Содержание к диссертации
Введение
ВВВДЕНИЕ. З
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 6
1.1. Биологическая роль меди в организме животных . . 6
1.2. Содержание и обмен меди в животном организме . .14
1.3. Роль печени в метаболизме меди 23
1.4. Нарушения обмена меди у овец 31
2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 37
2.1. Экспериментальные животные и краткая характеристика пастбищно-кормовых условий
2.2. Методика, выделения субклеточных фракций ... 40
2.3. Гель-фильтрация цитозоля печени каракульских овец 45
2.4. Атомно-абсорбционный анализ содержания меди и цинка 45
2.5. Определение активности ферментов и содержание металлотионеина . 47
2.6. Статистическая обработка .48
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 49
3.1. Содержание меди в печени каракульских овец в условиях физиологической нормы 49
3.1.1. Распределение меди в субклеточных фракциях печени 49
3.1.2. Медь в митохондриях и ядерной фракции. ... 54
3.1.3. Распределение меди в субмитохондриальных фракциях 59
3.1.4. Медь в белковых фракциях цитозоля 61-
3.2. Содержание меди в печени каракульских овец
при медной недостаточности 65
3.2.1. Энзоотическая атаксия 65
3.2.2. Содержание меди в субклеточных фракциях гепа-тоцитов при медной недостаточности 66
3.2.3. Содержание меди и активность некоторых маркерных энзимов в субмитохондриальных фракциях..68
3.2.4. Медь в белковых фракциях цитозоля 69
3.2.5. Цинк в белковых фракциях цитозоля .77
3.2.6. Изменение активности ферментов в крови овец
при дефиците меди ....... 82
3.3. Содержание меди в печени каракульских овец при
эндемической иктерогемоглобинурии 86
3.3.1. Эндемическая иктерогемоглобинурия 86
3.3.2. Содержание меди в субклеточных фракциях ге-патоцитов . 88
3.3.3. Содержание меди в белках цитозоля ...... 97
3.3.4. Содержание меди и нуклеиновых кислот в органах и тканях 101
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 104
ВЫВОДЫ ИЗ
ПРАКТИЧЕСКОЕ ПРИЛОЖЕНИЕ 115
СПИСОК "ЛИТЕРАТУРЫ 117
- Биологическая роль меди в организме животных
- Экспериментальные животные и краткая характеристика пастбищно-кормовых условий
- Содержание меди в печени каракульских овец в условиях физиологической нормы
Введение к работе
Директивами ХХУІ съезда КПСС, Продовольственной программой СССР на период до 1990 года поставлена задача всемерного повышения продуктивности животноводства. Немалый вклад в реализацию этой общенародной задачи призвано осуществить каракулеводство, являющееся важной сельскохозяйственной отраслью республик Средней Азии и Казахстана. Его дальнейшее развитие самым тесным образом связано с совершенствованием технологии производства, разработкой научных основ полноценного кормления каракульских овец, максимального использования биологического потенциала их продуктивности на основе достижений совеременной науки, предотвращеншмшотерь, вызываемых различными заболеваниями. Перечисленные аспекты повышения эффективности каракулеводства особенно актуальны для Узбекской ССР, значительная часть территории которой характеризуется несбалансированностью пастбищного рациона по ряду макро- и микроэлементов, обусловливающей снижение продуктивности животных и поражение их эпидемическими заболеваниями. Особый интерес в этой связи по прежнему представляют вопросы, связанные с обменом меди у каракульских овец, которые, как известно, нередко все еще страдают от недостатка или избытка этого микроэлемента в организме.
Роль меди в кормлении каракульских овец в значительной степени раскрыта в работах Риша (42), Махмудова (31), Егорова (21), Даминова (18), Абдуллаева (I) и др. Эти исследования ка-сались установления биогеохимических провинций, сбалансированности рациона по меди, физиологических параметров и особенностей распределения металла между органами и тканями в норме, а также при нарушениях его обмена. В меньшей степени расшифрова- ны интимные механизмы внутриклеточного метаболизма меди в печени - основном органе, регулирующем обмен этого элемента во всем организме. В то же время широкое распространение на территории Узбекистана явлений медной недостаточности и гепатогенного медного отравления каракульских овец настоятельно требует проведения таких исследований.
Это обстоятельство, на наш взгляд, определяет актуальность изучения распределения меди и медьсодержащих белков и ферментов в субклеточных компонентах печеночной ткани, их роль в метаболизме меди в норме, при гипо- и гиперкупрозе. Решение этих вопросов позволит более детально понять патогенетические механизмы, лежащие в основе развития нарушений обмена меди у каракульских овец, будет способствовать разработке надежных методов их диагностики и профилактики.
В настоящей работе излагаются особенности распределения меди в субклеточных фракциях печени, функциональная обособленность и взаимосвязь внутриклеточных компонентов гепатоцита в метаболизме меди; участие каждой из субмитохондриальных фракций, белков цитозоля и некоторых медьсодержащих ферментов в обмене меди в организме каракульских овец в условиях физиологической нормы, при гипо- и гиперкупрозе; рассматриваются некоторые аспекты механизма нарушения гепатоцитарного гомеоста-за меди.
На защиту выносится следующее:
I. Особенности распределения меди в субклеточных фракциях печени каракульских овец в условиях физиологической нормы, при медной недостаточности и при избытке меди в их организме.
Роль фракций гепатоцита в гомеостазе меди в печени каракульских овец.
Характеристика белков гиалоплазмы печени каракульских овец в условиях физиологической нормы и при нарушениях медного обмена и их связь с обменом меди в организме,
Активность медьсодержащих ферментов-церулоплазмина, цитохромоксидазы и супероксиддисмутазы в сыворотке крови, эритроцитах, цитозоле печени и их коррелятивная взаимосвязь с содержанием меди в крови и печени,
Особенности обмена нуклеиновых кислот при эндемической интерогемоглобинурии каракульских овец.
I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
I.I. Биологическая роль меди в организме животных
Медь играет важную роль в жизнедеятельности всех организмов. Первые сведения об обнаружении меди в растениях и в животных тканях относятся к XIX столетию, но лишь в первой половине XX века сложилось представление о меди, как о жизненно необходимом для животного организма элементе, когда Харт и сотр., (121) доказали, что недостаток меди в рационе крыс обусловливает развитие у них так назьшаемой "молочной" анемии, связанной с участием меди в процессах кроветворения и использования железа в организме.
Заболевания, непосредственно связанные с недостатком меди в организме, были описаны у крупного рогатого скота (200) и овец (64). Аналогичные заболевания описаны у овец также в СССР (3*25,29,21,42).
Изучение явлений медной недостаточности дало возможность установить широкое участие меди в осуществлении физиологических процессов в животном организме. Так, помимо отмеченной выше роли меди в кроветворении было доказано, что она незаменима для синтеза меланина и кератинизации шерсти, миелинизации спинного мозга и остеогенеза, для образования соединительной ткани, нормального функционирования сердечно-сосудистой системы, для воспроизводительной функции и процессов биологического окисления (64,154,141,109,119,9,82,21,37,т,187,3,218).
Медь образует устойчивые комплексы с органическими компонентами биологических жидкостей и внутриклеточных образований - аминокислотами, пуринами, пиримидинами, нуклеотидами,
ДНК, РЖ и белками (149,156,157,218,101,27).
I.I.I.Медьсодержащие ферменты
Функциональная активность меди обувловлена тем, что она является составной частью молекулярной структуры ряда ферментов, ответственных за окислительно-восстановительные процессы и осуществление тканевого дыхания.
К числу медьсодержащих ферментов относятся: цитохромокси-даза (к.ф.1.9.3.1), ортодифенолоксидаза (тирозиназа,к.ф.1.14. 18.I), дофамин - в гидроксилаза (к.ф.1.14.17.I); ферменты, окисляющие моно- и диамины в соответствующие альдегиды (к.ф. 1.4.3.6); ксантиноксидаза кишечника крупного рогатого скота (к.ф. 1.2.3.2), уратоксидаза (к.ф.1.7.3.3.); супероксиддисму-таза (к.ф. I.I5.I.I.), церулоплазмин (ферроксидаза, к.ф.1.16. 3.1.) и др. Всего в настоящее время известно свыше 30 медьсодержащих белков и ферментов, которые прочно удерживают в своей молекуле ионы меди. Наиболее изученные из этих ферментов приведены в таблице I.
Церулоплазмин был выделен 37 лет тому назад из плазмы крови свиней Холмбергом и Лауреллом (129,130), которые показали также связь этого белка с оксидазной активностью крови. Церулоплазмин - полифункциональный белок. Он окисляет двухвалентное железо, выступая как ферроксидаза, мобилизирующая железо из его тканевых депо и способствующая насыщению этим элементом трансферрина (131), что дает основание считать данный белок основным звеном, связывающим обмен меди и железа. Церулоплазмин играет также роль транспортного белка, поставляя медь или медьсодержащую субъединицу для синтеза цитохромоксидазы,
Таблица I
Некоторые медьсодержащие ферменты животных
Фермент и его кофактор :Источник зы-: деления
Содержание меди % к : атом / белку : мол. :Молеку-":лярныи : вес
Катализируемая:Литера-реакция :турный :источ- : ник
Ксантиноксидаза (железо '+ ФАД) (к.ф. 1.2.3.2)
Аминоксидаза (к.ф.1.4.3.6)
Бензиламиноксидаза (к.ф.1.4.3.6)
Судероксиддисмутаза (к.ф.1.15.1.1)
Диаминоксидаза (к.ФД.4.3.6) (пи-ридбксальфосфат)
Лизиноксидаза (к.ф.1.4.3.6)
17 мкг г
Крупный рогатый скот: стенка тонкого кишечника
Плазма крупного 0,09 рогатого скота
4 236000 Ксаятин-гидоксан- (190) тин мочевая кис- лота
4 255000 Окисление алибв- (237) тических моноами- нов в альдегиды
4 195000 Дисмутация супер- (73) оксидного анион- радикала (149)
130000 Диамины, гистамин (166) альдегиды
Пептидносвязанный (56,83) лизин гидроксили- -зин.Образование десмозина и изо-десмозина.
134000 ^4000
I :2 :3
Уратоксидаза Печень 0,06 (к.$.1.7.3.3)
Цитохромоксидаза Сердце,печень 0,09 (гемдк.ф.1.9.3.1)
Дифенилоксидаза Млекопитающие: (к.ф.І.ІО.З.І) коза, меланома
Це рулоплазмин 0,28 (Фёвоксидаза I) (к.ф.І.Іб.З.І)
Феррооксидаза П Сыворотка 0,8 (к.ф.1.16.31) крови
Тирозиназа Насекомые (к.ф.І.І4.І8.І)
Дофамин- в-гидрок- Печень 1,6 сидаза (аскорбиновая кислотадк.ф. I.14.2.1)
Триптосбая-2,3-ди- Цитозоль пе-оксигеназа (к.ф. чени крыс І.ІЗ.11.11)«
Мочевая кислота- (147) аллантоин
Окисление восста- (217) новленного ЦИТ0- хрома
Окисление тирози- (72) на,дифенолов, об- разование меланина
Окисление аромати- (146. ческих аминов, фе- -191) нолов и др.веществ
Перевод П валент- (67) ного Fe в III Ре и в трансферрин
Окисление тирози- (202) на,дифенолов,обра- зозание меланина
Дофамин-норадрена- (ИЗ) лин
160000 Перенос кислорода (69) в пиррольное коль- - цо триптофана ^JLU "* а по некоторым данным (150,106 ), для супероксиддисмутазы и некоторых других медьсодержащих ферментов. Он может иметь также значение в балансе биогенных аминов в организме млекопитающих, действуя как оксидаза на адреналин и серотонин (54).
Цитохромоксидаза. Наличие меди в цитохромоксидазе было обнаружено Кейлином и Хартри (139). По современным данным, "единица" цитохромоксидазы состоит из цитохромов а и а 3, каждый из которых связан с одним атомом меди. Она является терминальным ферментом в цепи дыхательных катализаторов и играет ключевую роль в процессах дыхания и окислительного фосфо-рилирования.
Аминооксидазы. По современным представлениям, аминоокси-дазы являются неоднородной группой ферментов. По классификации Горкина (16), их подразделяют на моноаминоксидазы митохондрий, диаминоксидазы, аминоксидазы плазмы крови и лизилоксидазы.
Митохондриальная моноаминокоидаза (к.ф.1.4.3.4.), полученная в высокоочищенном виде из печени различных видов животных, является флавопротеидом с молекулярным весом 64000 (170).
Этот фермент представлен двумя типами (А и Б). Оба типа имеют по 8 сульфгидрильных групп, связаны с мембранами (на 80 процентов с митохондриальными). Присутствие меди в этом ферменте, предполагавшееся ранее, в настоящее время оспаривается. Возможно присутствие железа. Общими субстратами этой группы аминоксидаз являются триптамин, тирамин, дофамин.
Моноаминокоидаза типа А обладает способностью окислять серотонин, норадреналин и ингибироваться низкой концентрацией хлоргилина, а моноаминокоидаза типа Б - окисляет бензиламин, фенилэтиламин и ингибируется депренилом. - II -
Диаминоксидаза (к.ф. 1.4.3,6) была получена в чистом виде Ямадой и сотр. (238), которые описали ее, как розовый медь-протеид, содержащий 2,17 атома меди на молекулу, способный окислять гистамин, кадаверин, путресцин. В качестве простети-ческой группы этот фермент содержит пиридоксальфосфат. Его ингибиторами являются гидроксиламин, изониазид, семикарбазид, карбонильные реагенты, аминогуанидины. Диаминоксидаза встречается в сыворотке крови,
Аминоксидазы плазмы крови, не идентичные ни с МО, ни с ДАО, окисляют спермин, спермидин, бензиламин. Установлено наличие в их молекуле меди и сульфгидрильных групп. Их ингибиторами являются карбонильный реагент семикарбазид, в связи с чем можно предполагать, что в их молекуле также присутствует пиро-доксальфосфат.
Лизилокоидаза ~ медьсодержащий фермент, присутствующий в соединительной ткани. В его составе коферментов и сульфгидрильных групп не выявлено.
Биологическая роль лизилоксидазы заключается в окислительном дезаминировании - аминогрупп лизина соединительной ткани, за которым следует образование десмозина и изодесмози-на-аминокислот, обеспечивающих поперечную сшивку молекул эластина (56,82,83).
Хрупкость костной ткани и скелеточных образований у животных, отмечаемая при медной недостаточности, объясняется непрочностью поперечных связей в коллагене, вызванной дефицитом меди и угнетением синтеза лизилоксидазы (127).
Тирозианаза - участвует в реакциях пигментообразования, катализируя первые две стадии синтеза меланинового пигмента из тирозина (141). Через эту функцию тирозиназы проявляется роль меди в меланогенезе, а также в депигментации шерсти, наблюдаемой у овец при медной недостаточности (101,218).
Супероксиддиомутаза представляет собой синий белок, содержащий в своем составе медь и цинк и катализирующий дисмута-цию анион радикала 02 согласно уравнению:
202 + 2Н+ = Н202 + 02
Этот фермент в зависимости от места обнаружения (эритроциты, головной мозг, печень, плацента) прежде именовался эритро-, церебро-, гепато- и плацентокупреином (149,153,135). Он выпол-няет жизненно-важную роль в защите клетки от губительного влияния супероксидного радикала 02, образующегося при фермента-тивном окислении некоторых субстратов.
Дофамин - д - гидроксилаза. Этот металлопротеид является оксидазой (ИЗ), содержащей от 4 до 7 атомов меди на молекулу, с молекулярным весом 290000 (107). Он выделен из надпочечников мозга и сердца крупного рогатого скота, и, по-видимому, играет роль в преобразовании дофамина в норадреналин (172, 173).
Триптофан-2,3~диоксигеназа « гемсодержащий протеид имеет молекулярную массу 160000 и 2 атома меди на молекулу, выделен из цитозоля печени крыс. Согласно Брэди (69), он катали-зирует включение молекулярного кислорода в пиррольное кольцо -- триптофана. ферроокоидаза П обнаружена в плазме крови человека Топ-хемом и Фриденом (216). Доказано, что она обладает в обычных условиях 7 % общей феррооксидазной активностью. Молекулярный - ІЗ - вес феррооксидазы П 800000 и содержание меди 0,8 % .Катализирует реакцию перевода двухвалентного железа в трехвалентное и реакцию переноса трехвалентного железа на трансферрин.
1.1,2» Неферментативные медьсодержащие белки
Металлотионеин. Это название было дано Кэгги и Вэлли (138) белку, выделенному из почек лошадей и человека, с молекулярной массой около 10 тыс. дальтон и содержанием 26 сульф-гидрильных групп на молекулу, способному связывать большое количество (до 8% ) меди, кадмия и цинка. Металлотионеин не является ферментом. Благодаря высокому содержанию сульфгидриль-ных групп он связывает медь с образованием меркаптидов. Он может представлять собой не индивидуальный белок, а группу близ-ких белков, специфически предназначенных для связывания различных металлов.
Необычный вариант металлотионеияа, получивший название митохондрокупреина новорожденных, был выделен из печени телят и новорожденных детей (179,180). Он содержит 2Ь% цистеина и около 4% меди. Его количество возрастает незадолго до рождения и быстро снижается в течение первых месяцев постнатальной жизни. Этот белок концентрируется в тяжелой митохондриальной фракции, но не является истинным компонентом митохондрий, поскольку присутствует в "тяжелых" лизосомах и представляет собой, по-видимому, полимер металлотионеина.
Альбокупреин I и П.Эти два бесцветных купропротеида, не обладающие ферментативной активностью, были выделены из мозга человека (108), содержат гексозы. - 14 - ,
1.2. Содержание и обмен меди в животном организме
Содержание микроэлемента в органах и тканях животных представляет собой важную характеристику его физиологической функции и роли органа в процессах обмена данного элементарно является отправным критерием при оценке микроэлементного статуса организма животных в конкретных природно-хозяйственных ситуациях и для диагностики гипо- и гиперэлементозов.
I.2.I. Содержание меди
Содержание меди в целом организме человека и сельскохозяйственных животных представлено в таблице 2. Из таблицы 2 видно, что у человека, крупного рогатого скота и свиней содер-
Таблица 2
Содержание меди в организме человека и животных* жание меди в организме с возрастом снижается за счет увеличения мышечной массы и снижения концентрации меди в основном х) По данным Андервуда (218). депо этого элемента - печени, где концентрация меди у новорожденных в 4-6 раз превышает таковую у взрослых животных. Близкие величины получены и для других животных - кошек, кроликов, крыс (218).
Исключение из общей закономерности составляют овцы, у которых с возрастом концентрация меди в организме повышается. Это отличие от большинства других видов животных и человека объясняется,во-первых, тем, что в печени овец уровень меди с возрастом не понижается, а, напротив, увеличивается в 3-4 раза, достигая, в среднем, 80 мг/кг, против 20 мг/кг свежей ткани у новорожденных. При средней массе этого органа,, равной 750 г, количество меди в нем достигает 60 мг, что составляет 50 % всей меди организма. Во-вторых, овцы имеют высокое содержание меди в шерсти, которое при среднем настриге 3 кг составляет около 24 мг. Обе эти ткани содержат 67% всей меди организма, а на долю остальных органов и тканей приходится, примерно, 0,82 мг/кг этого элемента.
Для человека весом 70 кг, по данным Картраита и сотр. (86), общее количество меди в организме составляет в среднем 80 мг и концентрация этого элемента - 1,15 мг/кг. По данным Чоу и сотр. (87), содержание меди в организме человека выше и составляет 100-150 мг, что соответствует концентрации этого элемента в тканях, равной 1,4-2,1 мг/кг, из которой на долю мышц приходится 65 мг, а на долю костей - 23 мг.
В крови медь присутствует в составе медьсодержащих белков, аминокислот и альбумина. У человека и крыс свыше 90% меди плазмы крови входит в состав церулоплазмина, остальное количество (4-8% ) приходится на так называемую "рыхло" свя- занную медь, находящуюся в комплексе с аминокислотами и альбумином,
У каракульских овец на долю церулоплазмина приходится 29-74$ сывороточной меди, причем количество ее зависит от сезона года и срока суягности. Другая часть "прочно" связанной меди, называемая иногда "остаточной" медью, количество которой составляет 18-40$ , представляет собой медь, входящую в состав аминоксидазы (10). Остальное количество (8-28$ ) прихо-дится на "рыхло" связанную медь. Таким образом, в отличие от человека и крыс в крови жвачных и свиней присутствует не две, а три основные формы меди - "прочно", "рыхло" связанные и "остаточная".
Из биологических жидкостей наиболее богата по содержанию меди желчь, с которой у здоровых животных выделяется основное количество эндогенной меди. Желчь свиней наиболее богата медью, которая превышает по этому показателю желчь жвачных пояти в 3 раза. В связи с этим печень жвачных накапливает в обычных условиях более высокие концентрации меди, чем печень свиней. Свинья очень эффективно избавляется от избытка меди, поэтому у этого вида животных случаи медного отравления, как правило, не наблюдаются. В то же время организм овец при сравнительно небольшом повышении содержания меди в рационе оказывается не в состоянии выделить ее избыточное количество, и они в большей степени, чем другие животные, подвержены медному токсикозу. Медное отравление у крупного рогатого скота довольно редкое явление и наблюдается только у молодых животных.
Содержание меди в моче наиболее высоко у свиней, у которых оно в 3 раза Еыше, чем у овец, и более чем в 1,5 раза выше, чем у крупного рогатого окота. Овцы, в нормальных условиях выделяют с мочой ОД мг меди в сутки.
К числу органов и тканей, относительно богатых медью,относятся печень, шерсть, мозг, почки, сердце. Если в селезенке, гладких и поперечно-полосатых мышцах, стенках желудочно-кишечного тракта, зобной, щитовидной железах, кости и некоторых других органах и тканях содержание меди почти не обнаруживает видовых особенностей, то печени каждого вида животных свойственна вполне определенная концентрация этого элемента. Наиболее высока она у овец, у которых она в среднем составляет 80 мг/кг (42). Несколько меньше меди в печени крупного рогато-го скота.
Второе место после печени по содержанию меди в организме занимает центральная нервная система, в которой наивысшее содержание меди обнаружено в головном мозге и мозжечке (42,58)»
Богаты медью эпидермальные образования - шерсть, щетина, перья. На содержание этого элемента в шерсти влияют возраст и кормовые факторы (58), и в условиях нормального кормления оно составляет у животных 8-Ю мг/кг.
У всех исследованных животных обнаружено повышенное содержание меди в сердечной мышце, которое у овец и крупного рогатого скота близко к 3 мг/кг , а у свиней ~ выше этого значения в 1,5 раза. Повышенное содержание меди в сердечной мышце связано, по-видимому, с высоким содержанием в этом органе ци~ тохромоксидазы. Из желез внутренней секреции наивысшее содержание меди обнаружено в гипофизе, затем идут надпочечники, щитовидная железа и яичники. Мало меди в поджелудочной и зобной железах (42,176).
Каракульские овцы по распределению меди в организме не имеют особых отличий от других пород овец. У них также наивысшее количество меди обнаружено в печени и шерсти (40,42,1).Далее в порядке убывания следует нервная ткань, легкие, почки. Мышечная ткань бедна медью, кроме сердечной мышцы, где концентрация этого элемента равна 3,0 + 0,3 мг/кг. Распределение меди в желудочно-кишечном тракте неравномерно: наименьшее количество ее обнаружено в преджелудках и сычуге. Бедны медью скелет и кожа. В крови, в среднем, обнаружено 0,9+0,02 , желчи - 0,5 + 0,002 и молоке - 0,2 + 0,02 мг/кг, а в моче 0,05> ±0,01 мг/л.
В организме каракульской овцы содержится около 125 мг меди, 54$ которой концентрируется в печени; 16 % в скелетной мускулатуре, 10-12$ в скелете и почти столько же в шкуре (с шерстью), 4$ в желудочно-кишечном тракте и 5 % в остальных органах и тканях (42,1).
У новорожденного каракульского ягненка содержится 8 мг меди и картина ее распределения между органами и тканями несколько иная: в печени - 34 %% скелетной мускулатуре - 21 %, шкуре - 23$ , скелете - 18 % , желудочно-кишечном тракте - 2% и в остальных органах и тканях - 4% от общего содержания меди в организме.
1.2.2. Обмен меди
Поступающая в организм животного медь претерпевает всасывание, промежуточный обмен и выделение.
Всасывание меди. Исследования, проведенные с применени-ем радиоактивной меди ( Си, ^би), показали, что, попадая с пищей в желудочно-кишечный тракт, она освобождается в ионной форме или в виде координационных комплексов с аминокислотами и другими лигандами пищи. У человека всасывание происходит, главным образом, уже в желудке и в верхней части тонкого кишечника, где преобладает кислая реакция среды (99,100,101). У свиней всасывание меди происходит в тонком, а у овец значительная часть меди всасывается в толстом кишечнике (116), а по данным Георгиевского и в тонком его отделе.(13).
Всасывание меди осуществляется в виде ее комплексов с аминокислотами, главным образом с гистидином. Внутри всасывающих клеток присутствуют металлотионеин или металлотионеинподоб-ные белки, богатые сульфгидрильными группами, которые связывают медь путем образования меркаптидов. Поскольку этот купро-протеид служит в качестве депо меди, а также освобождает медь на серозной стороне клеточной мембраны, то предполагается, что он играет роль защитного и регуляторного механизма в гомеостазе меди (163,169), способствуя депонированию меди при ее избыт-ке в клетке и замедляя ее перенос на транспортную систему крови (117).
Перенос меди на серозную сторону эпителия из ее комплексных соединений с аминокислотами, поступающими из просвета кишечника или образующимися внутри клетки по мере диссоциаций меди из кишечного металдотианеина, требует затраты метаболической энергии (101). Степень всасывания меди зависит от количества и химической формы поступающей меди и от количества других металлов, органических веществ, а также от возраста животных (218).
Различные соединения, присутствующие в кишечнике или внутри слизистой, играют заметную роль в процессах всасывания меди» Элементы первой и второй переходных групп, такие, как кадмий, ртуть, серебро и цинк, имеющие сходную с медью электронную конфигурацию, конкурируют с ней за участки связывания на слизистой и в металлотионеине (101). Сульфаты, молибден и кадмий препятствуют всасыванию меди, нарушая, по-видимому, её проникновение через клеточные мембраны (95,13). Фитиновая кислота, присутствующая в белке растительного происхождения (соевый, хлопковый жмых), и сульфиды образуют труднодоступные для организма соединения с медью (26). Мешает всасыванию этого металла также кальций, который, повышая рН содержимого желудочно-кишечного тракта, превращает медь в труднорастворимый гидрат окиси (212).
В зависимости от присутствия и соотношения указанных соединений и форм самой меди ее всасывание в желудочно-кишечном тракте может составлять 5-30$ и более от общего количества этого элемента в корме (81).
Промежуточный обмен меди начинается с поступления меди из кишечника в плазму крови, где она рыхло связывается с альбумином сыворотки крови, в этой форме достигает тканей и легко может проникать в эритроциты.
Перенос всосавшейся меди в печень - главный орган, ответственный за метаболизм этого элемента, осуществляется, в основном, альбумином (60 % )и аминокислотами (так называемая "рыхло" связанная медь). Там она включается в митохондрии, микросомы, ядра и растворимую фракцию паренхиматозных клеток в соотношении, меняющимся с возрастом (118,180), видом (211) и медным статусом животного (118,164).
В микросомах печени происходит образование церулоплаз-мина - медьпротеида, содержащего основное количество меди плазмы крови, металлотионеина и супероксиддисмутазы, включающей основную медь эритроцитов. Печень является центральным органом промежуточного обмена меди. Кроме синтеза церулоплазми-на и медьтионеина в ней также осуществляется связывание меди в недиализируемое белковое соединение, выделяемое с желчью и препятствующее обратному всасыванию меди из кишечного тракта. Из металлотионеина медь поступает в лизосомы, идет на синтез церулоплазмина и других ферментов или белковых компонентов, выделяемых с желчью (218). В связи с высокой металлсвязываю-щей способностью металлотионеина его в настоящее время считают основным белком, депонирующим медь в печени (101). Эта способность лежит в основе защитных гомеостатических механизмов при избыточном накоплении меди в печени, как, например, при болезни Вильсона и медном отравлении животных.
Выделение меди. Медь с мочой выделяется в очень незначительном количестве. Фекальное выделение меди представляет собой сумму невсосавшейся пищевой меди и меди, выделившейся через желчный тракт (преобладающая фракция), слюнные железы,кишечную и желудочную слизистые, за вычетом меди, которая подвергается реабсорбции в процессе ее прохождения через желудочно-кишечный тракт. Кроме этого возможна потеря меди через пот и менструальную кровь. Желчная экскреция служит главным путем выделения меди у человека (86), свиней, собак (68,148), мышей (ПО), уток и кур (61).
Медь также выделяется со слюной, находясь в ней в лабильной связи с низкомолекулярными комплексами, и ее количество может достичь 0,38-0,47 мг в сутки. Лабильная форма слюнной меди сохраняется при прохождении через желудок до места всасывания в тонком кишечнике. Слизистые желудка и 12-перстной кишки принимают активное участие в секретировании меди в виде медных комплексов низкого молекулярного веса (114). Установлено, что у человека слизистая желудка секретирует в сутки около I мг меди. Некоторое количество меди выделяется в результате слущивания эпителиальных клеток кишечной слизистой. В этих клетках присутствует значительное количество меди, связанной с металлотионеином или металлотионеиноподобными белками, выполняющими функцию депо меди, а также защищающие организм от избыточного ее поступления. Количество выделяемой таким образом меди может составить 17 % от ее суточного выделения с калом (120). Физиологический распад церулоплазмина слу-жиг источником примерно 0,1 мг меди в суточном количестве, выделяемом с калом (224).
Выделение меди с мочой составляет от 0,3 до 0,5 % ее суточного поступления. Здесь необходимо также упомянуть, что почки обладают, по-видимому, способностью к тубулярной реаб-сорбции меди. Выделение меди с потом считалось незначительным (218), но новые данные показывают, что с потом теряется значительно большее количество меди, чем ранее предполагалось. Консалазио и сотр. (88) сообщили, что при поступлении меди с пищей, равном 3,5 мг в сутки, при температуре 37,8 и влажности окружающей'среды 50$ потери меди в течение 10 дней у здоровых людей с потом составили 1,6 мг или 46$ меди. Отрицательный баланс меди при этом составил 0,1 мг в сутки.
С нормальной менструальной кровью по данным Олсона и Даума (175) выводится, в среднем, 0,47 мг меди. С молоком у женщин выводится около 0,4 мг меди в сутки (142).
1.2.3. Типы обмена меди
В способности печени накапливать медь существуют определенные видовые особенности, позволяющие различать у теплокровных несколько типов медного обмена (62).
Своеобразным типом обмена меди обладают овцы. Их печень накапливает медь в большом количестве (до 100-400 мг/кг су-хого веса) при нормальном потреблении ее с кормом. У них избыток меди с трудом выводится из организма и вызывает прогрессирующее накопление этого микроэлемента в печени. У крупного рогатого скота, по сравнению с овцами, поступление меди в организм и уровень накопления ее печенью регулируется значительно в большей степени. Печень уток тоже очень богата медью (80--500 мг/кг), но при повышенном содержании ее в рационе она не накапливается в организме и быстро выделяется из него.
Другой тип медного обмена отмечен у человека и у большинства исследованных видов животных - свиней, кроликов, крыс, мышей и кур. У них при сравнительно низкой концентрации меди в печени (до 30 мг/кг) даже при повышенном потреблении меди ее уровень в печени не изменяется.
1.3. Роль печени в метаболизме меди
Как было отмечено выше, печень главный орган, выполняющий функцию депо и регулятора обмена меди.
Поступившая в печень медь подвергается сложным превращениям, участвуя в ряде метаболических процессов, обеспечивающих ее обменное равновесие в печеночных клетках. В печени осуществляется, по меньшей мере, три ответственнейших этапа обмена меди: экскреция с желчью, депонирование для нужд организма, включение в церулоплазмин и другие медьсодержащие энзимы (цитохромоксидаза, супероксиддисмутаза и др.) (122).
Связанная с аминокислотами печеночная медь, вероятно, представляет собой одну из форм, в виде которой медь поступает в желчные протоки. Другая форма - Си -тюшеин, удаляемый путем экзоцигоза.
1.3.I. Внутриклеточное распределение меди в печени
Первые данные о медьдепонирующей функции печени были связаны с выделением медьсодержащего белка гепатокупреина из печеночной ткани млекопитающих (149) с молекулярной массой около 30000, содержащего от 0,3 до 0,4 % меди. Затем аналогичный белок был выделен из печени человека (181,182,183,84).
Долгое время физиологическую функцию этого йелка объясняли исключительно депонированием меди в печени. Но затем было показано, что гепатокулреия обладает ферментативными свойствами, и его, аналогично эритрокупреину и цереброкупреину, следует идентифицировать как супероксиддисмутазу (84,156,157,101).
Медь депонируется во всех субклеточных фракциях гепато-цита в количествах, необходимых для участия металла в синтезе медьсодержащих энзимов и специфических медьсодержащих белков (101).
Внутриклеточное распределение меди в печени наиболее подробно изучено у человека и крыс. По данным ряда авторов, у взрослых крыс более половины печеночной меди концентрируется в цитоплазме, затем в порядке убывания содержания меди следуют фракции митохондрий, ядер и микросом (таблица 3).
Таблица 3
Внутриклеточное распределение меди в печени животных и человека (в проц.)
Фракции :В среднем гепатоцита :?„Уй?Л0ПИ" м тающих з, : Iй
Человек 'Новорожденные дети: Крысы [х ! 3х :4х :5х
Ядерная 20,0 8,9 20,3 20,3 20,0
Митохондрии 20,0 16,1 8,2 12,4 42,0
Микросомаль- ная 10,0 10,7 5,0 13,9 8,0
Цитозоль 50,0 63,7 63,3 53,4 30,0
Iх - (101) ; 2К - (180); 3* - (118) ; 4х - (211) ; 5х - (164),
Для новорожденных характерно преимущественное накопление меди во фракции крупных гранул, третья часть ее приходится на цитоплазму, около 20$ содержится в ядрах и 8 % в микросомах. Исследованиями последних лет установлено, что до 70 % меди, которая ранее приписывалась митохондриальной фракции печени новорожденных, присутствует в составе тяжелых ЛИ30С0М.
Медь, локализованная в микросомах, вероятно входит в 'состав вновь синтезируемых медьсодержащих белков, переносимых затем в другие субклеточные фракции (231,232). Ядра гепатоцитов служат местом временного отложения меди, которая включается в состав ДНК (65). Лизосомы печени захватывают избыток меди и передают ее для экскреции желчью. Как уже отмечалось, основные гомеостатические процессы, связанные с этим металлом, происходят в цитоплазме гепатоцитов при участии мета ллотионеина.
1.3.2. Гомеостаз меди в организме животных и человека
Уровень меди в печени в условиях физиологической нормы сохраняется в определенных пределах, обусловленных видом животных и их возрастом. Тем не менее, несмотря на стойкие гомеостатические механизмы, лежащие в основе динамичного балансирования содержания меди в печеночной ткани, оно подвержено значительным котбаадем,вызванным условиями питания, физиологическим антагонизмом меди с другими металлами, различными патологическими факторами, в том числе болезнями, связанными с рецессивной наследственностью.
Нарушение обмена меди тесно связано прямой зависимостью с уровнем меди в рационе животных. При длительном недостаточном поступлении с кормом происходит достоверное уменьшение концентрации меди в печени крыс, свиней (192,234), собак (60), овец и крупного рогатого скота (59). Введение меди в рацион таких животных незамедлительно сопровождается достоверным повышением ее концентрации в печеночной ткани (218). і— * 27 —
У всех животных продолжительное поглощение меди свыше потребности приводит к ее накоплению в печени. У овец и крупного рогатого скота чрезмерное накопление меди в печени приводит к катастрофическому высвобождению этого элемента в кровь, сопровождающемуся гемолизом и желтухой. Гемолитическая желтуха не наблюдается у крысы, кроликов, свиней и птиц (101), но у последних обнаруживается понос и "бледное, взъерошенное оперение" (233). Немаловажное значение для сохранения нормального уровня меди в печени играет сбалансированность рациона по переваримому протеину. Высокий уровень протеина в рационе способствует уменьшению запасов меди в печени овец (96,236) и тормозит ее накопление в печени крыс и свиней (155,205).
Снижение количества меди в печени может наступать при скармливании цыплятам и кроликам аскорбиновой кислоты (126, 132,133), а также при наличии в рационах животных органических соединений, образующих с медью комплексы, недоступные для животного организма (161,162, 230,26).
Обмен и депонирование меди в печени тесно связаны с содержанием в рационе животных некоторых макро- и микроэлементов, проявляющих по отношению к меди в животном организме физиологический антагонизм. К ним прежде всего относится молибден, повышенное потребление которого с кормом обусловливает значительное снижение содержания меди в печени овец и крупного рогатого скота (92). Физиологический антагонизм молибдена наиболее выражен в присутствии неорганических сульфатов в рационе (93,95,41,42). Так при соотношении меди к молибдену 1:1 и 0,1-0,2$ содержании сульфатов у овец происходит истощение запасов меди в печени и развиваются явления медной недоста- - 28 — точности, а при увеличении отношения меди к молибдену 10:1 уровень меди в печени нормализуется и снимаются явления медной недостаточности (21,42,26,218). В сложный физиологический антагонизм с медью в организме животных, начиная от ее всасывания до распределения в клетках печени, вступают сульфиды (94,123), карбонаты (92), соединения железа (63), марганец (96), свинец (24), стронций (36).
Получены доказательства физиологического антагонизма в печени между кадмием, серебром, ртутью, цинком, никелем, кобальтом и медью (231,232,124,125,128,159,221). Этот физиологический антагонизм проявляется в результате конкуренции за связывание с сульфгидрильными группами металлотионеина (100,101). В результате блокируются важные звенья метаболизма меди в организме, ограничивается всасывание и нарушается восполнение ее запасов в печеночной ткани.
Гипофункция щитовидной железы у кроликов приводит к уменьшению содержания меди в крови и в печени (соответственно на 53 % и 30 %) и повышению уровня микроэлемента в поджелудочной железе (на 40$). Противоположная картина наблюдает-ся при тиреотоксикозе: в крови и в печени подопытных животных содержание меди повышается, а в ткани поджелудочной железы понижается (52). У людей встречается нарушение обмена меди, связанное с рецессивной наследственностью, называемой синдромом курчавости волоса Менкеса, проявляющийся замедлением роста, прогрессирующей церебральной дегенерацией и преждевременной смертью. При этой болезни наблюдается крайне низкие концентрации меди в печени, понижение концентрации меди в головном мозге и низкие уровни меди и пониженная активность церулоплазмина в сыворотке крови (218).
1.3.3. Болезнь Вильсона
Характерным примером генетического дефекта гомеостаза меди является встречающаяся у человека болезнь Вильсона (ге-патолентикулярная дегенерация), при которой происходит избыточное накопление меди в печеночной ткани (превышающее норму в 30-50 раз), затем и в центральной нервной системе, глазах (кольца Кайзера-Флайшера, подсолнуховая катаракта), почках и других органах. Заболевание носит аутосомно-рецессивный характер и встречается только у гомозигот, составляющих около 5 человек на миллион.
На первых порах накопление меди протекает бессимптомно и признаки поражения печени проявляются не ранее 6-летнего возраста. Нервные расстройства, как правило, наступает у подростков (с 15 лет) и в юношеском возрасте (204).
Существуют три гипотезы о молекулярных механизмах болезни Вильсона. Самой первой является гипотеза Узмана (219,220), допускавшего, что при ней в печени синтезируется аномальный белок, обладающий повышенным сродством к меди. Считалось, что им могут быть медь-хелатин, белок L-6-Д (167) или аномальная форма металлотионеина с константой связывания меди, в 4 раза большей, чем у здоровых людей (102). Эта гипотеза в настоящее время представляет лишь исторический интерес, а все три постулированных белка оказались артефактами, полученными при выделении металлотионеина в аэробных условиях.
Другая гипотеза, предложенная Гольдфишером и Штернли-L бом (III), относила болезнь Вильсона к лизосомным заболева- - зо - рниям и считала ее основным дефектом неспособность лизосом осуществлять эффективное удаление меди из гепатоцитов и ее транспортировку в желчь.
Согласно третьей гипотезе, которой придерживается большинство исследователей, генетический дефект при болезни Вильсона заключается в нарушении синтеза церулоплазмина на ранней стадии постнатального развития. В результате наступает прогрессирующее накопление меди в печени, ведущее к воспалительным процессам, некрозу гепатоцитов и постнекротическому цирро< зу. Избыток нецерулоплазминовой меди, поступающей в кровяное русло, ведет к ее накоплению в мозге, почках и роговице и их повреждению (28,194,195). Показано, что этот дефект затрагивает нетранслируемую начальную последовательность церулоплаз-миновой мРНК, затрудняя ее связывание с рибосомами (35).
Указанные дефекты вызывают задержку меди в печени и повышенное накопление этого металла в гепатоцитах, различной степени патологию, желтуху и гемолитическую анемию. Последние симптомы представляют собой вторичное явление, наступающее после выделения меди в кровяное русло из перегруженной ею пораженной печени. В связи с тем, что в период гемолитического криза отмечается существенное повышение содержания меди в эритроцитах и числа тел Гейнца, гемолиз приписывают повышенному окислительному стрессу, вызванному избыточным накоплением меди в эритроцитах (91,158).
Предполагается (85,91,158), что желтуха при болезни Вильсона аналогична эндемической желтухе овец, история и природа которой описаны Андервудом (218). Подтверждением этой
, точки зрения является наблюдение, что при медном отравлении - ЗІ -
Гу овец отмечено также образование большего числа телец Гейн-ца, связанных преимущественно с мембраной эритроцитов (201).
1.4. Нарушения обмена меди у овец
У каракульских овец в Узбекской ССР широко распространены нарушения медного обмена, связанные как с недостатком, так и с избытком меди в их организме (21,42,19). Оба эти вида нарушения обмена меди сопровождаются серьезными патологическими отклонениями, приводящими к снижению продуктивности каракульских овец и нередко к их гибели.
1.4.I. Медная недостаточность
У каракульских овец медная недостаточность обусловлена умеренным дефицитом меди и высоким содержанием в пастбищном рационе ее физиологических антагонистов (сульфатов и молибдена) и приурочена к обширным биогеохимическим провинциям Узбекистана (21,42). По тяжести клинического проявления у каракульских овец различают "умеренную" и "выраженную" формы медной недостаточности.
Умеренный дефицит меди в организме каракульских овец наблюдается на пастбищах с песчаными почвами и с питьевой водой повышенной минерализации, сопровождается снижением их продуктивности без проявления специфических клинических признаков медной недостаточности и уменьшением уровня меди в печени в 2-3 раза по сравнению с нормой (42).
На солянково-эфемеровых пастбищах с повышенным содержанием в почвах, растениях и питьевой воде молибдена и суль-— фатов (Голодно-степская биогеохимическая провинция) у кара- - 32 -кульских овец развивается выраженный гипокулроз, при котором количество меди в печени снижается до 2-5 мг/ кг свежей ткани, что в 20-40 раз ниже нормы. В результате у молодняка развивается эндемическая атаксия, анемия, у новорожденных ягнят-- эндемический гепатит (21,42), происходит депигментация шерстного покрова, ухудшается структура волоса и качество завитка (31). По данным Абдуллаева (І), у взрослых овец, пораженных гипокупрозом, в 2,5-3 раза уменьшается содержание меди в организме (40-50 мг). Наряду с резким снижением уровня меди в печени происходит также существенное уменьшение ее количества в остальных органах и тканях. Так, в мышечной и нервной тканях содержание меди уменьшается в 3 раза, в крови и эндокринных железах - в 2 раза, в паренхиматозных органах - на 20-30 % по сравнению с нормой.
Рассматривая биохимические механизмы медной недостаточности каракульских овец, Риш и сотр. (43,44) установили угнетение активности печеночной сульфидоксидазы, сопровождающееся увеличением содержания в печени сульфидов, которые в свою очередь усиливают медную недостаточность (44).
Установлено, что при медной недостаточности у каракульских овец наблюдается снижение концентрации церулоплазмина, угнетение активности моноаминоксидазы, холинэстераз в сыворотке крови, цитохромоксидазы, сукцинатдегидрогеназы в печени и тканях головного мозга, а также увеличение активности сывороточных аминотрансфераз, альдолазы и щелочной фосфатазы (45, 46,47,53,6,7).
Отмеченные нарушения ферментного спектра еще более выражены у каракульских ягнят, больных энзоотической атаксией- - наиболее тяжелой формой медной недостаточности (5,10).
В связи с тем, что сульфиды являются ферментным ядом, ингйбирующим медьсодержащие ферменты (20), высказывается предположение, что угнетение цитохромоксидазы и других ферментов у овец при медной недостаточности обусловлено не только дефицитом меди в организме, но и действием сульфидов, накапливающихся в печени.
1.4.2. Гиперкупроз
Избыточное накопление меди в организме, приводящее к хроническому медному отравлению сельскохозяйственных животных, может быть обусловлено прежде всего потреблением животными в течение длительного периода времени повышенных количеств меди с кормом, питьевой водой, солевыми лизунцами, медьсодержащими препаратами. Такой вид гиперкупроза, называемый собственно хроническим отравлением медью описан у овец (174,24,177,14, 215,218), у крупного рогатого скота (198,218), свиней (198, 213,206,218) и домашней птицы (213, 218).
При несбалансированности кормового рациона по содержанию меди и ее физиологических антагонистов, когда ее уровень в корме нормальный или несколько повышен, а количество молибдена и сульфатов понижено, развивается гиперкупроз, называемый фитогенным хроническим медным отравлением (79,177).
Различают еще один вид гиперкупроза - гепатогенное хроническое медное отравление, описанное только у овец. Оно связано с поеданием пастбищных растений, содержащих пирролизиди-новые алкалоиды (гелиотрин, лазиокаршш, европии, супинин, L—гедиурин, ехиомидин и др.), которые, обладая гепатотоксичес- -. 34 - іким действием, нарушают функциональную деятельность печени, что в свою очередь приводит к избыточному отложению в ней меди (74,75,76,77,78,218). Пастбищные растения при этом содержат нормальное количество меди и ее антагонистов.
Независимо от причин, обусловивших гиперкупроз, у овец . во всех перечисленных выше случаях хронического медного отравления происходит постепенное повышение содержания меди в печеночной ткани до концентраций, в 10-20 раз превышающих нормальные величины, без проявления каких-либо клинических признаков. Затем наступает вторая фаза заболевания - гемолитический криз, вызываемый поступлением в кровяное русло из печени больших количеств меди, что сопровождается массовым лизисом эритроцитов, желтухой, гемоглобинурией. На 1-4 день после появления клинических признаков заболевания животные обычно погибают (154,218).
О серьезном функциональном нарушении печени при гепатогенном гиперкупрозе свидетельствует характерное повышение в крови активности сывороточных аминотрансфераз и лактатдегидро-геназы (188,214).
В Юго-Западных Кызыл-Кумах у каракульских овец постоянно встречается заболевание с признаками желтухи и кровавой мочи. Риш (42), установивший в печени овец, павших от этого заболевания, высокое содержание меди (315,9+ 56,9 мг/кг свежей ткани), впервые высказал предположение о его близости к гепатогенному хроническому медному отравлению, встречающемуся у овец в Австралии. В последующем указанное заболевание каракульских овец было названо эндемической иктерогемоглобинурией, и было показано, что оно непосредственно связано с нарушением обмена меди |в их организме (17,18,19). Помимо избыточного накопления меди із печени, было установлено значительное увеличение ее концентрации в крови больных (4,7 + 0,5 мг/л) и почках павших животных (27,8 + 4,8 мг/кг), а также в сердце (6,03 ± 0,4 мг/кг), легких (7,4 + 0,6 мг/кг), селезенке (9,65 + 0,9 мг/кг), желчи (3,2+0,3 мг/л) и моче (8,15 +1,9 мг/л) (17,18). Было показано , что генерализованная желтуха у больных овец имеет гемолитическую природу, а избыточное накопление меди в печени обусловлено ее функциональной неполноценностью (18).
В специально поставленных экспериментах было показано, что причиной функционального поражения печени и последующего накопления избыточных количеств меди в ней является поедание овцами пастбищного растения гелиотропа волосистоплодного (Heiiotropium dasycarpum ) содержащего алкалоиды (гелио-трин и его Ж -окись) гепатоксического действия (18,33).
Таким образом, было установлено, что эндемическая икте-рогемоглобинурия каракульских овец имеет алкалоидно-медную этиологию и является гепатогенным хроническим медным отравлением. Б то же время биохимические механизмы, лежащие в основе этого тяжелого заболевания нельзя считать полностью выясненными. Остаются неизученными характер субклеточного распределения меди в гепатоцитах, состояние активности медьсодержащих ферментов печени и регуляторных механизмов, отвечающих за гомеостаз меди в организме.
Изучение этих вопросов даст возможность расширить наши представления об особенностях обмена меди в организме, вскрыть патогенетические механизмы развития гипо- и гиперкупроза каракульских овец.
Выяснение интимных механизмов, регулирующих обмен меди в организме животных и человека, связано с изучением внутриклеточного распределения меди в печеночной ткани. Гомеостати-ческие механизмы, лежащие в основе перехода меди из одних субфракций печени в другие представляют большой интерес для раскрытия особенностей обмена этого металла в норме и при патологических состояниях.
2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛВДОВАНЙЙ
2.1» Экспериментальные животные и краткая характеристика пастбищно-кормовых условий
Исследовали печень каракульских овец с нормальным обменом меди в организме, медной недостаточностью и избыточным накоплением меди в печеночной ткани. Для этой цели были взяты клинически здоровые овцы в возрасте 4-5 лет (14 голов) средней упитанности,с живой массой 40-43 кг из совхоза "Каттакурган" Каттакурганского района Самаркандской области УзССР, благополучного по уровню меди в пастбищных кормах (42), расположенного в зоне предгорной полупустыни. Почвы его представлены типичными сероземами на лессе и содержат меди 14-23, молибдена 2,2-2,5 , марганца - 710-740, цинка - 23-52, йода - 1,4-1,8 мг/кг сухой массы.
Основными пастбищно-кормовыми растениями являются белая полынь, верблюжья колючка, эфемеры и эфемероиды (осока, мятлик, мортук, пажитник крупноцветковый), астрагалы и кузиния. По данным Риша и сотр.(48), в среднем укосе весеннего и осеннего травостоя содержится, соответственно, меди - 6,2 и 3,9, молибдена - 2,4*и 2,2, кобальта - 0,4 и 0,33, цинка - 17,3 и 11,3, марганца « 95,6 и 70,0, йода - 0,42 и 0,52 мг/кг сухой массы.
Такой микроэлементый состав кормовых растений является благоприятным для сельскохозяйственных животных. Среднесуточное потребление овцами меди, молибдена и сульфатов составляет 10,8-13,0 мг, 3,1-4,0 мг и 1,4-1,8 г , соответственно. У і. Для взрослых каракульских овец, выпасающихся в этой зоне, характерно содержание меди в печени, равное 78,0+5,7, в почках- '- 3,2+0,3 мг/кг и в крови - 0,9+0,1 мг/л.
Для изучения внутриклеточного распределения меди в печени при гипокупрозе были использованы 4-5 месячные ягнята с живой массой 20-23 кг (5 голов) с типичными признаками энзоотической атаксии (парез задних конечностей, анемия видимых слизистых оболочек), и взрослые каракульские овцы (9 голов) ниже средней упитанности с живой массой 35-37 кг в возрасте 5 лет, из совхоза "Кызыл Черводар" Зааминского района Джизакской области УзССР. Взрослые овцы по уровню меди в печени были условно разделены на 2 группы: с "умеренной" и "выраженной" медной недостаточностью. Совхоз "Кызыл Чарвода-р" расположен в природ-но-хозяйственных условиях медной недостаточности. Почвы ее пастбищной территории характеризуется аллювиальными отложениями, небольшой глубиной залегания грунтовых вод и преобладанием сульфатного засоления. В них содержится меди 30-35, молибдена-- 3,8-4,2, марганца - 600-630, цинка - 77-103, кобальта - 10--13 и йода -0,74-1,1 мг/кг. Растительный покров пастбищ представлен ажреково-эфемерово-солянковой растительностью, включающей прибрежницу солончаковую, мятлик луковичный, осоку толстостолбиковую, костер Дантонии, мортук, пажитник крупноцветный, а также сочные солянки (галохарис, спайноцветник, спайно-плодник, солянку длинностолбиковую). В среднем укосе травостоя содержится меди - 4,8, молибдена - 4,3, кобальта - 0,42, цинка - 19, марганца - 60 и йода - 0,6 мг/кг (48). В целом, пастбища отличаются умеренным дефицитом меди, повышенным содержанием молибдена в растениях и высоким уровнем сульфатов в почве и питьевой воде. В этих условиях овцы потребляют на пастбищах около 12 мг меди, 13 мг молибдена в день при их соотно- тении в суточном рационе 1:1, что при высоком потреблении сульфатов обусловливает у них медную недостаточность» Об этом свидетельствует низкая концентрация меди в печени (1,9К),08 мг/кг), крови (0,6+0,03 мг/л) и почках (2,3+0,2 мг/кг), а также низкая активность медьсодержащих ферментов в сыворотке крови (церулоплазмин 10,3+0,48 мг процента, против 17,98+ 0,58 мг процента в норме) и в печени (цитохромоксидаза - 7,2+ 0,8 против 30,1+1,6 СЕ мин/г в норме) (48).
Распределение меди в гепатоцитах при ее избыточном содержании в печени (гиперкупроз) изучалось на каракульских овцах (9 голов) с живой массой 38-40 кг в возрасте 5-6 лет с яв-ными признаками эндемической иктерогемоглобинурии из совхоза "Кокча" Гиждуванского района Бухарской области УзССР, который расположен в зоне песчаной пустыни, с серо-бурыми пустынными, песчаными, супесчаными почвами и непочвенными образованиями (полузакрепленные и барханные пески). В них содержится меди-
13-21, молибдена - 2,4-2,7, марганца - 230-250, цинка - 15--23, кобальта - 7,5-8,5 и йода - 0,9-1,4 мг/кг сухой массы. Растительный покров представлен кустарниками (саксаул, астрагалы, кандымы), полынью, эфемерами и эфемероидами (осока толст ост олбиковая, осока вздутая, мятлики, мортук, костер) и солянками (спайноцветник, куйряук, солянки длинностолбиковая и Рихтера). Особенностью пастбищ этой зоны является широкое распространение растений, содержащих пирролизидиновые алкалоиды- гелиотропы, турнефорция, крестовники. В среднем укосе травостоя этих пастбищ содержится меди - 4,1, молибдена «1,4, кобальта - 0,3, цинка - 10,5, марганца - 84,1 и йода - 0,29 мг// кг (18). В целом, пастбищный рацион овец характеризуется уме- ~ 40 - (рённым дефицитом меди и нормальным содержанием молибдена. В то же время здесь в печени клинически здоровых овец содержится 232,3+19,8 мг меди на кг свежей ткани при нормальном содержании ее в почках (3,96+0,4 мг/кг) и пониженном уровне в крови (0,6+0,03 мг/кг). Гиперкупроз в данном случае связан с гедатотоксическим действием алкалоидов гелиотропа волосисто-плодного, поедамого овцами, и нарушением регуляторнои функции печени в обмене меди. При этом поступающая в организм медь не включается в метаболические процессы и откладывается в избыточных количествах в печеночной ткани (18). Крайним проявлением гиперкупроза является эндемическая иктерогемоглобинурия каракульских овец.
Диагноз заболеваний установлен главными ветврачами совхозов и подтвержден анализом содержания меди в органах и тканях овец. Подопытные животные не были суягными и все время находились в описанных нами характерных природно-хозяйотвенных условиях.
2.2. Методы выделения субклеточных фракций
Все операции фракционирования клеточных структур и белков гиалоплазмы печени проводили в холодной комнате при 0-2С. Последовательность выделения клеточных структур из печени каракульской овцы представлена на схеме (рис.1).
Свежеполученную ткань печени промывали охлажденным физиологическим раствором, обсушивали фильтровальной бумагой. Кусочки печеночной ткани, отобранные из разных долей органа, измельчались при помощи ножниц до кашицеобразной массы, после чего отбирали I г навески для определения содержания меди и і 0,25 М сахароза в 6,005 М MgGlJ
Гомогенат і центрифугирование І (00; 200 g ,5 мин)
Осадок отбрасывается
Осадок
Ядра с обломками
Надосадочная жидкость І Центрифугирование \ (0С, 1000 g^ ,15 вин)
Суспендирование в среде выделения и центрифуги рование (0С. 1500 S , 3D«мин)
Надосадочная шщкость центрифугиров ание
Осадбк ' а-х кратное суспендирование средой выделения и цент рифугирование (0С. 12000 g , 20 мин.) (0С. 12000 g,20 мин) *Надосадочная жидкость
Центрифугирование
Осадок (0С,105000S ,60 мин)
Осадок 5-х кратное суспендирование средой выделения и центрифугирование (0С, 1500 g ,15 мин.)
Надосадочная
3-х кратное жидкое суспендирование средой выделения и центрифугирование (qOq
Цитозоль t105000'g ,Й0 мин)
Фракция крупных гранул микросомная фракция (Ядра, тяжелые -лизосомы и кле- (Митохондрии и лизосомы) (Зндоплазматический ретикулум, аппарат
Голджи, рибосомы) (Растворимая фракция)
Рис.1. Схема фракционирования клеточных структур печени каракульских овец.
10,5 г для гомогенизации. Гомогенизацию проводили порциями в гомогенизаторе Поттера с тефлоновым пестиком в растворе 0,25 М сахарозы, содержавшем 0,005 MMgCi2, в течение 2 минут при 2500 об/мин (соотношение ткань - раствор - 1:9). Затем гомогенат фильтровали через капроновое полотно, которое отжимали, а остатки неразрушенных клеток переносили на часовое стекло и взвешивали, тем самым определяя не гомогенизированную часть навески, которая обычно не превышала 0,5 г и концентрация го-могената составляла около 10 %. На это количество затем вводилась поправка таким образом, чтобы при использовании гомо-гената на дальнейшие анализы в 10-миллилитровом объеме содержался I г свежей печени.
Из полученного гомогената после тщательного перемешивания отбирали 10 мл в отдельную посуду, которые использовали для определения содержания меди. Следующие 10 мл использовали для определения соотношения ядер, крупных гранул, микросом и растворимой фракции и отбора образцов этих фракций для определения содержания меди в них. Весь остальной объем гомогената использовался для получения субклеточных фракций анализа меди, белка и ферментов в полученных фракциях и субфракциях.
Из полученного гомогената путем дифференциального центрифугирования выделяли ядерную фракцию с обломками, фракцию крупных гранул, микросомную фракцию и цитоплазму. Чистоту фракций контролировали микроскопически и с помощью ферментных тестов. Ферментным маркером для митохондрий служили сукцинатде-гидрогеназа, цитохромоксидаза и кислая фосфатаза, причем для субмитохондриальной фракции "внутренние мембраны + матрикс" маркерным ферментом служили цитохромоксидаза и сукцинатдегид-рогеназа, а для субмитохондриальной фракции "внешние мембраны + межмембранное пространство" - моноаминоксидаза (196,197, II).
Контроль чистоты микросом осуществляли определением активности глюкозо-6-фосфатазы, а цитозоля-аланинаминотрансфера-зы.
Для выделения субклеточных фракций нами была использована методика дифференциального центрифугирования (50), позволяющая последовательно отделить ядерную, митохондриальную, микро-сомную фракции и гиалоплазму гепатоцитов. Однако исследованиями последних лет установлено (185), что в митохондриальную фракцию при дифференциальном центрифугировании попадают как митохондрии, так и тяжелые лизосомы, поэтому мы сочли нужным называть эту фракцию "фракцией крупных гранул". Центрифугирование проводили на центрифугах УЕР-І и УП-І.
2.2.1. Выделение ядерной фракции
Гомогенат ткани, содержащий 0,25 М сахарозу, 0,005 М Mg0i2 , центрифугировали в течение 5 мин. для удаления неразрушенных клеток и их фрагментов. Затем надосадочную жидкость центрифугировали при 1000 g в течение 15 минут. Осадок, содержащий ядра, суспендировали в среде выделения и центрифугировали при 1500 g в течение 30 мин. при 0С. Осадок ядер 3 раза промывали средой выделения и осаждали центрифугированием (1500 s , 15 мин., 0С).
2.2.2. Выделение фракции крупных гранул Объединенный объем надосадочной жидкости, полученной после отделения ядер при 1000g в течение 15 мин. и 0UC центрифугировали при 12000 є в течение 20 мин. при 0С. Осадок триады промывали средой выделения (12000g 20 мин. при 0С) и бидистиллированной водой. Получали фракцию крупных гранул.
Биологическая роль меди в организме животных
Медь играет важную роль в жизнедеятельности всех организмов. Первые сведения об обнаружении меди в растениях и в животных тканях относятся к XIX столетию, но лишь в первой половине XX века сложилось представление о меди, как о жизненно необходимом для животного организма элементе, когда Харт и сотр., (121) доказали, что недостаток меди в рационе крыс обусловливает развитие у них так назьшаемой "молочной" анемии, связанной с участием меди в процессах кроветворения и использования железа в организме.
Заболевания, непосредственно связанные с недостатком меди в организме, были описаны у крупного рогатого скота (200) и овец (64). Аналогичные заболевания описаны у овец также в СССР (3 25,29,21,42).
Изучение явлений медной недостаточности дало возможность установить широкое участие меди в осуществлении физиологических процессов в животном организме. Так, помимо отмеченной выше роли меди в кроветворении было доказано, что она незаменима для синтеза меланина и кератинизации шерсти, миелинизации спинного мозга и остеогенеза, для образования соединительной ткани, нормального функционирования сердечно-сосудистой системы, для воспроизводительной функции и процессов биологического окисления (64,154,141,109,119,9,82,21,37,т,187,3,218).
Медь образует устойчивые комплексы с органическими компонентами биологических жидкостей и внутриклеточных образований - аминокислотами, пуринами, пиримидинами, нуклеотидами, - 7 ДНК, РЖ и белками (149,156,157,218,101,27).
Медьсодержащие ферменты
Функциональная активность меди обувловлена тем, что она является составной частью молекулярной структуры ряда ферментов, ответственных за окислительно-восстановительные процессы и осуществление тканевого дыхания.
К числу медьсодержащих ферментов относятся: цитохромокси-даза (к.ф.1.9.3.1), ортодифенолоксидаза (тирозиназа,к.ф.1.14. 18.I), дофамин - в гидроксилаза (к.ф.1.14.17.I); ферменты, окисляющие моно- и диамины в соответствующие альдегиды (к.ф. 1.4.3.6); ксантиноксидаза кишечника крупного рогатого скота (к.ф. 1.2.3.2), уратоксидаза (к.ф.1.7.3.3.); супероксиддисму-таза (к.ф. I.I5.I.I.), церулоплазмин (ферроксидаза, к.ф.1.16. 3.1.) и др. Всего в настоящее время известно свыше 30 медьсодержащих белков и ферментов, которые прочно удерживают в своей молекуле ионы меди. Наиболее изученные из этих ферментов приведены в таблице I.
Экспериментальные животные и краткая характеристика пастбищно-кормовых условий
Исследовали печень каракульских овец с нормальным обменом меди в организме, медной недостаточностью и избыточным накоплением меди в печеночной ткани. Для этой цели были взяты клинически здоровые овцы в возрасте 4-5 лет (14 голов) средней упитанности,с живой массой 40-43 кг из совхоза "Каттакурган" Каттакурганского района Самаркандской области УзССР, благополучного по уровню меди в пастбищных кормах (42), расположенного в зоне предгорной полупустыни. Почвы его представлены типичными сероземами на лессе и содержат меди 14-23, молибдена 2,2-2,5 , марганца - 710-740, цинка - 23-52, йода - 1,4-1,8 мг/кг сухой массы.
Основными пастбищно-кормовыми растениями являются белая полынь, верблюжья колючка, эфемеры и эфемероиды (осока, мятлик, мортук, пажитник крупноцветковый), астрагалы и кузиния. По данным Риша и сотр.(48), в среднем укосе весеннего и осеннего травостоя содержится, соответственно, меди - 6,2 и 3,9, молибдена - 2,4 и 2,2, кобальта - 0,4 и 0,33, цинка - 17,3 и 11,3, марганца « 95,6 и 70,0, йода - 0,42 и 0,52 мг/кг сухой массы.
Такой микроэлементый состав кормовых растений является благоприятным для сельскохозяйственных животных. Среднесуточное потребление овцами меди, молибдена и сульфатов составляет 10,8-13,0 мг, 3,1-4,0 мг и 1,4-1,8 г , соответственно. У і. Для взрослых каракульских овец, выпасающихся в этой зоне, характерно содержание меди в печени, равное 78,0+5,7, в почках 38« - 3,2+0,3 мг/кг и в крови - 0,9+0,1 мг/л.
Для изучения внутриклеточного распределения меди в печени при гипокупрозе были использованы 4-5 месячные ягнята с живой массой 20-23 кг (5 голов) с типичными признаками энзоотической атаксии (парез задних конечностей, анемия видимых слизистых оболочек), и взрослые каракульские овцы (9 голов) ниже средней упитанности с живой массой 35-37 кг в возрасте 5 лет, из совхоза "Кызыл Черводар" Зааминского района Джизакской области УзССР. Взрослые овцы по уровню меди в печени были условно разделены на 2 группы: с "умеренной" и "выраженной" медной недостаточностью. Совхоз "Кызыл Чарвода-р" расположен в природ-но-хозяйственных условиях медной недостаточности. Почвы ее пастбищной территории характеризуется аллювиальными отложениями, небольшой глубиной залегания грунтовых вод и преобладанием сульфатного засоления. В них содержится меди 30-35, молибдена-- 3,8-4,2, марганца - 600-630, цинка - 77-103, кобальта - 10--13 и йода -0,74-1,1 мг/кг. Растительный покров пастбищ представлен ажреково-эфемерово-солянковой растительностью, включающей прибрежницу солончаковую, мятлик луковичный, осоку толстостолбиковую, костер Дантонии, мортук, пажитник крупноцветный, а также сочные солянки (галохарис, спайноцветник, спайно-плодник, солянку длинностолбиковую). В среднем укосе травостоя содержится меди - 4,8, молибдена - 4,3, кобальта - 0,42, цинка - 19, марганца - 60 и йода - 0,6 мг/кг (48). В целом, пастбища отличаются умеренным дефицитом меди, повышенным содержанием молибдена в растениях и ВЫСОКИМ уровнем сульфатов в почве и питьевой воде. В этих условиях овцы потребляют на пастбищах около 12 мг меди, 13 мг молибдена в день при их соотно - 39 тении в суточном рационе 1:1, что при высоком потреблении сульфатов обусловливает у них медную недостаточность» Об этом свидетельствует низкая концентрация меди в печени (1,9К),08 мг/кг), крови (0,6+0,03 мг/л) и почках (2,3+0,2 мг/кг), а также низкая активность медьсодержащих ферментов в сыворотке крови (церулоплазмин 10,3+0,48 мг процента, против 17,98+ 0,58 мг процента в норме) и в печени (цитохромоксидаза - 7,2+ 0,8 против 30,1+1,6 СЕ мин/г в норме) (48).
Содержание меди в печени каракульских овец в условиях физиологической нормы
О распределении меди в клетках печени можно судить по концентрации металла в субклеточных фракциях и их относительному содержанию в клетке. В этой связи нами предварительно было изучено соотношение субклеточных фракции гепатоцитов клинически здоровых овец (табл.4).
Согласно методике по которой проводилось дифференциальное центрифугирование (50), фракция гепатоцитов человека и крыс седиментирующая при IOOQg в течение 10 минут, содержит ядра и обломки, а фракция, осажденная при 12000 s в течение 20 минут, состоит, в основном, из митохондрий.
При изучении выделенных нами субклеточных фракций с помощью маркерных ферментов оказалось, что у овец распределение клеточных органелл по субклеточным фракциям отличается от картины, наблюдаемой у человека и крыс. Так, судя по активности кислой фосфатазы, в "мигохондриальной фракции" присутствует наряду с митохондриями около половины, а во фракции ядер и обломков около 37 % клеточных лизосом (табл. 5).
Эти результаты позволяют считать, что гепатоциты овец содержат в условиях физиологической нормы крупные лизосомы, скорость седиментации которых аналогична таковой митохондрий, а для некоторой части лизосом приближается к скорости седиментации ядер. Объяснение этого явления будет приведено ниже.
