Введение к работе
Актуальность темы.
Нарушения свертывания крови являются одной из ведущих причин смертности в современном мире, поскольку непременно возникают при сепсисе, травме, тяжелых кровопотерях, любых существенных операционных вмешательствах (А.И. Воробьев с соавт., 2001; R. Chakrabarti et al., 2007). Диагностика этих нарушений до сих пор остается несовершенной и позволяет выявлять далеко не все нарушения в системе гемостаза. Недостатком большинства существующих тестов является то, что свертывание протекает во всем объеме исследуемой пробы, и это принципиально отличается от условий, в которых сгусток-тромб образуется в живом организме в месте повреждения стенки сосуда (Н.С. Hemker et al., 2000; М.А. Пантелеев с соавт., 2008).
Система гемостаза представляет собой сложный каскад ферментативных реакций. Свертывание начинается при контакте крови с поверхностью клеток, находящихся в зоне повреждения стенки сосуда и имеющих на поверхности белок, который является сигналом для запуска свертывания. Этим главным активатором свертывания является интегральный мембранный белок - тромбопластин (тканевой фактор, ТФ). Тканевой фактор не обладает ферментативной активностью, но является кофактором фактора свертывания Vila - сериновой протеазы. Когда фактор Vila ^Vlla) связывается с тканевым фактором, получившийся комплекс, называемый внешней теназой, становится способен активировать факторы IX и X, что запускает весь каскад свертывания и приводит к образованию сгустка. Процесс довольно сложен не только с точки зрения биохимических превращений. Важно учитывать его пространственную неоднородность и диффузию факторов свертывания (М.А. Panteleev et al., 2006). Пространственная динамика свертывания может быть условно разделена на несколько стадий: 1) активация: в зоне повреждения кровь контактирует с клетками, имеющими на клеточных мембранах иммобилизованный тканевой фактор; при этом образуется комплекс VIIa/ТФ, который начинает процесс свертывания, активируя фактор X на поврежденной поверхности; 2) рост сгустка вдали от активатора, который определяется диффузией и образованием новых активных факторов, не связанным с активностью комплекса VIIa/ТФ, а обусловленным специальными реакциями поддержания роста; 3) остановка роста сгустка, которая происходит на довольно большом расстоянии от зоны активации. Она обусловлена особым каскадом биохимических реакций, инактивирующих активные факторы свертывания.
В традиционных тестах по исследованию свертывания, активаторы добавляются в объем плазмы и все активно перемешивается. В результате
доминирующими оказываются реакции только первой стадии. Нарушения в остальных стадиях обнаруживаются такими методами довольно плохо.
Разработанный в ГНЦ РАМН метод и прибор для исследования пространственной динамики свертывания плазмы крови позволяет наиболее полно смоделировать ту пространственную ситуацию, в которой кровь свертывается непосредственно в кровеносном сосуде (Атауллаханов с соавт., 1995; F.I. Ataullakhanov et al., 1998; M.V. Ovanesov et al., 2002). Сущность метода заключается в том, что в измерительной кювете имитируется локальное повреждение стенки сосуда. При повреждении стенки сосуда в кровь экспонируется тканевой фактор - белок, иммобилизованный на мембране клеток сосудистой стенки, которые до повреждения были закрыты слоем эндотелия. Контакт крови с тканевым фактором в измерительной кювете достигается за счет того, что на одной из стенок кюветы находится иммобилизованный тромбопластин. Появление и пространственный рост сгустка от активатора регистрируется по светорассеянию методом темного поля. При этом можно измерять такие важные характеристики процесса как скорость роста, размер сгустка, образование спонтанных сгустков - информацию, которая недоступна гомогенным методам (E.I. Sinauridze et al., 1998; A.Y. Kondratovich et al., 2002; К.Г. Копылов с соавт., 2003; M.V. Ovanesov et al., 2003; M.V. Ovanesov et al., 2005; M.A. Panteleev et al., 2006). Это позволяет одновременно и независимо регистрировать нарушения на всех стадиях процесса. Клинические перспективы исследования пространственной динамики свертывания велики, однако его внедрение в клиническую практику тормозится тем, что в представленном в литературе варианте метода в качестве локального активатора свертывания был использован монослой фибробластов (M.V. Ovanesov et al., 2002). Такая технология является дорогостоящей и трудоемкой и не может быть основой для проведения рутинных исследований. Поэтому перед нами встала задача разработать ту часть экспериментальной установки, которая имитирует зону повреждения стенки сосуда. Таким элементом измерительной кюветы является пластинка, на поверхности которой должен находится иммобилизованный тромбопластин. В дальнейшем будем называть ее активатором свертывания. Нужно было разработать активатор свертывания, сравнимый по способности активировать свертывание с поверхностью покрытой фибробластами, но более удобный в применении и стабильный при хранении.
Цель работы:
Разработка метода иммобилизации тромбопластина на поверхности активатора свертывания. Сравнение способности активировать свертывание крови иммобилизованным тромбопластином и тканевым фактором фибробластов.
Задачи исследования: 1. Разработать метод иммобилизации тромбопластина на пластиковой поверхности активатора свертывания;
Исследовать поверхностную плотность и биохимические характеристики иммобилизованного тканевого фактора (константу связывания с фУПа, условия хранения активатора свертывания);
Исследовать пространственную динамику роста фибринового сгустка при активации свертывания иммобилизованным тромбопластином и тканевым фактором фибробластов.
Научная новизна.
Разработан и оптимизирован метод получения активатора свертывания с иммобилизованным тромбопластином. При этом плотность и активность иммобилизованного тканевого фактора близки к соответствующим параметрам монослоя природных фибробластов. Для активации поверхности пластика на первой стадии иммобилизации белка был выбран метод формирования реакционно-способной пленки, на основе полиэтиленимина. Необходимые механические свойства пленки: прочность ее закрепления, эластичность, равномерное покрытие были достигнуты за счет добавления в раствор полиэтиленимина глутарового альдегида и альбумина. Кинетические характеристики иммобилизованного тромбопластина практически соответствуют аналогичным характеристикам нативного тканевого фактора фибробластов. Он стабилен при хранении (инактивируется с характерным временем 100 дней) и активирует свертывание in vitro аналогично тканевому фактору на фибробластах.
Практическая значимость работы.
Разработан метод иммобилизации тромбопластина, с помощью которого получена пластиковая поверхность с плотностью иммобилизованного тканевого фактора примерно равной плотности этого белка на наиболее активных в отношении активации свертывания клетках - фибробластах. Полученный активатор свертывания является новым средством, которое может быть эффективно использовано при исследовании гемостаза. Применение активатора свертывания в приборе по исследованию пространственной динамики роста фибринового сгустка, в качестве составной части нового клинического метода, имеет важное практическое значение в диагностике и лечении болезней, связанных с нарушением системы свертывания.
Положения, выносимые на защиту:
Разработан метод иммобилизации тромбопластина на пластиковую поверхность.
Максимальная плотность иммобилизованного тканевого фактора близка к плотности тканевого фактора на поверхности монослоя фибробластов;
Кинетика связывания иммобилизованного тканевого фактора с фактором Vila качественно совпадает с кинетикой связывания тканевого фактора на фибробластах;
Тромбопластин, иммобилизованный на пластиковой поверхности, активирует пространственный рост фибринового сгустка аналогично тканевому фактору на фибробластах;
Срок хранения активаторов с иммобилизованным тромбопластином для использования в методе пространственной динамики свертывания составляет не более 100 дней.
Апробация работы. Работа прошла апробацию 19 апреля 2010 г. на заседании проблемной комиссии № 1 "Биохимия, биофизика и реология крови" в Гематологическом научном центре РАМН.
Материалы диссертации были доложены на 1-ом Международном Форуме по Нанотехнологиям (Москва, декабрь 2008), на 5-ом Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, март 2009), на 13-ой Международной Пущине кой школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, сентябрь 2009), на 2-ом Международном Форуме по Нанотехнологиям (Москва, октябрь 2009), на всероссийском совещании «Биоматериалы в медицине» (Москва, декабрь 2009).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 тезисов в сборниках трудов 6 конференций и 1 статья в рецензируемом журнале.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 111 страницах печатного текста, состоит из введения, четырех глав (главы 1 — обзора литературы, главы 2 — описания материалов и методов исследования, главы 3 — описания результатов исследования и главы 4 — обсуждения результатов), выводов и библиографического указателя, включающего 135 источника. Работа выполнена на базе Гематологического научного центра РАМН в лаборатории новых методов препаратной трансфузиологии (заведующий лабораторией - кандидат биологических наук Смирнов И.В.) и в лаборатории физической биохимии системы крови (заведующий лабораторией - доктор биологических наук, профессор Атауллаханов Ф.И.).
