций 5,4 - 270 нМ (0,18-10 нг/мкл). Результаты, представленные на рис. 58Б показывают, что увеличение резонанса регистрируется даже при добавлении самой низкой концентрации тромбина — 5,4 нМ, что приблизительно соответствует чувствительности данного метода. Надо заметить, что концентрация тромбина в кровотоке у здоровых людей оценивается как 5-8 нМ. Увеличение концентраций тромбина приводит к увеличению сигнала, что позволяет предположить, что данный метод может, быть использован не только для качественного, но и количественного определения концентрации тромбина в растворе, в плазме как биосенсор.
Было изучено влияние 31ТВА аптамера на ферментативную активность тромбина in vitro (рис. 59). Было установлено, что аптамер ингибирует гидролиз фибриногена при увеличении концентрации ДНК-аптамера вплоть до 700 нМ, что значительно превышало концентрацию фермента в реакции.
Тромбин - это сериновая протеиназа, которая расщепляет пептидную связь, образованную аргинином или лизином в низкомолекулярных субстратах (амидолитическая активность). Тромбин играет центральную роль в процессах свертывания крови. Он гидролизует высокомолекулярный субстрат, фибриноген [ПО], до фибрина (рис. 60), а также расщепляет мембранный рецептор на тромбоцитах, способствуя их агрегации. Образующийся новый N-концевой фрагмент рецептора взаимодействует со специальным участком рецептора, что и приводит к активации и последующей агрегации тромбоцитов.
Тромбин регулирует прямо противоположные реакции: свертывание крови, противосвертывание, фибринолиз и агрегацию тромбоцитов. Направленность (специфичность) его действия определяется тем, что в реакциях гидролиза высокомолекулярных субстратов участвуют как минимум, два участка молекулы тромбина - активный центр фермента и области специфичного «узнавания» ряда субстратов и кофакторов (экзосайт I и экзосайт II). При повреждении стенки кровеносных сосудов начинается каскад протеолитических реакций, где каждый предыдущий белковый фактор (протеаза) активирует каждый последующий [111].
Протромбин, синтезируемый печенью как неактивный предшественник, активируется X фактором в комплексе с V, а появившийся тромбин не только гидролизует фибриноген до фибрин-мономера - структурной основы тромбов,
