Введение к работе
Актуальность проблемы При создании трансгенных растений весьма важным является выбор промотора для обеспечения достаточного уровня экспрессии чужеродного гена В настоящее время одним из наиболее широко используемых для этих целей служит "сильный" конститутивный 35S промотор, выделенный из вируса мозаики цветной капусты (ВМЦК) из группы каулимовирусов (Odell et al, 1985) Этот промотор имеет в 110 раз большую эффективность (Sanders et al, 1987), чем широко применявшийся ранее, промотор нопалинсинтазы из Т-ДНК агробактерий Однако для решения некоторых задач по созданию трансгенных растений и обеспечения достаточного уровня экспрессии белковых продуктов, экспрессионной эффективности 35S промотора оказалось недостаточно (Mitsuhara et al, 1996) При этом во многих бинарных векторах для трансформации растений как селективный, так и маркерный (или целевой) гены находятся под контролем все того же классического 35S промотора, что может отрицательно сказываться на уровне экспрессии, а иногда приводит и к "молчанию" трансгена В этой связи представляет значительный интерес как обнаружение новых, более эффективных промоторов, так и создание их химерных форм И поскольку 35S промотор вируса мозаики цветной капусты оказался во многом универсальным, стали осуществляться поиски аналогичных промоторов друї их каулимовирусов Так, были выделены и исследованы промоторы каулимовирусов сои (Glycine max) (Hasegawa et al, 1989), норичника (Scrophularia cahformca) (Sanger et al, 1990), ночной красавицы (Mirabilis jalapa) (Dey, Maiti, 1999), земляники (F x ananassa) (Pattanaik et al, 2004), маниока (Mamhot sp) (Samac et al, 2004) Bee эти промоторы показали "силу", сравнимую, а некоторые - превосходящую "силу" промотора вируса мозаики цветной капусты Из известных ныне промоторов каулимовирусов оставались не исследованными таковые у вирусов мозаики георгина (ВМГ), кольцевой гравировки гвоздики (ВКГТ), желтых листовых завивок цеструма и некоторых других Помимо поиска новых каулимовирусов, были проведены эксперименты по созданию эффективных
промоторных кассет, в состав которых были включены модифицированные и гибридные с другими промоторами формы 35S промотора Некоторые из полученных конструкций уже нашли применение в генной инженерии растений и показали высокий уровень экспрессии белковых продуктов Например, 35S промотор с двумя энхансерными доменами показал увеличение экспрессионной активности почти в два раза (Omirulleh et al, 1993), его гибридная форма с промотором маннопинсинтазы продемонстрировала уровень экспрессии в 3-5 раз больший в листьях и в 10-15 раз больший в корнях различных трансгенных растений (Comai et al, 1990) Были созданы различные промоторные кассеты на основе промотора и терминатора 35S транскрипта, из которых одна форма показала увеличение уровня экспрессии в 50 раз, по сравнению с 35S промотором (Mitsuhara et al, 1996) Тем не менее, пока нет оснований считать, что самые лучшие промоторы для целей создания трансгенных растений уже найдены или сконструированы
Одним из путей создания новых эффективных промоторов является метод направленной молекулярной эволюции in vitro Представляет особый интерес создание химерных форм промоторов методом ДНК шаффлинга — высокоэффективного метода рекомбинации генетического материала последовательностей гомологичных белков или их доменов (Stemmer, 1994), а также промоторных последовательностей (Remans et al, 2005) В качестве родительских последовательностей ДНК здесь предпочтительно использовать эффективные природные промоторы, каковыми являются промоторы каулимовирусов, все исследованные формы которых показали весьма высокий уровень экспрессии белков в трансгенных растениях При этом могут быть получены конструкции, более эффективные в трансгенных растениях, чем природные формы промоторов каулимовирусов
Цели и задачи исследования. Цель данной работы заключалась в выделении и исследовании новых промоторов каулимовирусов и создании их химерных форм методом ДНК шаффлинга
Для достижения этих целей были поставлены следующие задачи
1 Выявление филогенетического родства каулимовирусов на основе
анализа нуклеотидных последовательностей их геномов, поиск промоторных
последовательностей и подбор праймеров для их амплификации,
Поиск и отбор инфицированных каулимовирусами растений,
Амплификация и клонирование промоторов вируса мозаики георгина (ВМГ) и вируса кольцевой гравировки гвоздики (ВКГТ),
4 Определение нуклеотидной последовательности промоторов ВМГ и
ВКГТ и проведение сравнительного анализа с промоторами других
каулимовирусов,
Клонирование промогоров ВМГ и ВКГТ в бинарных векторах pCambia,
Получение химерных форм промоторов каулимовирусов методом ДНК шаффлинга,
Анализ экспрессионной активности генов GUS (р-глюкуронидаза) и GFP (зеленый флюресцептный белок) под контролем природных форм промоторов каулимовирусов в протопластах Ntabacum,
Количественный анализ экспрессионной активности промоторов ВМГ и ВКГТ в трансгенных растениях N tabacum
Научная новизна. Впервые амплифицирован и секвенирован участок генома вируса мозаики георгина, содержащий часть межгенного спейсера (700 пн), промотор и 7-ю открытую рамку считывания Проведен сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей промоторов ВМГ и ВКГТ с промоторами других каулимовирусов Показано распространение вируса мозаики георгина на территории г Уфы и окрестностей Впервые для получения одноцепочечной ДНК промоторов применена амплификация по типу катящегося кольца с использованием ДНК полимеразы фага phi 29 Получены химерные последовательности промоторов каулимовирусов методом ДНК шаффлинга Впервые проведен анализ экспрессионной активности промоторов вируса мозаики георгина и вируса кольцевой гравировки гвоздики в протопластах и трансгенных растениях табака. Показано, что для проявления экспрессионной
активности промотора вируса кольцевой гравировки гвоздики достаточно последовательности размером 370 пн
Практическая значимость работы. Промоторы вируса мозаики георгина и вируса кольцевой гравировки гвоздики могут быть применены при создании трансгенных растений в качестве заменителя классического 35S промотора, так как большое количество его копий в геноме могут быть одной из причин так называемого "молчания" трансгена Химерные промоторы каулимовирусов могут оказаться более эффективными, чем их природные аналоги и найдут применение при создании трансгенных растений, продуцирующих различные лекарственные или другие физиологически активные вещества и используемых в промышленных масштабах, так как применяемые для тех же целей клетки бактерий не всегда обеспечивают правильное сворачивание рекомбинантных белков Подобранные праймеры для амплификации промоторов каулимовирусов могут быть использованы для идентификации этих вирусов в инфицированных растениях
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на XIII международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2006), на международной конференции "Генетика в России и мире" (Москва, 2006), на Российской школе-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология» (Москва - Пущино-на-Оке, 2006), на Четвертом съезде общества биотехнологов России (Пушино, 2006), на Школе-семинаре молодых ученых «Биомика - наука XXI века» (Уфа, 2007)
Публикации. Основные результаты диссертации изложены в 10 печатных работах, а также депонированы в международных банках данных EMBL, GenBank и DDBJ
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 152 страницах, содержит 3 таблицы и 42 рисунка Состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания объектов и методов исследования (глава 2), результатов исследования и их обсуждения (глава 3), заключения, выводов и списка литературы, включающего 203 источников
