Введение к работе
Актуальность проблемы. Способность эндонуклеаз рестрикции, ша П узнавать и расщеплять строго определённые последовательности ЩК обусловила их широкое практическое применение. Ферменты рестрикция используются для картирования ДНК, хромоеомного :шапь за, конструирования нових ДНК. Система эвдонуклеаза рестрикции -ДНК-дуплекс является удобным объектом для выяснения центральной проблемы молекулярной биологии - вопроса о природе специфического белково-нуклешювого взаимодействия. Несмотря на большое число уже известных эндонуклеаз рестрикции (более 600), подробно изучено только несколько ферментов. Расширение исследований в области молекулярной биологии и генетической ипзенерии требует изучения новых рестриктаз, взаимодействующих с различными нуклеотид-ныш последовательностями.
Объектами настоящего исследования являлись эндонуклеазы рестрикции Mval и EcoRll, которые узнают в ДНК одну к ту ко нуклео-тидную последовательность, но расщепляют её в различных положениях (место расщепления отмечено стрелкой):
Mval EaoRII
5'...С-СІТ-G-G...3* 5'..Іс-C-T-G-G.. .3'
3,...G-G-A-rC-C\..5' 3'...G-G-A-C-C...5'
Особенностью участка узнавания этих ферментов является частично нарушенная симметрия второго порядка в районе центральной АТ-па-ры. Эвдонуклеаза рестрикции EcoRii выделена из штамма-суперпро-дуцента Escherichia coli B834/PSK323 (Косых и др., 1930). В течение ряда лет она изучалась в нашей лаборатории. Выявлен ряд особенностей структуры фермент-субстратного комплекса и механизма ферментативной реакции. Эвдонуклеаза рестрикции Mval выделена В 1985 ГОДУ ЯнулаЙТИСОМ И др. ИЗ клеток Micrococcus varians R!L 19. Этот фермент является составной частью системы рестрикции-модификации нового типа: метилазаМуаі модифицирует второй с 5*-конца участка узнавания остаток dc по экзоциклцческой аминогруппе CButicus et ai, 1985). Данные о механизме действия рестриктазы Mval практически отсутствуют.
Целью настоящей работы явилось исследование механизма узнавания и расщепления субстратов эндонуклеазами рестрикции Mval и EcoRii. В случав эндонуклеазы EcoRii основное внимание уделено выявлению контактов этого йеталента с гетероциклическими основаны-
яки участка узнавания и углеводфосфатным остовом ДНК. Особый интерес представляет сравнение свойств эвдонуклеаз-изоинзомеров
Kval U EcoRll.
Для решения поставленных задач перспективно использовать синтетические субстраты, содержащие природные или модифицированные участки узнаванім этих ферментов. Наряду с ДЖ-дуплексами ко-нкатемерного типа, предложенными- ранее для исследования эндопук-леазы EooRil (Громова и др., 1984), применяли субстраты, содержание только'один участок узнавания ферментов Mvai и EcoRll. В задачу работы входил синтез ДШ-дуплексов длиной 29-30 нуклеотидішх паи со структурными аномалиями в участке узнавания и прилегающих к нему куклеотпдных последовательностях.
Научная новизна it практическая ценность работы. На оснозаі-нпі анализа расцепления ДІІК-дуплексов с различными тилами кодайикацкі: .выявлены группы атомов готерсцгаслических оснований и углеводфос-фатного остова, которые вовлечены во взажлодействие (или сблинень с (йазазіональнямії группами эндонуклеаз рестрикции Kval и EcoRll. Обнаружено влияние структура нуклеотиднцх последовательностей! прилегающих к участку узнавания, на скорость расщепления ферментг :.зі .Mval и EooRil отдельных цепей субстрата. Впервые наблюдался ш обычный характер кинетики гидролиза протяжённого ДНК-дуплекса эп-донуклеазой рестрикции Mvai, связанны;*! с накоплением в реакцконж смеси иктермедпата с одноцепочечным разрывом. Установлено, что и дролиз обеих цепеіі субстрата ферментом Mval мо:-:;ет проходить чере: стадию диссоциации фермент-субстратного коїлплекса после первого акта расщепления. В отличие от эндонуклеазы рестрикции EcoRll, в случае фермента Kvol наблюдается замедление расщепления немодифи цированной цепи ряда ДНК-дуплексов при отсутствии ингибпрования гидролиза модифицированной цепи отих субстратов. Показана способ ность рестриктазы Kvai с высокой эффективностью осуществлять нал разденные одноцепочечные разрывы'в некоторых модифицированных су бстратах. На оекозании полученных данных сделан вывод о том, что эндонуклеазы-пзошпзомеры Mvai и EcoRll узнают и расщепляют одну ту ге последовательность .ДНК по различным механизмам.
Полученные результаты по механизму узнавания и расщепления субстратов эндонуклеазамн рестрикции Mvai и EcoRii представляют интерес для понимания общих принципов белково-нуклеинового взаимодействия. Данные о расщеплении этими ферментами ДШС-дуплексов, содержащих в участке узнавания остатки m5ac, m4dc и m6dA,- а таи
некомплементарные аа, gg- и тт-пары могут быть использованы з генетической инженерии.
Апробация работы. Результаты работы доісладавались на УП Международной симпозиуме по химии нуклеиновых кислот и кх компонентов (г.Бехинь, ЧССР, 1987), на Ш Всесоюзном совещании по органической химии ДНК-дуплексов (г.Тбилиси, 1987), на У Всесоюзной конференции "Методы получения и анализа биохимических препаратов" (г.Юрмала, 1987) и на конференции молодых учёных Меяфакультвтсдой проблемной НИЛ им. А.Н.Белозерского МГУ (г.Москва, 1937).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 ргчйот.
Структура и объём работы. Диссертация изложена на 167 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов, списка литературы (168 ссылок), содершіт 27 рисунков и 13 таблиц.
