Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 17
1.1. Активные формы кислорода и пути их образования в организме 17
1.2. Повреждающее действие активных форм кислорода на молекулярные компоненты клетки 22
1.3. Биологическая роль активных форм кислорода 28
1.4. Антиоксидантная защита организма 38
1.5. Окислительный стресс как один из патогенетических механизмов дисфункции плаценты 45
1.6. Генетические факторы как одна из возможных причин усиления окислительного стресса при невынашивании беременности 59
1.7. Хемилюминесцентный анализ как быстрый метод регистрации процессов свободнорадикального окисления в акушерской
практике 60
Глава 2. Материал и методы 62
2.1. Получение постмитохондриальной фракции плаценты 63
2.1.1. Выделение митохондриальной фракции плаценты 64
2.1.2. Определение интенсивности процессов свободнорадикального окисления в ткани 64
2.1.3. Измерение интенсивности перекисной хемилюминесценции в сыворотке крови 65
2.1.4. Метод количественного определения диеновых конъюгатов 65
2.1.5. Опре деление вторичных продуктов ПОЛ, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (ТБК-тест) 66
2.1.6. Метод определения окислительной модификации белков по уровню карбонильных производных
2.1.7. Определение содержания миелопероксидазы иммуноферментным методом 67
2.1.8. Определение активности NO-синтазы 68
2.1.9 Определение активности пероксидаз 68
2.2. Определение общей антиоксидантной активности 69
2.2.1. Определение небелковых тиоловых групп с помощью реактива Эллмана 69
2.2.2. Определение активности каталазы
2.2.3. Метод определения активности супероксиддисмутазы 70
2.2.4. Определение активности глутатионпероксидазы 71
2.2.5. Определение активности глутатионредуктазы 72
2.2.6. Определение активности глутатион-8-трансферазы 72
2.2.7. Определение показателей эндогенной интоксикации 73
2.2.8. Определение белка 74
2.2.9. Выделение ДНК 74
2.3. Постановка полимеразной цепной реакции (ПЦР) 75
2.3.1. Электрофорез в полиакриламидном геле 76
2.3.2. Идентификация полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ-анализ) 76
2.3.3. Методы статистической обработки 77
Глава 3. Результаты собственных исследований 79
3.1 Структура невынашивания беременности в анамнезе женщин основной группы и группы сравнения 81
3.2. Изучение процессов свободнорадикального окисления и уровня антиоксидантной защиты в митохондриях плацент женщин основной группы и группы сравнения 86 Стр.
3.3. Оценка интенсивности процессов свободнорадикального окисления в постмитохондриальной фракции плацент женщин основной группы и группы сравнения 93
3.3.1. Механизм люминолзависимой хемилюминесценции в тканях плацент женщин основной группы и группы сравнения 97
3.3.2 Изучение миелопероксидазы постмитохондриальной фракции плацент у женщин основной группы и группы сравнения на протяжении беременности 102
3.3.3 Изучение NO-синтазной активности в постмитохондриальной фракции плацент женщин основной группы и группы сравнения на протяжении беременности 107
3.4. Изучение антиоксидантнои системы в постмитохондриальной фракции плацент женщин основной группы и группы сравнения 111
3.4.1. Активность глутатионзависимой системы антиокислительной защиты в постмитохондриальной фракции плацент женщин основной группы и группы сравнения на протяженииб еременности 113
3.4.2. Определение показателей эндогенной интоксикации в постмитохондриальной фракции плацент женщин основной группы и группы сравнения 119
3.4.3. Значение определения активности ферментов глутатионзависимого звена антиоксидантнои системы плаценты для прогноза риска прерывания беременности 123
3.5. Анализ показателей про- антиоксидантнои систем в плацентах женщин при преждевременных родах и беременности, осложненной гестозом, по сравнению с физиологическими показателями 128
3.6. Изучение полиморфизма генов глутатион-Б-трансфераз в плацентах женщин основной группы и группы сравнения 132 Стр.
3.6.1. Зависимость активности глутатион-8-трансферазы от вариантов генотипа по гену GST Рів плацентах женщин основной группы 139
3.6.2. Зависимость активности глутатионредуктазы и глутатионпероксидазы от вариантов генотипа по гену GST Р1 в плацентах женщин основной группы
3.7. Математические модели взаимосвязи активности ферментов глутатионзависимого звена антиоксидантнои защиты системы и вариантов генотипа по гену GST Р1 плаценты у женщин 146
3.8. Использование метода хемилюминометрии для оценки риска невынашивания при угрозе прерывания беременности поздних сроков 147
Глава 4. Обсуждение 155
Заключение 180
Выводы 184
Практические рекомендации 186
Список литературы
- Биологическая роль активных форм кислорода
- Определение интенсивности процессов свободнорадикального окисления в ткани
- Оценка интенсивности процессов свободнорадикального окисления в постмитохондриальной фракции плацент женщин основной группы и группы сравнения
- Определение показателей эндогенной интоксикации в постмитохондриальной фракции плацент женщин основной группы и группы сравнения
Введение к работе
Актуальность проблемы. Плацента представляет собой орган, который играет динамичную роль в процессах взаимодействия двух организмов – матери и плода. Высокий темп развития плаценты, растущие потребности плода сопровождаются особыми требованиями к метаболическим процессам, лежащим в основе функциональной деятельности плаценты. Исследование особенностей метаболических процессов в развивающейся при физиологической беременности плаценте дает представление о путях их координации в функциональной системе мать-плацента-плод. Один из таких фундаментальных механизмов биохимической адаптации, наблюдаемым в физиологических условиях и при акушерской патологии, обеспечивающим регуляцию метаболических процессов в плаценте, связан с системами генерации активных форм кислорода и функциональным состоянием многокомпонентной антиоксидантной защиты (М.В Федорова, 1986; R. F.Del Maestro, 1980; C.V. Smith1, 1992; A. Van der Vliet, A. Bast, 1992).
Физиологическая беременность характеризуется развитием окислительного стресса, являющегося одним из центральных механизмов общей системы адаптации к новым условиям организма женщины, при котором наблюдается сбалансированное состояние на более высоком уровне прооксидантной и антиоксидантной систем. При физиологически протекающей беременности состояние окислительного стресса возникает в период формирования артериальной циркуляции и увеличения напряжения кислорода в плаценте. Окислительный стресс выполняет в этой ситуации важные физиологические функции, участвуя в запуске механизмов дифференцировки клеток (Ю.Э. Доброхотова и соавт., 2008). В кратковременный период относительного дисбаланса между генерацией и элиминированием активных форм кислорода (АФК) происходит адаптация механизмов системы антиоксидантной защиты к нарушению физиологического равновесия. Неспособность системы антиоксидантной защиты (АОЗ) противостоять усилению процессов свободнорадикального окисления приводит к значительному ослаблению метаболической и детоксицирующей функций плаценты.
В последнее время постоянно растет количество работ, посвященных роли систем генерации активных форм кислорода и антиоксидантной системы в формировании метаболических и детоксицирующих функций плаценты (Т.Н. Погорелова и соавт.,1998, 1999; И.И. Крукиер, 2003; А.В. Шестопалов, 2002; А.В. Арутюнян и соавт., 2010). Наиболее полно представлены в литературе данные о соотношении антиоксидантной и прооксидантной систем в плаценте женщин, беременность которых осложнена гестозом (A.C. Staff et al.,1999; R. Madazli et al., 2002; K.A. Boggess et al., 2003; M.T. Raijmakers et al., 2004). Тем не менее, многие вопросы, связанные с развитием дисфункции плаценты в условиях окислительного стресса на протяжении беременности, еще весьма далеки от разрешения.
В литературе практически отсутствуют сведения о соотношении систем образования АФК и их элиминации на этапах беременности в разных участках плаценты (центральный и периферический) при акушерских и экстрагенитальных заболеваниях беременных. Центральная зона плаценты, по данным J.Hempstock et al. (2003), лучше оксигенирована, чем периферия, благодаря направлению потока материнской крови. Однако, по мнению авторов, центральные ворсины по сравнению с периферическими характеризуются большей морфологической незрелостью, что может свидетельствовать о функциональных особенностях и значимости центрального и периферического участков плаценты при ее дисфункции.
Антиоксидантную систему организма рассматривают как многокомпонентную систему, проявляющую специфическую и неспецифическую активность (Н.К.Зенков, 2001), а также как единую, интегрируемую и регулируемую структуру, находящуюся под генетическим контролем (В.В. Соколовский, 1988; Е.Е. Дубинина, 2006; E.M Berry, R. Kohen, 1999; X.L. Wang et al., 2001). Наиболее важным и эффективным звеном антиоксидантной защиты является система антиоксидантных ферментов: супероксиддисмутаза, каталаза, глутатионпероксидаза, глутатионредуктаза, глутатион-S-трансфераза.
Глутатионзависимое звено антиоксидантной системы осуществляет разрушение перекиси водорода, восстановление нестойких органических гидропероксидов в стабильные соединения – окси-кислоты, а также защищает клетки от продуктов перекисного окисления липидов посредством их восстановления. К этому звену относят глутатионпероксидазу (КФ 1.11.1.12), глутатионредуктазу (КФ 1.6.4.2), глутатион-S-трансферазу (КФ 2.5.1.18) и систему глутатиона. Глутатионзависимое звено антиоксидантной системы является частью системы ферментов детоксикации ксенобиотиков. Гены суперсемейства глутатион-S-трансфераз (М1, Т1 и Р1) контролируют синтез ферментов второй фазы детоксикации и характеризуются значительным популяционным полиморфизмом.
Сведений об активности глутатионзависимой антиоксидантной системы и вкладе генетической составляющей в изменение буферной емкости глутатионзависимого звена антиоксидантной системы в плаценте при невынашивании беременности малочисленны и неоднозначны. Оценок генетической вариабельности полиморфных локусов генов, вовлеченных в формирование глутатионзависимого звена АОС при самопроизвольном прерывании беременности, явно недостаточно (О.Н.Беспалова, 2001, 2009; А. Hirvonen et al., 1996).
Каскад нарушений метаболизма в плаценте при самопроизвольном преждевременном прерывании беременности может служить моделью для изучения универсальных механизмов, представляющих собой срыв адаптационно-гомеостатических реакций поддержания адекватного обмена между организмами матери и плода (Т.И. Погорелова и соавт., 1997; В.Е. Радзинский, П.Я.Смалько, 2001).
Целью исследования явилась комплексная оценка состояния про- и антиоксидантной систем плаценты при физиологической беременности и акушерской патологии, сопровождающейся дисфункцией плаценты, приводящей к невынашиванию беременности, для выявления значения генерации активных кислородных метаболитов и ферментативного звена антиоксидантной защиты в развитии плацентарной недостаточности.
Задачи исследования:
1. Провести сравнительную оценку интенсивности свободнорадикального окисления и ферментативного звена антиоксидантной защиты в митохондриях плаценты при физиологически протекающей беременности и невынашивании беременности.
2. Исследовать механизм генерации активных форм кислорода в постмитохондриальной фракции плаценты.
3. Провести сравнительную оценку интенсивности хемилюминесценции, содержания продуктов перекисного окисления липидов и окислительной модификации белков в постмитохондриальной фракции плаценты при физиологической беременности и невынашивании.
4. Исследовать активность NO-cинтазы и миелопероксидазы в центральной и периферической областях плаценты на протяжении физиологической беременности и при невынашивании.
5. Сопоставить величины общей антиокислительной активности, активности ферментативного звена антиоксидантной системы в центральной и периферической областях плаценты при физиологическом течении беременности и невынашивании.
6. Исследовать состояние глутатионзависимой антиоксидантной системы в центральной и периферической областях плаценты на протяжении физиологической беременности и при невынашивании.
7. Выявить частоту встречаемости функционально ослабленных сочетаний генов семейства GST (GST P1, GST M, GST T) в плаценте женщин при невынашивании и выяснить зависимость между вариантами генотипа GST P1 и уровнем активности ферментов глутатионзависимой антиоксидантной системы.
8. Выявить значение системных нарушений глутатионзависимого звена антиоксидантной защиты плаценты в патогенезе невынашивания беременности.
9. Оценить вклад прооксидантной и антиоксидантной систем плаценты в механизм патогенеза ее дисфункции, приводящего к акушерской патологии (невынашиванию беременности).
Научная новизна.
Установлены системные нарушения в функционировании антиоксидантной и прооксидантной систем плаценты при ее дисфункции.
Впервые проведено комплексное исследование состояния прооксидантной и антиоксидантной систем плаценты у женщин при физиологическом течении беременности и при невынашивании. Показано, что спонтанное преждевременное прерывание беременности происходит в условиях развития окислительного стресса в митохондриях и постмитохондриальной фракции периферийного участка плаценты, где на фоне повышения уровня интенсивности процессов пероксидации наблюдается недостаточное увеличение общей емкости антиоксидантной защиты и ослабление вне зависимости от локализации ее глутатионзависимого звена.
Впервые установлено, что возникновение люминолзависимой хемилюминесценции в плацентах женщин связано с участием одновременно двух механизмов: СОД-зависимого (присутствие О2 и ОН радикалов) и СОД-независимого (наличие гипохлоритного анион радикала). При самопроизвольном прерывании беременности отмечается существенное уменьшение реакций, протекающих по СОД-независимому механизму, связанное с ограничением вовлеченности гипохлоритного анионрадикала в процессы свободнорадикального окисления в плаценте.
Впервые выявлено изменение содержания миелопероксидазы, катализирующей реакцию образования гипохлорита, в плацентах при физиологически протекающей беременности и при невынашивании, возникшем на разных сроках беременности.
Показано, что снижение активности NO-синтазы в периферической части плацент женщин определяет снижение уровня защитно-приспособительных реакций, обеспечивающих течение беременности.
Проведено комплексное исследование глутатионзависиной антиоксидантной системы при физиологическом течении беременности и при невынашивании. Впервые на основании определения активности ферментов глутатионзависимого звена антиоксидантной защиты в плацентах и хорионах установлен индекс преждевременного прерывания беременности, абсолютное значение которого обратно пропорционально риску развития прерывания беременности.
Изучена встречаемость различных вариантов аллелей генов GST, кодирующих синтез глутатионзависимых ферментов в плацентах беременных женщин с самопроизвольным преждевременным прерыванием беременности, и впервые обнаружено, что невынашивание беременности связано с высокой частотой встречаемости функционально ослабленных сочетаний аллелей этих генов.
Впервые показано, что на уровень активности глутатионпероксидазы в плаценте оказывает влияние наличие аллеля В в гене GST Р1, а активность глутатион-S-трансферазы плаценты имеет прямую зависимость с наличием аллеля А и отсутствием аллеля С в гене GST Р1.
Научно-теоретическая и практическая значимость
Работа вносит существенный вклад в понимание патогенетических механизмов развития дисфункции плаценты и дает углубленное представление о роли про - и антиоксидантных систем в особенностях ее формирования при невынашивании беременности. Проведенные исследования позволяют оценить роль индивидуальных звеньев исследуемых систем в развитии дисфункции плаценты, сопровождающейся усилением окислительного стресса и спонтанным преждевременным прерыванием беременности разных сроков.
Представленная модель спонтанного преждевременного прерывания беременности позволяет оценить возможность исхода беременности от активности ферментов глутатионзависимого звена антиоксидантной защиты в центральной части плаценты: глутатионпероксидазы и глутатион-S-трансферазы.
Полученные данные о снижении емкости глутатионзависимого звена антиоксидантной защиты при невынашивании беременности являются основанием для научно обоснованной коррекции метаболических и функциональных нарушений плаценты, что позволит целенаправленно осуществлять профилактику осложнений у беременных.
Выявленные зависимости активности глутатионзависимых ферментов от вариантов генотипа по гену GST Р1 предполагают дифференцированный подход при назначении лечебных препаратов антиоксидантной терапии у женщин с угрозой прерывания беременности.
Впервые предложено использование быстрого, методически несложного метода хемилюминометрического анализа сыворотки крови для оценки эффективности лечения при угрозе прерывания беременности. Показана диагностическая возможность использования показателей хемилюминометрии в качестве дополнительных критериев для экспресс-диагностики дисфункции плаценты и контроля за эффективностью проводимого лечения при угрозе прерывания беременности.
Основные положения, выносимые на защиту
-
В митохондриях плаценты при самопроизвольном преждевременном прерывании беременности наблюдается развитие окислительного стресса, который сопровождается усилением интенсивности прооксидантной системы и ослаблением функционирования глутатионзависимого звена антиоксидантной защиты.
-
В постмитохондриальной фракции плаценты при неосложненном течении беременности и самопроизвольном досрочном ее прерывании наблюдается разная степень вовлеченности активных форм кислорода в процессы свободнорадикального окисления. При невынашивании беременности снижено участие гипохлоритного анионрадикала и оксида азота в процессах СРО в плаценте.
-
Интенсификация процессов липидной пероксидации в постмитохондриальной фракции периферического участка плаценты приводит к преждевременным родам.
-
Уровень миелопероксидазы и активности NO-синтазы в плаценте на протяжении беременности тесно связан с ослаблением защитной функции плаценты.
-
Развитие окислительного стресса в постмитохондриальной фракции плаценты при самопроизвольном преждевременном прерывании беременности связано с изменением уровня активности глутатионзависимого звена антиоксидантной защиты и нарушением сбалансированности про- и антиоксидантной систем.
-
Низкая активность глутатион-S-трансферазы в плаценте при невынашивании беременности обусловлена сочетанием функционально ослабленных аллелей генотипа GST P1.
Апробация работы и личный вклад автора. Основные положения работы доложены и обсуждены на следующих научных форумах:
Научной сессии НИИ АИГ им. Д.О.Отта «Актуальные вопросы физиологии и патологии репродуктивной функции женщин (Санкт-Петербург, 1993, 1994, 1999).
Первом Северо-кавказском съезде акушеров-гинекологов (Ростов, 1994).
Международной конференции «Clinical Chemiluminescence» (Берлин, 1994).
5-th Annual mitting of the oxygen society (Сан-Франциско, 1994).
7-ом конгрессе «Акушерство и гинекология» стран Балтийского моря (Санкт-Петербург, 1999).
Российском форуме «Мать и дитя» (Москва, 2000; Казань,2007, Москва, 2010).
Конференции с международным участием «Свободные радикалы, антиоксиданты и болезни человека» (Смоленск, 2001, 2003).
Научно-практической конференции «Невынашивание беременности и недоношенный ребенок» (Петрозаводск, 2002).
Третьем съезде Биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002).
Международном экологическом форуме «Environment and human health» (Санкт-Петербург,2003).
Конференции «Механизмы типовых патологических процессов» (Санкт-Петербург, 2003, 2006).
Клинические наблюдения проводились в отделении патологии беременности НИИАГ им. Д.О. Отта СЗО РАМН (руководитель – проф., д.м.н. О.Н. Аржанова). Генетические исследования проводили в лаборатории пренатальной диагностики наследственных болезней НИИАГ им. Д.О. Отта СЗО РАМН с участием автора (руководитель – член-кор. РАМН, проф. д.м.н. В.С. Баранов). Биохимические исследования были выполнены автором лично в лаборатории биохимии с клинико-диагностическим отделением НИИАГ им. Д.О. Отта СЗО РАМН (руководитель – проф., д.б.н. А.В. Арутюнян). Определение миелопероксидазы проводилось самостоятельно на базе лаборатории общей патологии НИИ экспериментальной медицины СЗО РАМН (руководитель – проф., д.б.н. В.Н. Кокряков). Обработка, анализ и интерпретация полученных данных выполнены автором лично.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 40 работ, в том числе 15 статей - в изданиях, включенных в перечень ВАК Минобрнауки РФ.
Объем и структура диссертации. Текст диссертации изложен на 229 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 422 источника, в том числе 134 отечественных и 288 зарубежных. Работа иллюстрирована 24 таблицами и 30 рисунками.
Биологическая роль активных форм кислорода
Как известно, основной путь 4-х электронного восстановления молекулярного кислорода до воды у аэробных организмов осуществляется при окислении органических субстратов в цепях переноса электронов. Наряду с этим во всех живых организмах постоянно протекают реакции с образованием активных форм кислорода (АФК). К активным формам кислорода относят свободные радикалы (О2", НОг, ОН , NO", ROO и другие) и молекулы, способные легко продуцировать свободные радикалы (синглетный кислород, озон, перекись водорода, гипохлорит). Одной из причин появления АФК является неполное восстановление молекулярного кислорода в митохондриях (схема 1) [61]. Эта реакция является побочной при окислительном фосфорилировании, ее интенсивность зависит от режима функционирования митохондрий: соотношений между количеством кислорода, дыхательных субстратов и аденилатфосфатов.
На образование АФК расходуетсяется 2-5 % потребляемого аэробными организмами кислорода [100], однако реальная концентрация АФК в тканях составляет 10" М [63]. Наибольший вклад в образование АФК в клетке вносит дыхательная цепь митохондрий. В последнее время получено значительное количество данных, указывающих на то, что уровень постоянно генерируемых митохондриями супероксида и перекиси водорода составляет 1 - 2% от общего потребления кислорода дыхательной цепью митохондрий [272, 320, 402]. Образование АФК происходит при участии НАДН-дегидрогеназы [401], флавопротеина, убихинона и цитохрома С [332]. В нормально функционирующей дыхательной цепи электроны переносятся от НАДН к окисленной форме убихинона с образованием восстановленной формы убихинона. Восстановленная форма убихинона затем передает электроны на цитохром с оксидазу и вновь превращается в окисленную форму убихинона, проходя через форму аниона свободного радикала - семихинона (UQ") [91]. Анализ действия на макрофаги специфических ингибиторов электрон-транспортной цепи митохондрий показал, что ротенон и антимицин А снижали образование 02" [348]. Ответственным за наработку АФК в митохондриях является коэнзим Q, -компонент НАДН-: убихинон-оксидоредуктазного и сукцинат: убихинон-оксидоредуктазного комплексов [24, 298, 299]. KoQH2 + 02 - KoQH + Н+ + 02 KoQH + 02 - KoQ + Н+ + 02"
Монооксигеназы микросом клеток также как и электронотранспортная цепь митохондрий являются компонентами генерирования АФК. Около 75% поглощаемого в микросомах кислорода переходят в 02 " в результате одноэлектронного переноса [69, 77, 80]. Образование супероксидного анион-радикала в микросомах происходит в результате функционирования цитохром Р-450 - содержащей монооксигеназной системы и связано с распадом тройного комплекса «окисленный цитохром Р-450 / субстрат / 0 2. При определенных условиях в процессе распада комплекса возможна утечка 02. [8, 9, 85].
Важной составляющей в системе генерирования АФК является ксантиноксидаза (КФ 1.2.3.22), которая находится в организме преимущественно в ксантиндегидрогеназной форме (КФ 1.1.1.204) и может переходить в оксидазную форму в результате окисления дисульфидных связей или ограниченного протеолиза [380]. Основная физиологическая функция фермента связана с участием в катаболизме пуринов. При этом ксантиндегидрогеназная форма использует в качестве акцептора электронов НАД +. В оксидазной форме фермент в качестве акцептора электронов использует молекулярный кислород, в результате этой реакции наблюдается образование перекиси водорода и супероксидного радикала. Наблюдаемое в ходе ксантиноксидазной реакции образование гидроксильного радикала сопряжено с восстановлением перекиси водорода [275]. Существенная роль в продукции супероксидного анион радикала принадлежит мембраносвязанной НАДФН-оксидазе, функционирующей при состояниях «дыхательного взрыва» в фагоцитирующих клетках [145, 204], и НАДФН-оксидазе нефагоцитирующих клеток [51, 202, 217]. НАДФН-оксидаза представляет собой сложную мультикомпонентную систему, состоящую из мембрансвязанных и цитозольных компонентов. Мембраносвязанный цитохром Ь558 состоит из двух субъединиц а и /? с молекулярными массами 22 кДа (p22phox) и 91 к Да (p91phox). По своей структуре а - субъединица является гемсодержащим белком, а /3 субъединица - ФАД-содержащим белком [216,232]. Для функционирования НАДФН - оксидазы необходимо наличие двух цитозольных компонентов с молекулярными массами 47 (p47phox) и 67 кДа (p67phox), которые в состоянии покоя находятся в цитоплазме в виде комплекса с цитоплазматическим компонентом с молекулярной массой 40 кДа (p40phox) [224]. Дисфункция любого из выше перечисленных компонентов приводит к потере способности НАДФН-оксидазы генерировать Ог". В активации НАДФН-оксидазного комплекса принимают участие цитозольные белки из семейства малых ГТФ-связывающих белков р21гас и p21rac 2 [137, 157, 190]. При стимуляции фагоцитов происходит быстрая самосборка из мембранных и цитозольных компонентов НАДФН 20 оксидазного комплекса, который осуществляет перенос электрона с цитозольного НАДФН на 02 с образованием 02" [12].
У нейтрофилов в регуляции активности НАДФН - оксидазного комплекса принимает участие арахидоновая кислота, которая образует комплекс с цитохромом Ь558, увеличивая его сродство к кислороду [263].
Действие НАДФН-оксидаз в нефагоцитирующих клетках (фибробласты, лимфоциты, тромбоциты, эндотелиальные клетки, гладкомышечные клетки артерий) функционально идентично действию НАДФН-оксидазы фагоцитов, однако процесс протекает с незначительной скоростью и образование 02 " происходит в небольшом количестве [139, 235, 240, 257, 362, 389, 394].
Образование наиболее реакционного и токсичного гидроксильного радикала ОН в биологических системах связано преимущественно с металл-зависимым распадом перекиси водорода и, главным образом, с ионами железа и меди [100, 205, 218]. Ме" + Н202 -+ Men+1 + ОН + ОН В нормальных условиях концентрации свободных, каталитически активных ионов металлов низки [218], большая часть из них находится в связанном состоянии в виде комплексных соединений с низко- и высокомолекулярными соединениями (гемоглобин, миоглобин, цитохромы, трансферрин, ферритин, лактоферин и другие). Данные об участии высокомолекулярных соединений в образовании гидроксильного радикала противоречивы, однако часть исследователей считает, что при низких значениях рН (рН 5) [223], при связывании насыщенного железом белка с неспецифическими поверхностями, например, с фагоцитами [86], этот процесс возможен.
Определение интенсивности процессов свободнорадикального окисления в ткани
Более того, в процессе эволюции произошло разведение этих путей метаболизма как в пространстве, так и во времени. В организме человека только в гранулоцитах содержится одновременно две ферментативные системы синтеза АФК: НАДФ-оксидаза и МПО, в силу чего гранулоциты называют «клетки-камикадзе». Моноциты содержат малое количество МПО, от которой они избавляются в процессе трансформации в макрофаги. Помимо этого, развитие дыхательного «взрыва» в фагоцитах при активации НАДФ-оксидазы является быстрым процессом (от 10 минут до 2 часов), тогда как NO - синтетаза индуцибельный фермент и его активность возрастает после лаг-фазы (несколько часов). Также следует иметь в виду, что включение основных механизмов синтеза АФК находится под сложным клеточным контролем. Максимальная продукция радикалов, например, NO - синтазой и НАДФ-оксидазой наблюдается только при воздействии нескольких стимулов. Многоуровневая система активации и пространственно-временное разнесение, как полагают, связано с тем, что деструктивный эффект АФК в первую очередь должен проявляться в отношении чужеродных микроорганизмов и не затрагивать клетки и ткани собственного организма [45].
АФК играют существенную роль в синтезе эйкозаноидов - сигнальных молекул, которые образуются во всех клетках организма (за исключением эритроцитов) и обладают локальным эффектом. К эйкозаноидам относят классические простагландины, простациклины, тромбоксаны, лейкотриены и т.д. Предшественником эйкозаноидов является арахидоновая кислота, входящая в состав фосфолипидов плазматических мембран. Биосинтез эйкозаноидов начинается с окисления арахидоновой кислоты с последующей циклизацией и образованием эндоперекисей. На этом этапе синтеза эйкозаноидов происходит генерация АФК [198, 323]. Эндоперекиси под действием простагландинсинтетазы превращаются в простагландины, простациклины и тромбоксаны. Второй путь биосинтеза эйкозаноидов связан с участием липоксигеназы. В этом случае все полиненасыщенные жирные кислоты окисляются с образованием гидроперокси- и гидроксипроизводных жирных кислот, из которых в дальнейшем за счет реакций дегидратации и различных реакций переноса образуются лейкотриены. Биологическое действие эйкозаноидов многообразно. Они контролируют сокращение гладкомышечных тканей сосудов, бронхов, матки, принимают участие в высвобождении продуктов внутриклеточного синтеза (гормонов, мукоидов), влияют на процессы овуляции, продвижение яйцеклетки и подвижность сперматозоидов, на метаболизм костной ткани, периферическую нервную систему, иммунную систему, передвижение и агрегацию лейкоцитов и тромбоцитов [55]. Простагландины необходимы для нормальной родовой деятельности: слабую родовую активность и перенашивание беременности связывают с недостатком простагландинов, а их повышенное образование может стать причиной самопроизвольных абортов и преждевременных родов [78].
Роль АФК в регуляции физико-химического состояния мембран клетки подробно изучается под руководством академика РАМН Ю.А.Владимирова [25, 27]. Биологические мембраны выполняют в клетке две основные функции: барьерную и матричную. В нормально функционирующей клетке срединная часть липидного слоя представляет собой сплошную пленку, образованную углеводородными хвостами фосфолипидных молекул. Эта пленка практически непроницаема для ионов и молекул водорастворимых веществ, таких, как углеводы, аминокислоты, белки, нуклеотиды и нуклеиновые кислоты. Повреждение этого барьера приводит к нарушению регуляции внутриклеточных процессов и расстройствам клеточных функций. Наряду с этим липидный слой мембран формирует в клетке особую жидкую фазу и играет роль структурной основы и матрицы для всех белковых, липопротеидных, гликопротеидных и гликолипидных компонентов мембран. От свойств липидной фазы мембран, таких, как вязкость, поверхностный заряд, полярность, зависит работа мембранных ферментов и рецепторов. Изучение воздействия разного рода повреждающих агентов на изолированные клетки (эритроциты), митохондрии, липосомы, плоские бислойные липидные мембраны и другие модельные объекты показало, что нарушение барьерных свойств липидного слоя мембран связано с усилением процессов пероксидации липидов. Одним из следствий ПОЛ является окисление тиоловых групп мембранных белков. Окисление тиоловых групп приводит к появлению дефектов в мембранах клеток и митохондрий. Под действием разности электрических потенциалов на мембранах через образовавшиеся поры в клетки входят ионы натрия, а в митохондрии - ионы калия. В результате происходит увеличение осмотического давления внутри клеток и митохондрий и их набухание. Кроме того происходит инактивация ион-транспортных ферментов, например Са - АТФаз, в активный центр 9-4 которых входят тиоловые группы. Инактивация Са - АТФазы приводит к торможению выхода ионов кальция из клетки и одновременно к ускорению входа кальция в клетку, что приводит к увеличению внутриклеточной концентрации Са2+ и повреждению клетки. Более того, продукты ПОЛ обладают способностью непосредственно увеличивать проницаемость липидной фазы мембран для ионов НҐ, ОН- и Са2+. Наиболее существенным результатом ПОЛ, по мнению Ю.А Владимирова., является снижение электрической прочности мембран и электрический пробой мембраны за счет создаваемой ею разности электрических потенциалов.
Таким образом, генерация АФК в клетке является важным и необходимым биологическим процессом. Однако следует отметить, что роль АФК в механизмах регуляции различных функций клеток в физиологических условиях, несмотря на обширные экспериментальные данные, неоднозначна, противоречива и еще далека от разрешения.
Оценка интенсивности процессов свободнорадикального окисления в постмитохондриальной фракции плацент женщин основной группы и группы сравнения
Как известно, люминолзависимая хемилюминесценция (Л-ХЛ) связана с образованием супероксидного и гидроксильного и/или гипохлоритного радикалов [29, 30]. Для того, чтобы выяснить вклад различных радикалов в возникновение Л-ХЛ в тканях плацент женщин при физиологически протекающей беременности, завершившейся родами в срок (Ш-я подгруппа сравнения) и при преждевременных родах в сроки 28-36 недель (Ш-я основная подгруппа) было изучено влияние на интенсивность Л-ХЛ специфических ловушек АФК: азида натрия, метионина и супероксиддисмутазы, которая специфически подавляет Л-ХЛ, связанную с присутствием 0{ и ОН радикалов (СОД-зависимый механизм). Об участии в развитии Л-ХЛ гипохлорита - продукта окисления хлорида под влиянием миелопероксидазы при взаимодействии с перекисью водорода, свидетельствует факт тушения ХЛ азидом натрия, который ингибирует активность этого фермента в лейкоцитах [222] и перитонеальных макрофагах [208]. Однако, учитывая способность азида натрия подавлять другие ферменты, участвующие в окислительных процессах в тканевых экстрактах, мы изучали действие на интенсивность ХЛ метионина, обладающего исключительно высокой специфичностью и являющегося перехватчиком гипохлоритного анионрадикала [66] (СОД - независимый механизм). Интенсивность Л-ХЛ в постмитохондриальной фракции плаценты, в присутствии специфических ловушек АФК мы оценивали по интегральному показателю - светосумме вспышки в течение 2-х минут. Ингибирующий эффект специфических ловушек АФК рассчитывали по формуле:
Влияние тушителей на люминолзависимую хемилюминесценцию в постмитохондриальной фракции плацент женщин Ш-ей основной подгруппы и Ш-ей подгруппы сравнения Подгруппы женщин Участок плаценты Ингибирующий эффект на Л-ХЛ, % СОД (250 мкг/мл) Азид натрия (0.025 мМ) Метионин (0,4 мкМ) Ш-я основная п=8 центр 52.5±4.5 15.6±1.9 31.6±4.9 периферия 53.7±6.3 28.0±1.8 33.6±3.2 Ш-я сравнения п=8 центр 49.4±4.6 59.5±8.2 50.2 ±3.4 периферия 69.6±8.1 58.4±7.2 54.0±8.0 Примечание: р 0.05, р 0.001 даны по сравнению с соответствующим показателем Ш-ей подгруппы сравнения.
Как видно из табл. 8, добавление исследуемых соединений к постмитохондриальной фракции плаценты привело к снижению уровня интенсивности Л-ХЛ. Так введение в пробу СОД практически одинаково ингибировало интенсивность Л-ХЛ как в центральной, так и периферической частях плацент женщин обследованных групп. Введение азида натрия ингибировало интенсивность в Л-ХЛ в центре и по периферии плацент женщин Ш-ей подгруппы сравнения практически на 60%. У женщин, беременность которых окончилась преждевременными родами (Ш-я основная подгруппа), азид натрия ингибировал интенсивность ХЛ на 44 % ( р 0.001) в центральной части плаценты и на 30% ( р 0.001) в периферическом участке слабее, чем в плацентах беременных Ш-ей подгруппы сравнения. Введение метионина одинаково ингибировало интенсивность Л-ХЛ по центру и по периферии плаценты у женщин Ш-ей подгруппы сравнения. В Ш-ей основной подгруппе мы наблюдали равнозначное ослабление ингибирующего эффекта метионина на Л-ХЛ плацент по центру и периферии - на 20%. Ослабление ингибирующего действия азида и метионина на Л-ХЛ в плацентах женщин с преждевременным прерыванием беременности указывало на снижение вклада гипохлоритного анион-радикала в процессы СРО в цитоплазматической фракции плацент.
Таким образом, полученные результаты дают основание говорить об участии одновременно двух механизмов возникновения Л-ХЛ в постмитохондриальной фракции плацент: СОД-зависимого, характеризующегося присутствием в среде радикалов Ог и ОН , и СОД-независимого, когда свечение возникает в присутствии радикалов СЮ . Причем относительный вклад последнего механизма в возникновение Л-ХЛ был существенно ниже в плацентах женщин Ш-ей основной подгруппы, чем таковой в плацентах женщин Ш-ей подгруппы сравнения.
Для более полного представления о вкладе различных радикалов в процессы СРО, определяемые с помощью ХЛ анализа, мы исследовали интенсивность Л-ХЛ в плацентах женщин обследованных групп в присутствии низкомолекулярных соединений, которые являются перехватчиками радикалов. Эти соединения отличаются между собой по структуре и эффективности инактивации свободных радикалов. Одним из них является аскорбиновая кислота, которая характеризуется широким спектром инактивирующего действия на различные свободные радикалы и эффективно ингибирует инициацию ПОЛ, преимущественно связаную с образованием НОг и ОН радикалов [83]. Важная роль в инактивации АФК принадлежит глутатиону и цистеину - соединениям, содержащим SH-группы, которые играют ведущую роль в перехвате ОН радикалов. Таурин инактивирует гипохлоритный анионрадикал с образованием аминосоединений [35]. Еще одним соединением с антирадикальными свойствами является мочевая кислота, которая эффективно взаимодействует с ОН-радикалами, Ог", ONOO", связывает ионы переменной валентности и может выступать синергистом с радикалами аскорбиновой кислоты, усиливая ее антиоксидантное действие [45]. Никотинамиддинуклеотид восстановленный (НАДН) представлял для нас интерес в качестве кофактора ферментативных систем окислительно-восстановительных реакций клетки. Результаты изучения ингибирующего эффекта низкомолекулярных соединений на уровень интенсивности Л-ХЛ в плаценте женщин основной группы и группы сравнения представлены в таблице 9.
Как следует из таблицы 9, исследуемые соединения тушили Л-ХЛ постмитохондриальной фракции плацент женщин обеих групп. Степень ингибирования интенсивности хемилюминесценции зависела от концентрации соединений. Эффективность исследуемых веществ варьировала в пределах нескольких порядков. Ингибирующую активность исследуемые соединения проявили следующим образом: наибольшим эффектом обладала мочевая кислота, величина 15о которой составлял 0.028±0.009 нмоль/мл и 0.071±0.01 нмоль/мл в плацентах женщин основной подгруппы и подгруппы сравнения соответственно.
Определение показателей эндогенной интоксикации в постмитохондриальной фракции плацент женщин основной группы и группы сравнения
Формирование функциональной недостаточности плаценты, являясь универсальной реакцией на воздействие неблагоприятных факторов, представляет собой срыв адаптационно-гомеостатических процессов в ней и характеризуется различной степенью выраженности [16, 95].
Дисфункция плаценты может возникать на разных сроках беременности. В механизме нарушений функции развивающейся плаценты играют роль генетические факторы, нарушения процессов имплантации и плацентации, нарушения в гемодинамической системе, обеспечивающей потребности плода в питательных веществах и кислороде, заболевания матери, изменение факторов окружающей среды и т.д. [22, 73] .
Функциональная недостаточность плаценты, сопровождая все акушерские и экстрагенитальные осложнения, нередко приводит к невынашиванию беременности и неблагоприятным перинатальным исходам. Хроническая гипоксия и/или гипотрофия плода является одной из основных причин перинатальной заболеваемости и смертности.
Как известно, плод развивается в условиях относительной гипоксии по сравнению с существованием организма во внешней среде. Толерантность плода к гипоксии обеспечивается за счет таких адаптационно-приспособительных механизмов как высокая частота сердцебиения плода, высокая скорость перфузии крови через жизненно важные органы (сердце, мозг), высокое сродство фетального гемоглобина к кислороду и регуляция сопротивления сосудов плодово-плацентарного кровотока, прежде всего пуповины. В свою очередь резистентность артерий пуповины отражает сопротивление плацентарных сосудов. Поэтому сопротивление кровотоку, которое принято измерять при доплерометрии, косвенно отражает состояние плацентарного кровообращения.
Снабжение плаценты кислородом на протяжении беременности происходит за счет материнской крови по градиенту парциального давления кислорода в организмах матери и плода. Поскольку внутриматочное давление кислорода до 8 недель беременности низкое и не превышает 20 мм рт.ст.( 5% Ог), то плацента и плод пребывают в условиях слабого снабжения кислородом [82]. С увеличением срока беременности происходит улучшение снабжения кислородом плода и плаценты за счет истончения плацентарной мембраны. Для морфофункционального состояния плаценты большое значение имеют компесаторно-приспособительные реакции, возникающие в ответ на внутриутробную гипоксию и нарушения маточно-плацентарного кровотока, с учетом горизонтального гетероморфизма (центральная и периферическая зоны).
При физиологически протекающей беременности увеличение содержания кислорода в плаценте сопряжено с кратковременным подъемом генерации АФК и развитием окислительного стресса, что способствует быстрой адаптации к изменившимся условиям в ней систем АОЗ [133].
АФК выполняют важные физиологические функции в процессах развития плаценты, запуская механизмы дифференцировки клеток [16, 42, 379]. Так, повышенние концентрации кислорода в плаценте приводит к изменению фенотипа клеток цитотрофобласта от пролиферативного к инвазивному, что, в свою очередь, стимулирует миграцию вневорсинчатого трофобласта в эндометрий, где он играет ключевую роль в конверсии спиральных артерий [210, 392]. Нарушение этого процесса происходит у женщин при беременности, осложненной гестозом, и сопровождается ослаблением перфузии межворсинчатого пространства плаценты. Снижение перфузии межворсинчатого пространства приводит к циркуляторно-гипоксическим изменениям в плаценте и формированию синдрома ишемии-реперфузии. В результате этого развивается ацидоз, вызывающий внутриклеточное повышение концентрации ионов кальция и повреждение митохондрий, что приводит к повышенной продукции АФК, обуславливающей развитие окислительного стресса [11].
Изменения показателей, характеризующих окислительный стресс в тканях плаценты на протяжении беременности, имеют не только фундаментальное значение, позволяя выявить основные метаболические процессы, приводящие к дисфункции плаценты, но и представляют интерес для практического акушерства, обеспечивая правильный прогноз наступления неблагополучных перинатальных исходов и выбор оптимальных сроков родоразрешения.
В отечественной литературе отсутствуют исследования, посвященные изучению систем генерации АФК и их элимининации в различных частях плаценты, обладающих особенностями компенсаторно-приспособительных реакций на протяжении беременности, как при физиологических условиях, так и при акушерской патологии.
Одним из основных мест образования АФК является электронно транспортная цепь митохондрий [83]. «Электронная утечка», стимулирующая генерацию АФК, рассматривается в качестве одного из факторов, способных усиливать внутриклеточный окислительный стресс. Исследования последних лет прояснили многие детали механизмов генерации АФК в митохондриях (рис. 28). Однако сведения о вкладе данного механизма в генерацию общего пула АФК в плаценте отсутствуют [4, 16]. Неясна также роль электронно-транспортной системы митохондрий на ранних этапах беременности. Однако известно, что с увеличением срока гестации количество митохондрий в плаценте возрастает, что может привести, как предполагают некоторые авторы, к увеличению вклада электронно транспортной цепи митохондрий плаценты в процессы генерации АФК [307]. Считают, что увеличение количества митохондрий в плаценте может быть и компенсаторной реакцией. Так S. Matsubara и соавторы [180] показали, что активность митохондриальнои цитохром с оксидазы значительно уменьшается в трофобластах при преэклампсии.
