Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Особенности строения и состава костной ткани 9
1.2. Биохимические механизмы минерализации костей 16
1.3. Регуляция минерализации костной ткани витаминами и гормонами 20
1.4. Механизм перестройки костной ткани при трансплантации и факторы, влияющие на этот процесс 22
1.5. Биохимические изменения в костных трансплантатах в различные сроки после их пересадки 30
ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Техника взятия костных трансплантатов и проведение операции их пересадки. Рентгенологические и морфологические исследования. 41
2.2. Методы биохимических исследований
2.2.1. Определение содержания глюкозы 44
2.2.2. Определение содержания гликогена 45
2.2.3. Определение содержания адениловых нуклеотидов 46
2.2.4. Определение содержания креатинфосфата, неорганического фосфата и молочной кислоты 48
2.2.5. Определение активности амилазы 49
2.2.6. Определение активности фосфорилазы 50
2.2.7. Определение активности гексокиназы 51
2.3. Статистическая обработка результатов исследований 51
ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Изменения в трансплантате губчатой кости в динамике после пересадки 53
3.1.1 Рентгенологические изменения в трансплантате губчатой кости 53
3.1.2. Морфологические изменения в трансплантате губчатой кости 55
3.1.3. Биохимические показатели в трансплантате из губчатой костной ткани в различные сроки после пересадки 57
3.1.3.1. Изменения содержания гликогена в трансплантате из губчатой кости 51
3.1.3.2. Изменения содержания глюкозы в трансплантате из губчатой кости 60
3.1.3.3. Исследование активности фосфорилазы в костных трансплантатах 62
3.1.3.4. Исследование активности амилазы в трансплантате губчатой кости 65
3.1.3.5. Изменения активности гексокиназы в трансплантате губчатой кости 68
3.1.3.6. Определение содержания лактата в губчатом костном трансплантате в норме и динамике после трансплантации 71
3.1.3.7. Изменения содержания нуклеотидов и креатинфосфата в трансплантате губчатой кости в динамике после пересадки 73
3.1.3.8. Изменения содержание неорганического фосфата в губчатом костном трансплантате в динамике после трансплантации 77
3.2. Изменения в трансплантате компактной костной ткани в динамике после пересадки 79
3.2.1. Рентгенологические изменения в трансплантате компактной кости 80
3.2.2. Морфологические изменения в трансплантате компактной кости 80
3.2.3. Изменения биохимических показателей в трансплантате компактной костной ткани в динамике после операции пересадки 82
3.2.3.1. Изменения содержания гликогена и активности амилазы 82
3.2.3.2. Изменения содержания глюкозы и активности гексокиназы 87
3.2.3.3. Изменения содержания молочной кислоты 90
3.2.3.4. Изменения содержания креатинфосфата 91
3.2.3.5. Изменения содержания неорганического фосфата в динамике после пересадки 93
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 95
ВЫВОДЫ 101
ЛИТЕРАТУРА ЮЗ
- Особенности строения и состава костной ткани
- Техника взятия костных трансплантатов и проведение операции их пересадки. Рентгенологические и морфологические исследования.
- Рентгенологические изменения в трансплантате губчатой кости
Введение к работе
Актуальность проблемы. Выяснение биохимических механизмов резистентности организма к критическим состояниям представляет собой важную медико-биологическую проблему. К таким состояниям, в частности, относится и трансплантация органов и тканей, которая является актуальной проблемой современной биологии и медицины (Касавина и др., 1992; Ильин, 1994; Петров, 2006; Komerik et al., 2005; Ioannidou, 2006). Остается дискуссионным и вопрос о способности костных трансплантатов стимулировать репаративные процессы, что имеет важнейшее значение для прогнозирования, а также разработки эффективных мер устранения различных дефектов, в том числе часто встречающихся дефектов нижней челюсти (Радкевич и др., 2001; Кузнецова, 2004; Kudoetal, 1996; Leroukel et al., 2004). Следует отметить, что о состоянии трансплантатов при замещении дефектов нижней челюсти в основном судили путем клинических наблюдений, рентгенологических и морфологических исследований репаративных процессов костной ткани (Плотников, 1986; Bloometdi, 1995; Joshi, 2004). Что же касается метаболизма в самом трансплантате, биохимических превращений, лежащих в основе морфологических и функциональных процессов, протекающих в пересаженной костной ткани, то эти вопросы до настоящего времени исследованы недостаточно. Вместе с тем, состояние обмена самого трансплантата, его энергетические ресурсы и ферментные системы, во многом определяющие его жизнеспособность и обеспечивающие сложный процесс приживления и перестройки пересаженной кости, сказываются на конечном результате трансплантации и позволяют судить об ее эффективности (Лаврищева и др., 1992; Ткачук и др., 2002; Lansi et al., 2005).
Знание ключевых биохимических реакций, обеспечивающих протекание в костной ткани нормальных физиологических процессов, дает значительные преимущества при оценке жизнеспособности трансплантатов. Они позволяют в полной мере охарактеризовать степень приживления или гибели и вскрыть механизмы перестройки трансплантата (Петрович и др., 1994; Ермакова и др., 2004; Prats et al., 2005).
Углеводно-энергетический обмен занимает центральное место в клеточном метаболизме живого организма. Любой биосинтетический и катаболический процесс сопровождается, соответственно, затратой и выработкой энергии. Гликоген и глюкоза являются одними из основных источников энергии, необходимых тканям для осуществления их жизненных функций. При их аэробном и анаэробном превращении образуются макроэргические соединения, обеспечивающие энергетические и пластические потребности клетки (Северин, 2003; Rake et al., 2006). Поэтому весьма важно изучение динамики содержания гликогена и глюкозы, активности ферментов их превращений в регенерирующих тканях в условиях трансплантации. Интерес к этой проблеме еще более усиливается при трансплантации костной ткани, так как при этом нарушается углеводный обмен, создаются неблагоприятные условия для использования и утилизации гликогена и глюкозы, как для энергетических, так и пластических целей (Строев, 2002; Пронченко и др., 2005; Koike et al., 2005).
Исходя из изложенного, изучение ключевых показателей углеводного обмена в сочетании с важнейшими макроэргическими фосфатами (АТФ, креатинфосфат) представляется весьма актуальным при трансплантации костной ткани. Вместе с тем, в доступной литературе мы не обнаружили работ, посвященных комплексному исследованию изученных показателей углеводно-энергетического обмена в различных по виду костных трансплантатах.
Цель исследования. Изучить особенности биохимических механизмов жизнеобеспечения репаративной регенерации в различные сроки после трансплантации костной ткани на основе анализа комплекса показателей углеводно-энергетического обмена.
7 Задачи исследования.
1. Определить содержание гликогена, глюкозы, креатинфосфата, АТФ, АДФ, АМФ, неорганического фосфата, молочной кислоты в динамике после трансплантации губчатой костной ткани.
Изучить активность ключевых ферментов обмена углеводов (амилазы, фосфорилазы, гексокиназы) в динамике после трансплантации губчатой костной ткани.
При модельных условиях эксперимента исследовать комплекс показателей углеводно-энергетического метаболизма в различные сроки после трансплантации компактной костной ткани.
Основные положения, выносимые на защиту:
Процесс перестройки костных трансплантатов приводит к значительным изменениям исследуемых биохимических показателей в зависимости от вида пересаженной кости (губчатая или компактная). При этом нарушения в трансплантате из компактной кости наиболее резко выражены.
В костных трансплантатах независимо от их вида в течение первого месяца повышается содержание глюкозы и гликогена; резко снижается активность пусковых ферментов их превращений - гексокиназы и амилазы. В отличие от компактной, в губчатой кости к 60 суткам содержание гликогена и глюкозы, а также активность исследуемых ферментов нормализуются и достигают контрольных величин.
3. В тканях трансплантатов из губчатой и компактной костной ткани происходит существенное снижение количества креатинфосфата, неорганического фосфата, молочной кислоты, причем оно наиболее резко выражено спустя 30 суток после операции пересадки.
Научная новизна. В работе впервые изучены особенности углеводно-энергетического метаболизма, происходящие в различных по характеру и виду костных трансплантатах при замещении дефектов нижней челюсти.
Получены новые данные о содержании гликогена, глюкозы, креатинфосфата, неорганического фосфата, молочной кислоты в интактной кости и при трансплантации губчатой и компактной костной ткани в
8 различные сроки после пересадки, имеющие существенное значение для определения жизнеобеспечения репаративных процессов в пересаженной костной ткани.
Обнаружены специфические особенности изменения активности гексокиназы и амилазы в компактной и губчатой костной ткани животных в процессе трансплантации.
Теоретическая и практическая значимость. Полученные данные расширяют наши представления о биохимии трансплантологии. Разработан и обоснован комплекс биохимических показателей, который может быть использован как эффективный тест-критерий состояния энергетических систем жизнеобеспечения костных трансплантатов и оценки жизнеспособности пересаженной костной ткани в динамике трансплантации.
Впервые изучены и установлены параллели между биохимическими показателями и рентгенологическими и морфологическими изменениями в эксперименте, свидетельствующие о том, что исход трансплантации зависит от вида и характера трансплантата. Полученные в диссертации результаты используются в учебном процессе Дагестанской медицинской академии при чтении лекций по клинической биохимии.
Результаты работы вошли в учебное пособие Э.Р. Нагиева «Биохимия тканей полости рта» (утверждено УМО РФ, Москва, 2005 г), которым студенты пользуются на практических занятиях по одноименному спецкурсу.
Особенности строения и состава костной ткани
Костная ткань отличается прочностью и плотностью. Эти свойства основаны на высоком содержании в ней минеральных веществ. В то же время кости эластичны, что обусловлено их органическими составными частями (Кабаков, 1983). Составные части костей, как и все составные элементы организма, находятся в постоянной перестройке, причем органические и неорганические вещества все время синтезируются и разрушается. Костная ткань состоит из следующих основных элементов:
а) неорганические вещества (кристаллиты); б) органическое (основное) вещество — мактрикс; в) клеточные элементы.
Состав костей значительно варьирует. Он зависит как от возраста, так и от различия между отдельными костями. Даже состав одной и той же кости неодинаков в спонгиозной или компактной ее частях. В среднем костная ткань имеет состав, приведенный в таблице 1.
Минеральные вещества кости составляют около 1/4 объема кости и содержат кальций, фосфор, карбонат (в виде С03), цитрат, магний, натрий, калий и другие. Остальная часть приходится на органические компоненты и воду. Однако вследствие различий в удельной массе органических и неорганических компонентов на долю нерастворимых минералов приходится половина массы кости (Рапопорт, 1979; Маршалл, 2003)..
Основными компонентами минеральных веществ кости являются кальций и фосфор. Всего в организме взрослого человека содержится примерно 1-2 кг кальция (из них в костях и зубах находится около 99% кальция); около 1 кг фосфора (из них в костях и зубах - около 75%). Кальций и фосфор в костной ткани составляют основу гидроксиапатита - Саю(Р04)б(ОН)2 (Kerr, 1985).
Эти кристаллы имеют определенную форму: ширина от 20 до 50 А, длина -до 500 А. Такая форма кристаллов составляет огромную их поверхность -около 200 м /г. Кристаллы кости имеют три ионообменных зоны: внутреннюю, наружную и гидратную оболочку. Наиболее трудно доступна к ионному обмену внутренняя зона. Обмен ионов в наружной зоне кристаллов происходит быстрее. Практически любой ион может проникнуть через гидратную оболочку в наружную зону, но только некоторые из них там концентрируются, причем, часть из них может внедряться во внутреннюю зону (Касавина, 1975;Цыбульский, 1993).
Техника взятия костных трансплантатов и проведение операции их пересадки. Рентгенологические и морфологические исследования
Для сравнительного изучения морфологических и функциональных особенностей перестройки аутотрансплантатов из компактной и губчатой костной ткани при замещении дефектов нижней челюсти, а также для оценки жизнеспособности их в различные сроки после операции, нами проведены эксперименты на 84 половозрелых беспородных собаках в возрасте 5-6 лет, средней массой 10-15 кг. В искусственно созданный дефект в области тела нижней челюсти пересаживался аутотрансплантат из компактной или губчатой костной ткани. В качестве трансплантата компактной костной ткани использовали кортикальную пластинку тела нижней челюсти, взятую во время создания искусственного дефекта в области тела нижней челюсти, в качестве губчатого трансплантата - гребень подвздошной кости. Операцию пересадки костной ткани проводили с соблюдением всех основных правил асептики и антисептики (Робустова, 2001). Аутотрансплантация и все последующие биохимические исследования проводились в сериях с компактной, а также с губчатой костной тканью.
Операционное поле в области гребня подвздошной кости подготавливали так же, как и при взятии кортикальной пластинки. По краю гребня подвздошной кости производили разрез кожи, подкожно-жировой клетчатки, фасции, надкостницы.
Тупыми крючками расширяли операционное поле, надкостницу отслаивали распатором, при помощи бормашины и долота иссекали часть гребешка подвздошной кости размером 5-6 см. Иссеченную часть гребешка подвздошной кости, при помощи костных кусачек, измельчали до состояния костной «щебенки» размером 0,2-0,3 см и использовали в качестве костнопластического материала.
За 20 минут до операции животным внутримышечно вводили 2,0 мл дроперидола и 2,0 мл аминазина (рацпредложение за № 327 от 6.03.95). Через 15-20 минут собака становилась вялой, сонливой, переставала реагировать на человека. Животное фиксировалось на операционном столе, внутрибрюшинно ему вводили 2,0 мл 5% тиопентала натрия. Через 3-5 минут собака засыпала.
В области тела нижней челюсти справа или слева тщательно выстригали шерсть, операционное поле обрабатывали теплым раствором воды с мылом, насухо высушивали марлевыми салфетками и обрабатывали двукратно 5% раствором йода.
В области тела нижней челюсти, параллельно нижнечелюстному краю, отступя от него на 0,5 см книзу, проводили разрез кожи длиной 6-7 см. Послойно рассекали мягкие ткани: кожу, подкожную клетчатку и надкостницу, последнюю отсепарировали гладилкой и обнажали тело нижней челюсти. Тупыми крючками расширяли операционное поле, проводили гемостаз. При помощи бормашины и долота на наружной части тела нижней челюсти создавали дефект кости до половины ее толщины размером: высотой 1 см и длиной 4 см, в который помещали различный костнопластический материал в виде костной «щебенки». Отсепарированные мягкие ткани укладывались на место и рану ушивали послойно кетгутом, на кожу накладывали шелковые швы.
Рентгенологические изменения в трансплантате губчатой кости
Рентгенологически, спустя 30 суток после аутотрансплантации уже достаточно отчетливо определяются процессы перестройки трансплантата и замещение его регенератом. Четкость контуров образованного дефекта и трансплантата выражены значительно хуже, они становятся неровными.
Через 30 суток после операции пересадки аутотранс-плантата из губчатой костной ткани: участок в месте сращения аутотрансплантата с костным ложем реципиента посредством вновь образованной кости.
Окраска гемактоксилином и эозином х 80. Через 45 суток после операции пересадки рентгенологически определяются отчетливые процессы резорбции трансплантата и замещение его вновь образованной костной тканью. Контуры аутотрансплантата и послеоперационного дефекта определяются с трудом, выявляется образование костной мозоли.
Спустя 60 суток после аутотрансплантации, рентгенологически определяется полное замещение трансплантата совершенной костной структурой. Границы между трансплантатом и ложем реципиента неразличимы. В области пересадки отмечается плотность костной ткани, характерная для компактного строения. Трансплантат полностью перестроился и заместился новообразованной тканью.
Таким образом, рентгенологические исследования показали, что начальные признаки перестройки и замещения трансплантата наблюдаются спустя 30 суток после аутотрансплантации. Спустя 45 суток после пересадки, определяются отчетливые процессы замещения трансплантата. Полная перестройка трансплантата и замещение его вновь образованной костной тканью происходит к концу 60 суток после операции пересадки.
