Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 14
1.1. Современные представления о нестабильности генома 14
1.1.1. Нестабильность генома при патологических состояниях 14
1.1.2. Факторы, формирующие нестабильность генома 16
1.1.3. Цитогенетические нарушения, характеризующие нестабильность генома при патологии 20
1.1.4. Антиоксидантная система - система способная поддержать стабильность генома в норме и при развитии патологических процессов 22
1.2. Детский церебральный паралич заболевание с не до конца выясненной этиологией и патогенезом 25
1.2.1. Общие сведения о ДЦП 25
1.2.2. Генетические факторы в патогенезе ДЦП 28
1.3. Некоторые звенья патогенеза дцп как потенциальные провоцирующие факторы развития нестабильности генома 29
1.3.1. Некоторые нарушения обменных процессов при ДЦП, которые могут привести к формированию нестабильности генома 29
1.3.2. Аминоспирты как участники метаболизма 38
1.3.2.1. Этаноламина 38
1.3.2.2. Фосфоэтаноламина 40
1.5. Ацетилирование как один ' из биохимических процессов
обеспечивающих жизнедеятельность организма 41
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 44
2.1. Объем исследований 44
2.2. Общая характеристика обследованных лиц 46
2.3. Методы исследования 47
2.3.1. Методы, регистрирующие наличие феномена нестабильности генома у больных ДЦП 47
2.3.1.1. Патогенетические методы 46
2.3.1.1.1. Метод учета эритроцитов с микроядрами в периферической крови больных детей 47
2.3.1.1.2. Метод регистрации хромосомных аббераций в лимфоцитах периферической крови больных ДЦП . 48
2.3.2. Методы изучения механизмов формирования нестабильности генома при дцп 49
2.3.2.1. Методы оценки кластогенной и анеугенной активности этаноламина и фосфоэтаноламина 50
2.3.2.1.1. Метод определения кластогенной активности препаратов 50
2.3.2.1.2. Метод определения анеугенной активности препаратов 53
2.3.2.2. Методы определения активации или ингибирования аналогов перекисного окисления липидов, ксантиноксидазного цикла и генерации оксид азота на модельных бесклеточных системах 54
2.3.2.2.1. Определение активации или ингибирования препаратами окисления желточных липопротеинов (определение антиоксидантной активности (АОА) препаратов) 54
2.3.2.2.2. Определение супероксиддисмутазной (SOD)-активности препаратов (способность взаимодействовать с супероксидпым анион-радикалом (Ог*) 56
2.3.2.2.3. Оценка влияния препаратов на образование монооксида азота (N0') 56
2.3.2.2.4. Метод определение интенсивности ПОЛ в организме больных детей по содержанию малонового диальдегида с помощью тиобарбитуровой кислоты 57
2.3.2.2.5. Метод оценки интегрального показателя антиоксидантной ёмкости крови больных детским церебральным параличом 58
2.3.2.3. Метод определения скорости ацетилирования у больных детским церебральным параличом 59
2.3.3. Методы статистического анализа 60
ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований . 61
З.1. Определение феномена нестабильности генома у больных детским церебральным параличом 61
З.1.1. Определение уровня повреждения хромосом в периферической крови больных и здоровых лиц 61
З.1.2. Оценка содержания эритроцитов с микроядрами в
крови больных и здоровых людей 63
3.2. Исследование механизмов формирования нестабильности генома при днп 66
3.2.1. Определение кластогенной и анеугенной активности этаноламина и фосфоэтаноламина на опытах Crepis capillaris и мышах 66
3.2.1.1. Определение кластогенной активности препаратов на Crepis capillaris 66
3.2.1.2. Определение анеугенной активности препаратов на мышах 70
3.2.2. Определение прооксидантной и антиоксидантной активности препаратов 80
3.2.2.1. Исследование влияния этаноламина и фосфоэтаноламина на уровень липидной перодоксидации в модельной системе 80
3.2.2.2. Изучение СуперОКСИДДИСМутаЗНОЙ (SOD)-aKTHBHOCTH препаратов 82
3.2.2.3. Изучение влияния препаратов на образование монооксида азота (N0') 86
3.2.2.4. Определение интенсивности ПОЛ по содержанию малонового диальдегида в крови больных 88
3.2.2.5. Исследование антиоксидантного статуса методом кулонометрическим определением интегральной антиоксиддантной емкости крови 90
3.2.2.6. Определение активности N-ацетилтрансферазы (N-AT) 94
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов собственных исследований 97
Выводы 104
Список литературы105
- Современные представления о нестабильности генома
- Общая характеристика обследованных лиц
- Определение активации или ингибирования препаратами окисления желточных липопротеинов (определение антиоксидантной активности (АОА) препаратов)
- Определение феномена нестабильности генома у больных детским церебральным параличом
Введение к работе
Актуальность темы. Нестабильность генома (НГ) или генетическая нестабильность (ГН) — это постоянное изменение структуры хромосом, её отдельных локусов или группы локусов, возникающее спонтанно или под действием некоторых мутагенов. Признаком НГ является сохранение потенциальной возможности таких изменений в ряду клеточных поколений [3]. В общебиологическом смысле, феномен, повышая адаптационный потенциал живого, несомненно, является благоприятным свойством [124, 173]. Однако в медицинском аспекте НГ у больных может сопровождаться крайне нежелательными побочными эффектами. Одним из них является повреждение многочисленных локусов ДНК, в том числе и таких, где располагаются структурные и регуляторные гены. Последствия этого предсказуемы - нарушение экспрессии генов и стойкая дезинтеграция биохимического хозяйства клетки, что фенотипически проявится в утяжелении заболевания, пролонгации его течения, снижении эффективности терапевтических воздействий и, как следствие, ухудшение прогноза. Исходя из этого, в теории и практике медицины всё больший вес приобретают исследования механизмов определяющих возникновение и формирование НГ и разработки на их основе новых принципов диагностики, лечения и профилактике заболевания. Это в полной мере относится к детскому церебральному параличу, наличие в патогенезе которого аутоиммунных процессов, гипоксии и др. уже a priori предполагает возможность формирования НГ [73, 76].
ДЦП - гетерогенная группа клинических синдромов, возникающих в результате нарушения формирования головного мозга на ранних этапах онтогенеза [6, 7, 27, 82, 105, 108, 166]. Нестабильность генома при этом заболевании совершенно не изучалась. Мировой опыт показывает [10, 11, 44, 66, 86, 149, 205], что в таких случаях следует начать с доказательства наличия этого феномена и, в случае
8 положительного результата, рассмотреть роль в его возникновении собственных метаболитов-мутагенов, биохимических процессов генерирующих активные формы кислорода и стабильность систем защиты генома. Этот единый блок исследований, несмотря на ориентировочный характер, позволяет очертить контуры феномена и наметить точки для дальнейших исследований. И, наконец, важным моментом в исследовании является оценка функционирования самых различных биохимических процессов в условиях метаболической несостоятельности создаваемой НГ. В качестве такого процесса мы избрали одну из реакций биотрансформации — ацетилирование [1, 16, 67, 85, 90]. Актуальность такого подхода очевидна — выявление новых элементов патогенеза заболевания расширяет возможности его лечения.
В заключении отметим, что установление феномена нестабильности генома при ДЦП, механизмов, приводящих к этой нестабильности, понимание её последствий может внести существенный вклад в представление об этиологии и патогенезе этого заболевания, послужить основой в разработке стратегических направлений в его лечении.
Всё вышеизложенное определило цель и задачи исследования. Цель работы: определить наличие нестабильности генома у больных детским церебральным параличом, изучить вероятные механизмы её формирования и оценить влияние на функционирование системы ацетилирования.
Задачи исследования.
Цитогенетическими методами показать наличие феномена нестабильности генома у детей больных ДЦП.
Оценить в опытах in vitro и in vivo мутагенную активность метаболитов этаноламина и фосфоэтаноламина.
В опытах in vitro изучить способность этаноламина и фосфоэтаноламина модифицировать генерацию свободных радикалов в модельных химических и ферментативных системах (системы железо-индуцированного окисления желточных липопротеинов, системы ксантин-ксантиноксидазы и системы генерации монооксид азота).
В опытах in vivo у больных исследовать состояние интегральной антиоксидантной ёмкости крови и интенсивность процессов перекисного окисления липидов.
Определить характер реакции ацетилирования у больных в условиях выраженной нестабильности генома.
Научная новизна исследования.
Впервые высказано предположение об участии этаноламина и фосфоэтаноламина в формировании нестабильности генома при ДЦП.
Выявлена способность этих метаболитов усиливать генерацию в модельных радикал-генерирующих системах супероксида и оксид азота. Это предполагает наличие ещё одного пути формирования НГ - путём активации метаболитами (содержание которых повышается в крови при заболеваниях) биохимических систем генерирующих свободные радикалы. В тоже время исследуемые метаболиты не влияли на интенсивность функционирования модельной системы ПОЛ. Это наряду с отсутствием изменений в содержании МДА в сыворотки больных позволяет заключить, что система ПОЛ не является определяющей в формировании НГ при ДЦП. В общем плане это может быть отражением процесса дифференцированного участия систем генерации свободных радикалов в развитии НГ при различных заболеваниях.
Показана корреляция величины интегрального показателя антиоксидантной ёмкости крови со степенью выраженности НГ. Доказывается перспективность использования показателя интегральной антиоксидантной емкости крови (ИАЕК) в изучении НГ в качестве экспресс-
10 метода.
Отмечена существенная модификация процесса ацетилирования у больных ДЦП по сравнению со здоровыми индивидуумами. Выдвинуты гипотезы объясняющие обнаруженный феномен.
Практическая значимость исследования.
Полученные данные о возможном участии в формировании НГ метаболитов-мутагенов и свободных радикалов ставит вопрос о необходимости разработки комплекса мероприятий обеспечивающих защиту генома от повреждений у больных ДЦП.
Выяснение причин модификации процесса ацетилирования у больных ДЦП позволит не только своевременно определить группы риска, но и поможет приступить к разработке принципов индивидуализированного лечения больных ДЦП.
Апробированный в наших исследованиях метод интегральной оценки антиоксидантной ёмкости крови в связи с простотой, экономичностью и высокой воспроизводимостью может использоваться как лабораторный метод экспресс-диагностики НГ.
Основные положения, выносимые на защиту.
У больных детским церебральным параличом выявляется высокий уровень кластогенных и анеугенных повреждений генетического аппарата клеток периферической крови.
В опытах in vitro и in vivo метаболиты этаноламин и фосфоэтаноламин обнаружили способность индуцировать процессы анеугенеза и кластогенеза. Эта способность больше выражена у этаноламина.
В модельных (химических и ферментативных) системах in vitro этаноламин в отличие от фосфоэтаноламина усиливает генерацию супероксиланион радикала и оксид азота, уровень липидной пероксидации при воздействии обоих метаболитов остаётся без
изменений. У больных на фоне снижения антиоксидантной защиты, уровень МДА в плазме крови (у большинства больных) не изменяется. 4. Среди больных детей с выраженной нестабильностью генома преобладают индивидуумы с фенотипом медленного ацетилирования.
Внедрение результатов работы.
Результаты исследования антиоксидантной емкости крови используются в практической работе поликлиники Казанского научного центра РАН, а также при чтении лекций и проведения практических занятий на кафедрах медицинской биологии и генетики; неврологии, нейрохирургии и медицинской генетики КГМУ.
Апробация работы.
Основные результаты исследования были доложены на заседании кафедры медицинской биологии и генетики ГОУ ВПО «Казанский ГМУ» Росздрава от «8» апреля 2008г.; на IX научно-практической конференции молодых ученых, посвященной 190-летию Казанского медицинского университета (Казань, 2004); Ш-м конгрессе по патофизиологии с международным участием «Дизрегуляционная патология органов и систем» (Москва, 2004); фрагменты диссертации были доложены на постерной сессии молодых ученых научной конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии», посвященной 200-летию Казанского университета (Казань, 2004); научно-практической конференции «Педиатрия в Приволжском федеральном округе» (Казань, 2004), Ш-м Российском конгрессе «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии» (Москва, 2004); международной конференции по проблемам информатизации в третьем тысячелетии (Казань, 2004); ХП-м Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2005); 1Х-м Всероссийском съезде неврологов (Ярославль, 2006); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием, посвященной 150-летию В.М.
12 Бехтерева «В.М. Бехтерев - основоположник нейронаук: творческое наследие, история и современность» (Казань, 2007).
Публикации.
По материалам диссертации опубликовано 13 работ, в том числе 4 в рецензируемых журналах, 1 в международной печати.
Структура и объем диссертации.
Диссертация состоит из следующих глав: введения, обзора литературы,
материалов и методов, собственных исследований, обсуждения
результатов, выводов, указателя литературы, включающего 128
отечественных и 81 иностранных источника. Диссертация иллюстрирована
15 рисунками и 21 таблицей. Объем работы - 124 страниц. Работа выполнена
на кафедре медицинской биологии и генетики Казанского
государственного медицинского университета, на базе ЦНИЛа Казанского ГМУ, отделе молекулярной биологии РГМУ (Москва).
Параметры исследования:
2.2.1.Объект наблюдения - лица с подтвержденным диагнозом ДЦП, тест-объект Crepis capillaris, лабораторные мыши;
Единица наблюдения - биохимические (метаболические) сдвиги в модельных системах и клетке.
2.2.2. Место — генетическая лаборатория кафедры медицинской биологии и
генетики КГМУ, ЦНИЛ КГМУ, РГМУ (Москва) - ЦНИЛ, отдел
молекулярной биологии.
Время - кратковременное, для животных и тест-объекта период наблюдения.
Степень охвата — несплошное
Учетные признаки - изменения стабильности генома, развивающиеся вследствие эндомутагенного воздействия неблагоприятных факторов на
13 организм.
2.2.5. Источники данных - официальные, собственные оригинальные сведения.
2.5. Методы анализа данных исследования - использование t Стьюдента, методы корреляционного анализа (Microsoft Excel ХР).
Современные представления о нестабильности генома
Нестабильность генома (НГ) - широко распространенное в популяции человека биологическое явление, возникающее под влиянием различных воздействий на организм [100]. Источником нестабильности генома служат повреждения молекул ДНК, возникающие как спонтанно, так и при разного рода химических, физических и биологических воздействиях [41, 60]. Возможны и эпигенетические (например, метилирование ДНК) причины формирования НГ. Фенотипически феномен НГ регистрируется при различных патологических состояниях наряду со специфической симптоматикой, по наличию в клетках больного мутационных (генных, хромосомных и геномных) изменений. НГ выявлена при различных патологических состояниях, например, инфекционных заболеваниях (вирусные, инфекционные, паразитарные заболевания), нарушениях иммунного статуса, патологии новорожденных, травмах и т.д. [33, 34, 44, 100, 179, 181].
Явление нестабильности генома в организме, как правило, возникает в результате двух причин - снижения активности геном-протекторных систем и повышения интенсивности процессов эндомутагенеза за счет усиленной генерации метаболитов-эндомутагенов под влиянием развивающегося патологического процесса [34, 100]. Немаловажное значение в индукции НГ играют и эндотоксины инфекта проникшего в организм.
Патогенный фактор инициирует в организме цепочку событий, которые нарушают его жизнедеятельность, а также таких, которые препятствуют этому разрушению. Превалирование первых, в конечном итоге, приводит к дизрегуляции интегральных систем. Нарушаются обратные связи, многие системы выходят из-под контроля и становятся гиперактивными. В условиях аномального метаболизма из нормальных биохимических процессов, содержащих в качестве интермедиатов соединения обладающие мутагенной активностью, формируются метаболические циклы кластогенеза (МЦК), которые активно генерируют метаболиты-эндомутагены. Следствием этого будет повышение общего пула мутагенов в организме [100].
В условиях пониженной активности геномпротекторных систем процесс формирования нестабильности генома при патологии ускоряется [31,32,98,99, 127]. Патогенетические факторы, активирующие перевод нормальных метаболических циклов в МЦК могут сохраняться достаточно долго и эндомутагены, в этом случае будут постоянно нарушать геном новых клеточных генераций. С другой стороны, эндомутагены МЦК могут так изменить геном клетки, что это приведёт к переходу его в новое метастабильное состояние, один из признаков которого - повышенная мутабильность. В этом случае потомство такой клетки уже без вмешательства эндомутагенов будет нести мутации. В любом случае главным свойством нестабильности генома является наличие в клетках таких генетических повреждений, которые совместимы с жизнеспособностью клетки и сохраняют её способность к делению и в тоже время повышают мутабильность дочерних клеток [100]. Формирование НГ является результатом воздействия различных факторов самой разнообразной природы, которые могут приводить к повреждениям генетических структур [44, 66, 196].
Уровень факторов, вызывающих ошибки в репликации и репарации ДНК, а также увеличивающих образование эндомутагенов, как правило, определяется как ростом количества поступления в организм экзомутагенов (например, эндотоксина-мутагена из инфекта, вирусы и др.), так и возрастанием генерации собственных мутагенных факторов: химические (метаболиты-эндомутагены), физические (температура). К метаболитам-эндомутагенам относятся химические соединения, которые являются участниками метаболических процессов. В нормальных условиях метаболиты-эндомутагены не представляют опасности, но в условиях патологии их концентрация в крови и других тканях возрастает, и они представляют реальную угрозу для генома больного [34, 100]. Среди эндомутагенов самая обширная группа мутагенов — свободные радикалы [92, 151, 170].
Свободные радикалы - это молекулы или структурные фрагменты молекул, имеющие на внешней орбитали неспаренный электрон. Поскольку для устойчивого состояния молекула должна содержать на наружной орбитали два электрона, свободные радикалы активно стремятся отнять недостающий электрон от других молекул, что придает им повышенную реакционную способность [92]. Среди свободных радикалов выделяют группу «активных форм кислорода» (АФК), которая представляет наибольшую опасность для человека.
АФК, возникающие при окислительном стрессе, инициируют цепные реакции ПОЛ, приводящие к накоплению в клетке и организме гидроперекисей, липидов и малонового диальдегида (МДА), как конечного продукта ПОЛ [2, 8, 16, 115, 162, 201]. Липидные гидроперекиси вызывают одиночные и двойные разрывы нитей суперспирализованной плазмидной ДНК pBR322 [209]. МДА вызывал повреждения изолированной ДНК XI74, оказывал мутагенной действие на микроорганизмы и в культурах клеток млекопитающих [202], а также образовывал аддукты ДНК в культивируемых клетках крови человека [146]. Повреждающее ДНК действие МДА ингибировалось каталазой и ловушками гидроксильного радикала: бензоатом и йодидом калия. Следовательно, АФК запускает процессы ПОЛ, приводящие к образованию МДА и участвует в реализации его генотоксического влияния [44].
К активным формам кислорода относят кислородсодержащие радикалы: супероксидный аниоп-радикал (02 ), синглетный кислород ( 02) -кислород с одним возбужденным электроном, гидропероксидиый радикал (Н02 ) и гидроксил-радикал (НО ), а также перекись водорода (Н202) и пергидроксил (2ОН), который в нейтральной и щелочной среде легко диссоциирует на 02 и протон [28, 29, 63, 84], а также гипохлорную кислоту (HOCL). Несмотря на то, что Н202 и HOCL не являются свободными радикалами, в присутствии ионов Fe2+ и 02+ молекулы этих веществ способны быстро разлагаться с образованием НО [77, 92]:
Общая характеристика обследованных лиц
Для выявления цитогенетических аномалий в соматических клетках использовался микроядерный тест (учет в периферической крови эритроцитов с микроядрами). Мазки периферической крови для стандартного общего анализа крови брались у больных при поступлении в стационар (т.е. до лечения), у здоровых лиц - во время диспансерного обследования в поликлинике. Приготовление препаратов для исследования эритроцитов с микроядрами всегда было совмещено с плановыми лабораторными анализами, и дети не подвергались дополнительным исследовательским манипуляциям.
Капля крови наносилась на чистое сухое предметное стекло, готовили мазок. Препараты высушивались на воздухе в течение нескольких часов. Приготовленные мазки фиксировались 90-70% этиловым спиртом 3 мин. Препараты высушивались и окрашивались в растворе азур-эозинового красителя Романовского - Гимза 1:5 на дистиллированной воде рН 6,8 20 минут и хорошо прохмывались. Для исследования на микроядерный тест были просмотрены по 1-2 препарата от каждого человека. Поскольку частота встречаемости полихроматофильных эритроцитов крови с микроядрами у человека низка, то в каждом случае анализировали 20000 клеток. Число эритроцитов с микроядрами рассчитывали в процентах. Микроядра отличали от артефактов в соответствии с рекомендацией Ильинского Н.Н. [59]. Образцы крови у больных и в контрольной группе забирались в один и тот же период времени. Каких-либо факторов, способных индуцировать цитогенетические нарушения у лиц контрольной группы, не выявлено. Метод регистрации хромосомных аберраций в лимфоцитах периферической крови больных ДЦП и здоровых лиц
Для исследования аберраций хромосом использовалась гепаринизированная кровь, взятая у больных для плановых лабораторно-клинических анализов, назначаемых лечащим врачом при поступлении в стационар. Культивировалась кровь со сроками хранения не позднее 24-28 часов и при температуре хранения 4 градуса по С. Исследования, проведенные ранее, показали, что такой срок хранения крови существенно не отражался на результатах исследования. Культивирование крови осуществляли согласно общепринятой методике [21]. Культуру фиксировали на 48 часов. За 3 часа до фиксации добавляли колхицин в конечной концентрации 0,5 мкг/мл. На каждого обследованного готовили 2 мазка, в каждом мазке изучали по 150 метафаз, полученные данные суммировали. Использовали фитогемагглютинин, колхицин и красители производства фирмы Sigma. При цитогенетическом анализе (10x100), учитывали только число клеток с нарушениями структуры хромосом. Гепы не учитывались.
При отборе детей в группы возник вопрос о величине выборки. С одной стороны, чем меньше детей в группе, тем меньшее их количество будет подвергаться различным исследовательским манипуляциям (хотя последние и совмещены с плановыми лабораторными анализами), что с этической точки зрения является благоприятным моментом. С другой стороны малая репрезентативная выборка повышает вероятность ошибки 1-го PI 2-го рода (вероятность ложноположительного или ложноотрицательного заключения).
Анализ данных литературы показал, что при цитогенетическом анализе, подобном нашему, достаточно пользоваться выборками при величине ошибок, равной 0,05 и анализе от каждого индивидуума 200-700 клеток. Это, а также рекомендации Бочкова Н.П. с соавт. [21], позволило остановиться на величине выборки для каждой формы ДЦП равной 10 человек и количестве просматриваемых клеток каждого обследованного равном 300.
Для изучения механизмов формирования НГ мы использовали три группы методов. 1. Цитогенетические методы определения кластогенной и анеугенной активности метаболитов. 2. Методы, позволяющие в химических и ферментативных бесклеточных моделях определить активацию или иигибирование перекисного окисления липидов (определение антиоксидантной активности (АОА) препаратов), ксантиноксидазного цикла (SOD)-aKTHBHOCTb препаратов) и образование монооксида азота (NO"). Сюда же мы отнесли метод, определяющий активность перекисного окисления липидов в организме больных и метод, оценивающий интегральную антиоксидантную ёмкость крови больных. Оба метода исследуют параметры в крови больных ДЦП и логически завершают блок исследований, связанный с изучением механизма формирования НГ. 3. Третья группа методов позволяет определить поведение системы ацетилирования в организме больных ДЦП в условиях НГ. 2.3.2.1. Методы оценки кластогенной и анеугенной активности этаноламина и фосфоэтаноламина 2.3.2.1.1. Метод определения кластогенной активности препаратов а) Выбор диапазона исследуемых концентраций. Определение кластогенной активности препаратов имеет свои особенности, без учёта которых полученные результаты не будут достоверными. К ним, прежде всего, относится обоснованный подбор исследуемых концентраций препаратов и, в частности, высшей концентрации препарата. Последний в такой концентрации не должен обладать токсическим эффектом, по отношению к используемому тест-объекту (животному или растению). В противном случае определить мутагенный потенциал препарата не удастся в связи с тем, что токсичность препарата перекроет его мутагенный эффект. Поэтому часто в экспериментальньк работах по определению мутагенности препаратов в качестве верхней концентрации исследуемого диапазона берут выявленную экспериментальным путём нетоксическую концентрацию препарата. В нашем случае эта была концентрация которая не подавляла прорастание семян скерды, но увеличенная в 2 раза статистически значимо подавляла этот процесс.
Определение активации или ингибирования препаратами окисления желточных липопротеинов (определение антиоксидантной активности (АОА) препаратов)
При определении АОА препаратов использовался метод, основанный на способности некоторых веществ ингибировать железо-индуцированное окисление желточных липопротеинов [61, 138]. Суспензию желточных липопротеинов получали путем гомогенизирования желтка куриного яйца, содержащего два типа липид-белковых комплексов, соответствующих по составу липопротеидам низкой плотности (ЛПНП) и липопротеидам очень низкой плотности (ЛПОНП) плазмы крови человека, в равном объеме фосфатного буфера (40 мМ КН2Р04, 105 мМ КС1, рН=7,45). Полученную суспензию перед использованием разводили в 10 раз тем же буфером.
Для проведения анализа в пробирку помещали 100 мкл желточных липопротеинов, 100 мкл исследуемого препарата, 700 мкл буфера. В контрольную пробу вместо препарата добавляли 100 мкл дистршлированной воды. Перекисное окисление липопротеинов во всех пробирках инициировали добавлением 100 мкл 25мкМ FeS04x7H20. Пробы инкубировали 30 минут в термостате при 37. После окончания инкубации в пробы добавляли 500 мкл 20% трихлоруксусной кислоты (ТХУ) и 100 мкл 10" М ионола, после этого образцы интенсивно перемешивали и центрифугировали 15 минут при 900g. Затем к 700 мкл супернатанта добавляли 600 мкл 0,5% тиобарбитуровой кислоты (ТБК), пробирки встряхивали и нагревали 30 минут на водяной бане (100 С). После этого пробы охлаждали, и оценивали светопоглощение при длине волны 532 нм. Результаты рассчитывали по формуле: АОА,% = к " х 100% ; где Ак - А532 в контрольном образце в опытном (содержащем исследуемый препарат) образце. Ак- поглощения контрольной пробы (без препарата) принимали за 100%, Аоп - пересчитывали в проценты относительно Ак. Строили график зависимости процента поглощения от концентрации препарата. По этому графику находили С50 - концентрация препарата, при которой происходит 50% изменения светопоглощения, относительно контроля. Определение супероксиддисмутазной (SOD)-3KTHBHOCTH препаратов (способность взаимодействовать с супероксидным анион радикалом (02 ) Супероксиддисмутазную активность (SOD-активность) препаратов оценивали методом люцигенин-активированной хемилюминесценции в реакции ксантина с ксантиноксидазой. Образование супероксидного иона происходит при реокислении восстановленной ксантиноксидазы кислородом и окислении ксантина. Реакция ингибируется супероксиддисмутазой (СОД).
Измерение хемилюминесценции. В кювету люминометра добавляли 0,1 М фосфатный буфер (рН 7,4), люцигенин до концентрации 80 мкМ, 100 ед/мл каталазы, 0,25 ед/мл ксантиноксидазы. Реакцию запускали добавлением 25мкМ ксантина и измеряли уровень хемилюминесценции в контрольной пробе. В данные пробы вносили известные концентрации препаратов. Измерения проводили в режиме слежения при перемешивании. Оценивали высоту пика на кривой хемилюминесценции. Для оценки эффектов препаратов сравнивали интенсивность хемилюминесценции в контроле, и в пробах, инкубировавшихся с разными концентрациями исследуемых веществ. Рассчитывали С5о концентрацию препаратов, которая ингибирует 50% супероксид анион радикалов. Для определения СОД-чувствительного компонента реакции в параллельные пробы добавляли СОД (30 ед/мл).
Способность препаратов взаимодействовать с NO оценивали методом, основанным на специфическом взаимодействии монооксида азота и спиновой метки РТЮ, обладающей известным ЭПР-спектром. Источником монооксида азота служит соединение SIN-1, генерирующее NO с постоянной скоростью. Продуктом взаимодействия является PTI. Это приводит к появлению дополнительных пиков в ЭПР-спектре. Количественное определение NO производится вычислением относительной высоты образовавшихся пиков.
Регистрация спектров ЭПР производилась на спектрометре LFR-30 Free Radical Analizer (JEOL, Tokyo, Japan). Экспериментальные условия: развертка поля 330-340 мТ, микроволновая мощность 4 мВт, частота модуляции 9,41 ГГц, ширина модуляции ОД мТ, постоянная времени 0,1 сек., время сканирования 1мин., температура 300 К. Кювета ЭПР-сектрометра, объемом 200 мкл содержала 10 мкл 1мМ РТЮ, 20 мкл ЮмМ SIN-1 в 0,1 М фосфатном буфере (рН=7,4). Пробы инкубировали 30 мин. при комнатной температуре, после чего производили запись спектра. Относительная интенсивность сигнала PTI вычисляли из отношения I = а/в, где а-высота пика PTI, в-высота пика РТЮ. Для оценки эффектов препаратов сравнивали относительную интенсивность PTI в контроле, и в пробах, инкубировавшихся с разными концентрациями исследуемых веществ.
Относительную интенсивность PTI в контроле принимали за 100%, строили графики зависимости интенсивности PTI в процентах от количества препарата. Затем из графика определяли С5о - количество препарата, при котором происходит 50% падение интенсивности PTI.
Определение феномена нестабильности генома у больных детским церебральным параличом
Результаты исследования показали, что при оценке повреждений хромосом в лимфоцитах периферической крови у всех обследованных больных регистрировалось повышенное количество перестроек по сравнению с контролем. При статистической обработке результатов исследования выявлено, что высокий уровень перестроек был достоверным не у всех детей, входящих в группы, а лишь у 60-78% (р 0,001) (табл. 5). Наибольшее число детей (78%) с достоверно высоким уровнем повреждений хромосом было отмечено в группе страдающих двойной гемиплегией.
Сравнительный анализ числа перестроек хромосом у детей с различными формами заболевания, показал, что наиболее ВЫСОКРТЙ уровень повреждений хромосом наблюдается у детей болеющих двойной гемиплегией. У детей этой группы уровень аберраций хромосом (АХ) достигал в среднем 8,24%, что достоверно выше аналогичных показателей в других группах и более чем в 3 раза выше контрольного значения. Количество выявленных повреждений хромосом при других формах заболевания было существенно ниже и находилось в диапазоне от 6,19±0,42 до 6,30±0,51 и достоверно не зависело от формы заболевания. Табл. 5 Уровень аберраций хромосом у больных ДЦП в зависимости от формы заболевания
Формы ДЦП Всего обследовано больных Больные с достоверно Средний уровень перестроек аберраций хромосом, в % высокимуровнемаберрацийхромосом. в расчёте на всехобследованныхбольных в расчёте набольных сдостоверновысоким уровнемаберраций Примечание: 1. СД - спастическая диплегия, ДГ - двойная гемиплегия, ГК - гиперкинетическая форма, ГП(Л) - левосторонняя гемипаретическая, ГП(П)-правосторонняя гемипаретическая, А-А атонически-астатическая;
В этих исследованиях мы столкнулись с некоторыми фактами, на которых необходимо остановиться. Прежде всего, на основании анализа АХ у каждого заболевшего выявлено, что повреждения хромосом возникают не у всех детей, страдающих ДЦП. Причём это характерно для всех форм заболевания. Сразу же напрашивается вывод, который часто применяют в аналогичных ситуациях - это может быть результатом малой чувствительности используемого нами метода регистрации АХ. Вполне уместно и другое объяснение - у больных детей с нормальным генотипом имеются мощные системы защиты генома, которые восстановили повреждения генетического аппарата. Примечательно то, что при анализе уровня эритроцитов с микроядрами (ЭМ) мы не обнаружили аналогичного явления. Это, как и в первом случае, может свидетельствовать о более чувствительной регистрации повреждений методом микроядерного анализа или объясняться разными механизмами (мутагенез и анеугенез) формирования повреждений хромосом при образовании микроядер и аберраций. По нашему мнению оба высказанных предположения имеют право на проверку.
Результаты исследования показали значимое повышение уровня ЭМ в крови больных ДЦП по сравнению со здоровыми детьми. Уровень ЭМ у больных детей как в группах с различными формами ДЦП, так и в группах разделенных по полу достоверно превышает (td в группе 10, 8 и 9 мальчики и девочки соответственно) контрольные значения (р 0,001) (табл.6). Анализ количества ЭМ в соответствии с формой заболевания и полом привел к следующим результатам - у больных с различной формой заболевания средний уровень ЭМ был примерно одинаков и варьировал от 0,193% при ГП (Л) до 0,213% при ДГ (р 0,05).
Содержание ЭМ в периферической крови в группах мальчиков и девочек с одинаковыми формами заболевания практически не отличалось (во всех случаях р 0,05). Аналогичные результаты получены и при изучении уровней ЭМ в крови мальчиков в зависимости от формы заболевания: - они не были связаны. В тоже время у девочек с гиперкинетической формой ДЦП он был достоверно выше, чем при спастической диплегии (р 0,05) и гемипаретических формах болезни (р 0,05). Табл. 6 Содержание эритроцитов с микроядрами у больных ДЦП в зависимости от формы заболевания и пола детей Примечание: 1. СД - спастическая диплегия, ДГ - двойная гсмиплегия, ГК - гиперкинетическая форма, ГП(Л) - левосторонняя гемипаретическая, ГП(П) - правосторонняя гемипаретическая,
Таким образом, результаты исследования показали, что у больных ДЦП независимо от пола и форм заболевания происходит достоверное повышение уровня микроядер в периферической крови по сравнению со здоровыми лицами. Мы не обнаружили существенной корреляции между исследуемыми параметрами, только в одном случае - у девочек, где частота ЭМ коррелировала с некоторыми формами заболевания. Но эта корреляция была не высокой (р 0,05). Полученный в наших исследованиях факт отсутствия влияния форм заболевания на тяжесть повреждения генома может быть объяснен, малой величиной выборки больных детей в группах. Возможно, что увеличение числа обследованных лиц в группах по формам заболевания приведёт к получению иных показателей и зависимостей. С другой стороны нельзя исключить предположение, что такая монотонность в частоте повреждения генома связана с каким-то геном-повреждающим процессом, который с одинаковой интенсивностью функционирует при различных формах ДЦП. Это может быть обусловлено этапностью в формировании НГ. Если в период раннего онтогенеза уровни повреждения генома у индивидуумов различались, то в более поздний период, после элиминации путём некроза и апоптоза клеток с высоким уровнем повреждения генома, у всех больных мутагенез стабилизировался на одном, совместимом с жизнедеятельностью организма уровне.
Мы не проводили сравнительный анализ между уровнем ЭМ в крови и возрастом детей, как это делается в классических схемах медицинских исследований. Это связано с тем, что при распределении детей по возрасту в некоторых группах их оказалось слишком мало, чтобы сделать какие-то статистически подтверждённые выводы.
Проведённые исследования, показавшие повышенный уровень ЭМ и ХА в клетках периферической крови больных свидетельствуют о наличии у них нестабильности генома на основании двух посылок. Прежде всего, высокий уровень повреждений генома выявлен в группе, куда входили больные ДЦП не контактирующие в момент обследования с мутагенами. И, во вторых, факт повреждения генома отмечен у больных различных возрастных групп.
