Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы
1.1. К истории открытия фермента 11
1.2. Механизм действия и структура липоксигеназы
1.2.1. Субстраты липоксигеназной реакции 13
1.2.2. Продукты липоксигеназной реакции 14
1.2.3. Свойства и структура фермента 18
1.2.4. Механизм действия 21
1.2.5. Сопряженные реакции,катализируемые липоксигенаяой 24
1.3. Гетерогенность липоксигеназных систем 26
1.4. Физиологическая роль липоксигеназы в норме и при патологических состояниях 29
1.5. Процессы перекисного окисления липидов в норме и при радиационном воздействии 33
ГЛАВА 2. Материал и методы исследования
2.1. Объект исследования и методы очистки фермента 38
2.2. Определение белка 39
2.3. Определение активности липоксигеназы 40
2.4. Аналитический диск-электрофорез в ПААГ 42
2.5. Метод изоэлектрического фокусирования 45
2.6. Аминокислотный анализ 46
2.7. Методы кругового дихроизма и УФ-спектроскопии 47
2.8. Рентгеновское облучение 48
2.9. Используемые реактивы 49
ГЛАВА 3. Липоксигеназные системы пшеницы вида triticum aestivum
3.1. Получение препаратов липоксигеназы из семян и проростков пшеницы 50
3.2. Множественные молекулярные формы липоксигеназы пшеницы 59
3.3. Изучение некоторых кинетических свойств липоксигеназы пшеницы 65
3.3.1. Зависимость активности липоксигеназы от рН 68
3.3.2. Зависимость активности липоксигеназы от концентрации фермента 70
3.3.3. Субстратная специфичность липоксигеназы пшеницы 72
3.3.4. Зависимость активности липоксигеназы от времени реакции и от концентрации гидроперекисей в реакционной среде 75
3.3.5. Зависимость активности липоксигеназы от температуры78
3.3.6. Определение молекулярной массы липоксигеназы пшеницы 78
ГЛАВА 4. Действие рентгеновского излучения на липоксигеназные системы пшеницы вида triticum aestivum .
4.1. Изменение активности липоксигеназы после облучения in vivo и in vitro 82
4.1.1. Облучение in vivo 83
4.1.2. Облучение in vitro 85
4.2. Влияние рентгеновского излучения на состав молекулярных форм липоксигеназы пшеницы 87
4.3.Изучение аминокислотного состава липоксигеназы 93
4.4. Изучение вторичной структуры липоксигеназы 99
Заключение 104
Выводы 108
Литература iii
- Продукты липоксигеназной реакции
- Аналитический диск-электрофорез в ПААГ
- Получение препаратов липоксигеназы из семян и проростков пшеницы
- Влияние рентгеновского излучения на состав молекулярных форм липоксигеназы пшеницы
Введение к работе
Решениями ХШ Съезда КПСС и майского Пленума ЦК КПСС 1982 года определено дальнейшее развитие сельскохозяйственной и продовольственной программ в нашей стране. Успешное выполнение этих за.^з дач во многом зависит от правильного подбора и размещения высокопродуктивных сортов пшеницы. Этому в значительной мере способствуют детальные биохимические исследования различных сортов пшеницы и изу чение их устойчивости к неблагоприятным условиям.
Актуальность проблемы. Известно, что процессы обмена липидов включают реакции перекисного окисления полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК), обнаруживаемые во всех клетках и тканях организмов. Необходимость изучения механизмов этих реакций определяется влияние: перекисей ПНЖК на важнейшие звенья обмена веществ в клетке в норме и при патологических состояниях \. / Владимиров, Арчаков,1972; Galliard,I978; Гончаренко, Кудряшов, 1980; Бурлакова ,1981; Кузин, Копылов,1983 и другие/.
Перекисное окисление ПНЖК является естественным процессом,протекающим во всех тканях растений и животных, благодаря которому осуществляется обмен липидов клеточных мембран, поддержание их структурной целостности и функциональной активности. Кроме того, это важный механизм защиты мембранных белков от инактивирующего действия свободных радикалов и активных форм кислорода, постоянно образующихся в клетках VQUinnf Williams, 1978; Арчаков,1975; Бурлакова, 1981; Будницкая, 1982/. Особо велика роль процессов перекисного окисления липидов в развитии патологических состояний,в
- б -
результате действия экстремальных факторов (при инфицировании патогенными микроорганизмами, при воздействии радиации и др.).
Еще в 1897 году А.Н.Бах выдвинул перекисную теорию,согласно которой процессы окисления в биологических системах обеспечиваются участием катализаторов / Бах,1897/.
В настоящее время хорошо изучены две системы перекисного окисления липидов: аскорбат-зависимая (неферментативная) и ШЩШ-за-висимая (ферментативная) системы, характерные для мембран митохондрий, эндоплазматического ретикулума, микросомальной фракции клетки и для лизосом /Тарусов,1962; Hochstein et al,1963; Владимиров, Арчаков,І972; Арчаков, 1975/.
Особого интереса заслуживает специфическая ферментативная система перекисного окисления ПНЖК - липоксигеназная система -обнаруживаемая в цитозоле, мембранах хлоропластов и митохондрий растительных клеток, в форменных элементах крови человека и животных, и в микроорганизмах VVliegenthart et ai,, 1982/.
Липоксигеназа ( ЛОГ, линолеат^-оксидоредуктаза, Ш I.I3. II.12) катализирует реакцию перекисного окисления молекулярным кислородом линолевой (Cjq.^» линоленовой (^18-3^ и аРахиДновои кислот (^0*4^ и их ПР0ИЗВДНЫХ> содержащих 1,4-цис,цис-пента-диеновую группировку согласно реакции:
цис цис
R - СН = СН - СНо - СН = СН - в'
2 ООН К - СН = СН - СН = СН - СН - R*
Установлено, что интенсивность реакций перекисного окисления липидов растений в норме и при патологических состояниях опреде-
ляется активностью и составом молекулярных форм ЛОГ. Предполагается, что ЛОГ играет важную роль в поддержании стабильности структуры биомембран и их функций. Изменения активности, состава молекулярных форм и локализации этого фермента при патологических состояниях могут определить исход заболевания / Galliard, 1978; Lupu /et al., 1980; Будницкая,І982/.
Однако, несмотря на широкое распространение и важную роль, которую приписывают этой ферментативной системе в растительном и животном организмах, структура, механизм действия и физиологическая роль ЛОГ изучены еще недостаточно. Наиболее изученным до сих пор остаётся фермент из соевых бобов, тогда как ЛОГ таких культур как пшеница ( занимающей ведущее место в сельском хозяйстве) мало исследована. Работы по ЛОГ пшеницы немногочисленны, результаты их разноречивы.
Поэтому, исследование ЛОГ из разных сортов пшеницы одного вида, но различающихся по экологическим условиям произрастания,по устойчивости к действию различных факторов, вызывающих патологические изменения в организме, является актуальным и необходимым для расшифровки структуры, механизма действия и регуляторной роли этого фермента в растениях.
Необходимость исследования влияния экстремальных факторов, в частности ионизирующей радиации , на ЛОГ определяется существованием зависимости между интенсивностью реакций перекисного окисления ПНЖК в клетке и активностью фермента О/Борисова,Будницкая, 1973; Gardner, 1979/.
Исследование ЛОГ пшеницы представляет интерес также с практической точки зрения, так как фермент широко применяется в пищевой
- 8 -и хлебопекарной промышленности / Ауэрман и др.,1964; Покровская, 1969; Кретовин , 1974; Попов,1980; Kretovich et al?80/.
Настоящая работа является продолжением исследований по изучению липоксигеназных систем перекисного окисления растений, проводимых в лаборатории эволюционной и радиационной биохимии Института биохимии им. А.. Б. Баха АН СССР.
Целью настоящей работы является исследование липоксигеназных систем разных сортов пшеницы вида о?г. aestivum L. в норме и после рентгеновского облучения in vivo и in vitr,
В задачу исследования входило:
разработать схему выделения ЛОГ из семян и проростков пшеницы вида Tr. aestivum,ь.J
исследовать активность и состав множественных молекулярных форм ЛОГ семян и проростков пшеницы в норме и при действии ионизирующей радиации;
провести сравнительное исследование липоксигеназных систем сои и пшеницы;
исследовать физико-химические и кинетические свойства ЛОГ разных сортов пшеницы, включая сорта, отличающиеся по устойчивости к возбудителю стеблевой, ржавчины;
изучить аминокислотный состав и вторичную структуру ЛОГ пшеницы в норме и после лучевого поражения.
Научная новизна и практическая ценность работы.Впервые проведено исследование активности и кинетических свойств ЛОГ пшеницы в зависимости от состава молекулярных форм этого фермента.
На примере ЛОГ из разных сортов пшеницы вида тг# aestivum Ъ, впервые установлено, что в отличие от ЛОГ бобовых растений, фермені
- 9 -из пшеницы катализирует только реакцию окисления ПНЖ с образованием конъюгированных гидроперекисей и не активен в реакции сопряженного окисления каротиноидов. Обнаруженная особенность обусловлена отсутствием в составе ЛОГ пшеницы молекулярных форм, катализирующих этот процесс и характерных для ЛОГ бобовых растений.
Исследована структурная организация ЛОГ пшеницы: впервые определены аминокислотный состав, вторичная структурай> молекулярная масса фермента.
Применение метода радиационной инактивации фермента показало, высокую радиоустойчивость ЛОГ пшеницы (До^=2000-3000 Гр) по сравнению с ЛОГ бобовых (Дог» =500-1100 Гр), что обусловлено особенностями структуры фермента пшеницы.
Снижение общей активности ЛОГ пшеницы при облучении в леталы*-ных дозах связано с радиационным нарушением структуры радиочувствительных молекулярных форм и с их инактивацией.
Полученные в диссертационной работе экспериментальные данные об особенностях ЛОГ пшеницы имеют большое значение для развития теоретических представлений о структуре и механизме действия этого фермента в растениях. Результаты радиобиологических исследований позволяют подойти к объяснению механизмов устойчивости ферментов к действию радиации и роли ЛОГ при развитии патологии.
Данные настоящей работы могут быть использованы при оценке хлебопекарных качеств муки из пшеницы разных сортов с учетом активности и состава множественных молекулярных форм ЛОГ.
Апробация работы. Основные материалы диссертационной работы были представлены иа: I Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982); ІУ Всесоюзном симпозиуме " Роль первичных и начальных про-
цессов в проявлении основных радиобиологических эффектов в клетке (Ереван,1982); I Всесоюзной научной конференции молодых ученых по сельскохозяйственной радиологии ( Обнинск,1983); Симпозиуме по модификации лучевого поражения растений ( Чернигов,1983); I Всесоюзной конференции по применению хроматографии в биологии и медицине (Москва,1983); ХУІ Международном конгрессе по липидам (ВНР, Будапешт,1983); Совместном коллоквиуме лаборатории энзимологии и лаборатории эволюционной и радиационной биохимии Института биохимии им. А.Н.Баха АН СССР и кафедры биохимии и зерноведения Московского технологического института пищевой промышленности (Москва,1984).
- II -
Продукты липоксигеназной реакции
Липоксигеназа /ЛОГ/ была впервые обнаружена в семенах соевых бобов Теореллем /Theoreii et ai., 1947/. В настоящее время показано широкое распространение этого фермента в тканях большинства высших растений Долесников, 1953; Будницкая, 1955; Шенова и др., 1961; Rhee, Watts, 1966; Покровская, 1969; Pinsky et al., 1973; Vick, Zimmerman, 1976,1981; Yabuuchi, 1976; Bonnet et al., 1977; Wardale, Lambert, 1980; Takeo, Tsushida, 1980; Борисова и др., I98I6/.
Установлено, что наиболее высокой активностью ЛОГ обладают семена бобовых /Holman et al., 1950; Siddiqi, Tappel, 1956; Eriksson, Svensson, 1970; Veldink et al., 1972; Truong et al., 19826/, несколько меньшей - клубни картофеля /Кирсанова, 1938; Ауэрман и др., 1973; Wardale, 1980/, плоды баклажан /Sredni et al., 1980/, И цветная капуста /O Reilly et al., 1969/.
Изучение субклеточного распределения фермента показало, что ЛОГ и многие молекулярные формы, входящие в ее состав, связаны с мембранами. Мембранносвязанные формы ЛОГ высокоактивны и ассоциро-ваны с микросомальной фракцией митохондрий и пластид, а также с мембранами эндоплазматического ретикулума и аппарата Гольджи /Сисакян, Кобякова, 1957; Gamborg et al., 1958; Борисова, Будницкая, 1972,1975; Wardale et al., 1975,1978; Boudnitzkaya,Borisova, 1972; Douillard, Bergerom, 1981; Hatanaka et al., 1982/.
Несмотря на данные ряда авторов о присутствии ЛОГ в животных тканях /Watts, Peng, 1947; Wojtowiezowa et al., 1961; Ball, Engel, 1962/, до 70-х годов ЛОГ считалась сугубо растительным ферментом. Однако применение новейших методов исследования позволило такжеобнаружить липоксигеназные системы перекисного окисления липидов в тканях животных и человека, в частности в форменных элементах крови: тромбоцитах и ретикулоцитах /Nugteren, 1975; schewe et ai., I98I6; Rapoport et al., 1982; Yashimoto et al., 1982; Будницкая, 1982; Samuelsson, 1983/,
Благодаря способности окислять входящие в состав фосфолипидов ШЖК, ЛОГ человека вызывает инактивацию ферментов и лизис митохондрий в процессе созревания и гибели кровянных телец /Schewe et al,, I98I6/. Кроме того, ЛОГ животных и растений интересна также в связи с ее участием в синтезе лейкотриенов и простагландинов /Будницкая, 1982; Samuelsson, 1983; Hammerstrom, 1983/. lb СВОИМ кинетическим характеристикам ЛОГ животных близка к изоферментам соевых бобов, но отличается высокой лабильностью, обусловливающей трудности ее выделения,
Липоксигеназа обнаружена также в тканях беспозвоночных, низших растений И В микроорганизмах /Zimmerman, Vick, 1973; Gardner et al., 1973; Matsuda et al., 1978; Lilius et al., 1982/. Наиболее изучена ЛОГ бобовых, тогда как ЛОГ из злаков мало исследована /Колесников, 1953; Guss et al., 19686; Покровская, 1969; Wallace, Wheeler, 1975; Douillard, Bergeron, 1981/. Липоксигеназа, выделенная из растений и животных, является гетерогенной системой, включающей в свой состав от 2 до 6 множественных молекулярных форм. Несмотря на то, что генетическая детерминированность доказана лишь для некоторых молекулярных форм ЛОГ из СОИ И пшеницы /fiart, Langston, 1977; Hildebrand, Hitowitz, 1982/, в литературе термин изоферменты применяется в широком плане к множественным формам ЛОГ, многие из которых выделены и охарактеризованы. Липоксигеназа катализирует окисление ПНЖК, содержащих 1,4-цис, цис-пентадиеновую группировку в структуре субстратов - линолевой, линоленовой и арахидоновой кислот. Холман и соавторы / Holman, 1969/, используя ряд изомеров октадиеновых кислот, содержащих пентадиеновую систему в различных положениях показали, что ЛОГ из соевых бобов катализирует окисление ПНЖК, имеющих как минимум две цис,цис-ненасыщенные связи в углеводородной цепи субстрата. Некоторые глицериды, фосфолипиды мембран, эфиры жирных кислот могут также служить субстратом для ЛОГ /GUSS et alJ9686;Mann,Morrison, 1975;Morrison,Panpaprai, I975;Vioque et al., 1982/. Изоферменты ЛОГ с оптимумом активности при рН=7,0 катализируют окисление нейтральных липидов или метиловых эфиров ПНЖК. Изоферменты ЛОГ с оптимумом действия при рН выше 7,0 окисляют соли дирных кислот /Bild et alJ977/. Исследование структуры субстратов я ЛОГ растений показало, что замещение водорода при аС- углеродном атоме приводит к ингибирова-нию реакции / Holman et al., 1969/. При замещении карбоксильной группы на любую полярную группу кинетика реакций существенно не меняется /Haining,Axelrod, 1958; Allen ; 1969/. То есть, в реакциях перекисного окисления ПНЖК активность фермента и характер реакций определяются в первую очередь гидрофобными взаимодействиями между ферментом и субстратом. Для ЛОГ животных субстратом могут служить фосфолипиды и свободные ПНЖК. При этом, ЛОГ животных обнаруживает высокую специфиность по отношению к арахидоновой кислоте / Bild et al., 1978; Будницкая,І982/. В зависимости от места присоединения ( к углеродной цепи арахидоновой кислоты при липоксигеназной реакции образуются гидроперекиси различной структуры (Рис. I).
Аналитический диск-электрофорез в ПААГ
Липоксигеназа относится к числу ферментов, существующих в виде «тожественных молекулярных форм, обладающих сходными каталитическими функциями.
Установлено, что изоферменты кодируются структурными генами, исходные соотношения между этими генами, конкретное проявление их экспрессии и вторичные реакции синтезированных субъединиц ферментов шределяют конечную картину изоферментного спектра.
Согласно рекомендациям Международной подкомиссии по изофермен . гам, следует различать термин "множественные формы ферментов", применяемый к белкам, обладающим одной и той же ферментативной актив-юстью, и термин "изоферменты", применяемый лишь к генетически детерминированным множественным молекулярным формам ферментов /Крето-ІИЧ, 1974/. Однако, генетические доказательства получены для единич-шх энзимов, в том числе и для ЛОГ семян пшеницы и соевых бобов Hart,Langston, 1977; Hildebrand, Hitowitz, 1982/.
Предположение о гетерогенности ЛОГ впервые было высказано Кохом Koch et ai.,I958/, который показал существование двух типов фермента в семенах сои, отличающихся друг от друга по субстратной специфич-юсти /"жирнокислотная" и "триглицеридная" формы/ и по рН-оптимуму іктивности. В настоящее время установлено, что ЛОГ сои существует в шде 4-х изоферментов, один из которых,/Л0Г-І/, активен при рН 9,0, і все остальные /ЛОГ-2, ЛОГ-3, ЛОГ-4/ - при рН 6,6 / Axelrod et al. !981/. Следует отметить, что изоферменты ЛОГ-3 и ЛОГ-4 обладают жодными свойствами и близким аминокислотным составом, поэтому некоторые исследователи считают их одним и тем же изоферментом ЛОГ-3 Yamamoto, 1970/. Каждый из изоферментов ЛОГ сои содержит по атому селеза /Ге / и имеет молекулярную массу равную 100 000 + 5 000 (альтон. Различаются изоферменты ЛОГ сои по субстратной специфичности, способности сопряженно окислять -каротин, по конечным продуктам реакции, термоустойчивости, способности активироваться ионами Са , электрофоретической подвижности, а также по числу сульфгид рИЛЬНЫХ остатков В ПОЛИПЄПТИДНОЙ ЦЄПИ фермента /Christopher et al., 1970; Yamamoto et al., 1970; Diel, Stan, 1978; Grosch, Laskawy, 1979; Axelrod et al., 1981/.
Так Л0Г-І обладает низкой активностью в реакции сопряженного окисления А-каротина и образует в основном 13- ь-гироперекиси ІШЖК, тогда как ЛОГ-3, обладающая высокой способностью окислять /-каротин, продуцирует в основном 9-D-гидроперекись.
Множественные молекулярные формы ЛОГ обнаружены и в других растениях, но генетическая детерминированность их еще не доказана. Однако все авторы, исследующие ЛОГ, называют их изоферментами, используя это слово в качестве более краткого термина, который мы повторяем, цитируя их работы.
Данные экспериментальных исследований свидетельствуют о существовании двух ИЗОфермеНТОВ В ЛОГ клубней Картофеля /Pinsky et al., 1973/, ЯЧМеНЯ /Yabuuchi, 1976/, ВИГНЫ И ПСефокарпуса /Truong et al., 1982а,б/; трех ИЗОфермеНТОВ - В ЛОГ риса /Yamamoto et al., 1970/; и четырех - в ЛОГ семян гороха и листьев люпина /Ben-Aziz et al., I971; Чепуренко и др., 1977; Yoon, Klein, 1979/.
Что касается ЛОГ пшеницы, то хотя она была обнаружена сравнительно давно /Irvine, 1953/, данные относительно свойств ЛОГ пшеницы, ее изоферментного состава немногочисленны и даже противоречивы. Это обстоятельство связано, видимо, с низкой активностью ЛОГ пшеницы и с трудностями ее выделения /Бшенова и др., 1961; Nicolas et al., 1982/.
Впервые данные об изоферментном составе ЛОГ пшеницы были опубликованы Гассом и сотрудниками /Guss et al., 1968а/, которые обнаружили от 2 до 4 изоферментов в семенах четырех сортов яровой и озимой пшеницы вида Triticum durum. Авторы показали, что яровые сорта пшеницы обладают более высокой активностью фермента, чем озимые.
Валлас и Вилер /Wallace, Wheeler, 1975/, разделяя неочищенный экстракт из семян пшеницы методом ионообменной хроматографии на ДЕАЕ - целлюлозе, выделили 4 белковые фракции, обладающие активностью ЛОГ и близкие по электрофоретической подвижности к изоферментам ЛОГ, охарактеризованными ранее /GUSS et al., 1968, Hale et al., 1969/. В дальнейшем авторам удалось выделить два изофермента ЛОГ пшеницы /Wallace, Wheeler, 1979/. Было показано, что изоферменты, условно обозначенные как Л0Г-І и ЛОГ-3, различались по электрофоретической подвижности, устойчивости к действию сульфгидрильных реагентов, рН-оптимуму активности. Была определена молекулярная масса изоферментов, равная 84000-87000 дальтон. При диск-электрофорезе в присутствии додецилсульфата натрия изофермент ЛОГ-2 разделялся на две полипептидные цепочки.
В процессе очистки ЛОГ пшеницы был выделен активатор ЛОГ белковой природы, с величиной электрофоретической подвижности 0,34, который оказывал действие также и на активность коммерческого препарата ЛОГ из соевых бобов /Wallace, Wheeler, 1979/. Однако, белок-активатор ЛОГ , оказывая влияние на состояние субстрата (образовывая мицеллы ПНЖК), косвенно действует на активность фермента.
Группа французских исследователей также предприняла попытку выделить в гомогенном состоянии и охарактеризовать изоферменты ЛОГ из семян пшеницы / Nicolas et al«J982/. Полученные ими изоферменты обладали близкими значениями иолекулярной массы, электрофоретической подвижности, были нечувствительны к действию ионов кальция и имели одинаковый рН оптимум активности. Однако, авторы пришли к заключению, что выделенные ими индивидуальные изоферменты,являются конформационно измененнными формами одного изофермента ЛОГ, возникшими в результате длительной процедуры их очистки и разделения.
В заключение следует подчеркнуть, что хотя и ЛОГ пшеницы относится к числу генетически детерминированных ферментов / Hart Langston, 1977/ работ по исследованию ее изоферментного состава немного, их результаты разноречивы. Поэтому задачи по изучению ЛОГ пшеницы остаются актуальными и имеют теоретический и практический интерес.
Получение препаратов липоксигеназы из семян и проростков пшеницы
При воздействии ионизирующей радиации на процессы перекисного окисления липидов, катализируемые липоксигеназой, степень и кинетика инактивации ЛОГ из различных объектов, определяются особенностями структуры и внутриклеточной локализацией этого фермента /Bori-sova,Boudnit8kayat 1975; Борисова и др. ,I977,I98Ia; Vliegent-. hart,Veldink, 1982/.
/Радиационные исследования позволяют не только выявить особенности молекулярной организации фермента, но также изучить определенные стороны механизма действия радиации на живые организмы. К настоящему времени накоплен большой экспериментальный материал по дейс вию ионизирующей радиации на разные стороны обмена веществ организмов, но особого внимания заслуживают работы по изучению действия радиации на биомолекулы, приводящее к потере их биологических функций.
В задачу нашей работы входило исследование действия радиации, как одного из экстремально воздействующих факторов, вызывающих значительные нарушения в основных звеньях обмена веществ в облученных организмах, которые в свою очередь зависят от развития реакций перекисного окисления липидов в пострадиационный период / Бродзин-ский, Гудков,1973; Бурлакова и др.,1981,1982; Кудряшов,Беренфельд, 1982; Будницкая,1982; Кузин,Копылов,1983/.
С целью изучения механизма действия ионизирующей радиации на ферментативный процесс перекисного окисления ПНЖК исследовали активность и состав молекулярных форм ЛОГ после рентгеновского излучения in vivo и in vitro . В исследованиях in vitro нами использовались в основном препараты ЛОГ после гель-хроматографии белков на колонке с сефадексом Q-I50. Выделение препаратов ЛОГ после облучения in vivo из проростков и семян пшеницы проводили по схеме (Рис.6).
Облучению in vitro подвергали сухие препараты и водные растворы фермента их семян пшеницы сортов Саратовская-29, Sonora -64 и AlDidum -43. In vivo облучали проростки этих же сортов пшеницы. С целью изучения радиоустойчивости ЛОГ и механизмов радиационного повреждения фермента облучение проводили в дозах от 10 Гр до 1000 Гр, оказывающих различный биологический эффект на организм, включая и летальный исход. При облучении проростков пшеницы in vivo в дозах 10, 100 и 150 Гр (Рис. 23) через 0,5 час. после облучения обнаруживается стадия активации фермента, как и в случае других растений /Чепуренко и др.,1977 Борисова и др., 1981р./ Эффект активации ЛОГ пшеницы при действии сублетальных доз радиации обусловлен начальными повреждением биомембран, связанным с изменением взаимодействия между белковой и липидной частью .мембраны органелл и накоплением в клетке свободных ПНЖК. Предполагается, что обратимая активация ЛОГ и процесса перекисного окисления ПНЖК в клетке на ранних этапах развития лучевого поражения играет важную роль. Способность ЛОГ использовать свободные жирные кислоты и активные формы кислорода, возникающие в клетке при лучевом поражении, рассматривается как один из вероятных механизмов защиты мембранных белков и, следовательно, функций биомембран, от инактивирующего действия ионизирующей радиации в малых дозах / Quinn, Williams 978/. Наблюдаемая стадия активации ЛОГ при действии облучения в дозах -10 Гр и 50 Гр обратима и не сопровождается изменением состава молек лярных форм ЛОГ (Рис. 24 и 25). При более высоких дозах облучения (до 200 Гр) активация ЛОГ связана с высвобождением фермента в растворимую фракцию цитозоля и является показателем радиационного повреждения структуры органелл в облученных клетках и тканях. При облучении в этих дозах и выше (до 500 Гр) состав молекулярных форм ЛОГ восстанавливается через 24 часа после облучения (Рис.25) /Оганесян и др.,19836,1984а,б/. Обнаружив относительно высокую радиоустойчивость ЛОГ пшеницы в опытах in vivo мы провели серию экспериментов по изучению действия рентгеновского излучения in vitro на препараты ЛОГ, полученные после применяемой нами очистки фермента. Облучали в тех же дозах (от 10 Гр до 1000 Гр), исходя из относительно высокой радиоустойчивости пшеницы. Критическая доза для пшеницы соответствует 200-400 Гр, тогда как бобовые растения менее устойчивы и летальная доза для них равна 50 Гр /Преображенская, 1971/. Можно предположить, что механизм радиационного повреждения ЛОГ злаков и ЛОГ бобовых растений различается. В таблице 3 представлены результаты по действию рентгеновского облучения in vitro на активность ЛОГ пшеницы сортов Саратовская-29 и Sonora -64. Из приведенных данных следует, что активность ЛОГ обоих сортов пшеницы остается неизменной лишь при облучении в дозе 10 Гр. Увеличение дозы облучения до 100 Гр приводит к незначительной инактивации фермента через 4 часа после облучения ЛОГ. Уровень инактивации ЛОГ не превышает 10%. Дозы свыше 250 Гр вызывают значительное снижение активности фермента уже через 0,5 часа после облучения и степень инактивации ЛОГ зависит от сорта пшеницы. Различия между степенью инактивации ЛОГ разных сортов пшеницы особенно резко выражена через 24 и 48 часов после облучения.
Влияние рентгеновского излучения на состав молекулярных форм липоксигеназы пшеницы
Результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что ЛОГ семян и проростков мягкой пшеницы видаТгі-Ьісші aestivum Ь. является гетерогенной ферментативной системой, состоящей от 2 до 4 молекулярных форм ЛОГ ( Л0Г-1,Л0Г-2,Л0Г-3 и Л0Г-4), причем, максимальной активностью обладают формы ЛОГ-2 и ЛОГ-3 /Оганесян,1983а; Оганесян и др.,1983а/. В процессе роста пшеницы количество и соотношение этих молекулярных форм меняется, что вызывает также изменение кинетических характеристик фермента и , соответственно, интенсивности реакции перекисного окисления ПНЖК в растениях.
В сравнении с ферментом из соевых бобов, ЛОГ всех исследованию сортов пшеницы вида Tr. aestivum не катализирует реакцию сопряженного окисления каротиноидов. Это объясняется различиями в составе множественных молекулярных форм ЛОГ сои и пшеницы, и связано с отсутствием в составе ЛОГ пшеницы молекулярных форм, катализирующих эту реакцию и характерных для липоксигеназных систем бобовых растений /Чепуренко и др.,1977; Борисова и др.,19816; Оганесян, 1983а; Оганесян и др.,1983 а).
Особенности ЛОГ, различающихся по составу множественных молекулярных форм, проявляются в субстратной специфичности, в зависимости от кинетики окисления ПНЖК, от их концентрации в реакционной среде, от рН, от концентрации гидроперекисей, а также в зависимости от устойчивости ЛОГ к действию повреждающих факторов /Оганесян и др., 1983а, 1984а/. Так, в отличие от фермента. из сои, ЛОГ пшеницы на всех изученных нами стадиях роста растения, катализирует реакцию перекисного окисления линолевой, линоленовой и арахи-доновой кислот с образованием гидроперекисей ПНЖК, и практически не окисляет метиллинолеат. В этом, видимо, проявляются особенности состава множественных молекулярных форм ЛОГ пшеницы и структуры их каталитического центра. Молекулярная масса ЛОГ исследованных нами сортов пшеницы вида Tr. aestivum равна 85000-90000 дальтон и близка к величине молекулярной массы ЛОГ пшеницы вида Тг« durum /Wallace, Wheeler, 1975,1979/.
При исследовании влияния рентгеновского облучения in vivo и in vitro на ЛОГ пшеницы и сои нами отмечена высокая радиоустойчивость этой :. їм ферментативной системы. Однако, обнаружены существенные различия между радиоустойчивостью этих липоксигеназ-ных систем /Оганесян и др.,19836,1984а,б/. Расчет величины инак-тивационной дозы (Д37) показал, что ЛОГ пшеницы (Ддг, =2000-3000 Гр) относительно более радиоустойчива, чем ЛОГ бобовых растений (Ддг бОО-ПОО Гр), что, видимо, обусловлено особенностями первичной структуры ЛОГ пшеницы, а именно - низким содержанием ароматических и серосодержащих аминокислот /Оганесян и др.,19846/.
Исследуя структуру ЛОГ в норме и после облучения в летальных дозах, методами КД и УФ-спектроскопии мы не обнаружили совпадения в механизме инактивации ЛОГ сои и пшеницы при этих дозах. Пострадиационное снижение активности ЛОГ сои связано с радиационным разрушением ароматических аминокислот фермента, тогда как аминокислотный состав ЛОГ пшеницы при облучении в этих дозах практически не меняется. На основании приведенных в работе экспериментальных данных /Оганесян и др., .19846/ и литературных сведений / Yamamoto et al., 1970/, нами высказывается предположение об участии гистидина в образовании каталитического центра ЛОГ пшеницы.
Методом КД зарегистрировано также снижение степени спирали-зации молекулы ЛОГ пшеницы, что подтверждает ранее полученные сведения о радиационном нарушении вторичной структуры ЛОГ бобовых растений /Чепуренко и др.,1977/.
Таким образом, специфичность действия ЛОГ различных растений определяется особенностями состава множественных _ молекулярных форм фермента. Это обусловливает не только многообразие продуктов окисления ПНЖК, но связано также со сложной физиолого-биохими-ческой ролью ЛОГ в растительной клетке.
Обнаружена также корреляция между активностью, составом молекулярных форм ЛОГ и степенью устойчивости исследованных нами сортов пшеницы к возбудителю стеблевой ржавчины /Оганесян,1983а; Оганесян и др.,1983а/.
Попытки сопоставить радиочувствительность ЛОГ и радиочувствительность растений, из семян и тканей которых фермент был выделен, привели нас к заключению, что между этими показателями существуем корреляция /Чепуренко и др.,1977, Борисова и др.,19816, 1982; Оганесян и др.,1984 а,б/. Максимальная устойчивость ЛОГ к действию ионизирующей радиации свойственна радиоустойчивым растениям / Борисова и др.,19816,1982; Оганесян,19836/.
Липоксигеназная система перекисного окисления ПНЖК, обладающая высокой радиоустойчивостью, может играть в пораженной клетке регулирующую роль, направленно окисляя ПНЖК, накопившиеся в клетках в результате радиационного повреждения биомембран и развития липолитических процессов. Инактивация липоксигеназных систем -при облучении радиочувствительных растений может привести к нерегулируемому процессу переокисления ПНЖК и к накоплению неспецифических перекисей липидов в клетке. Это может быть связано с участием ЛОГ в регуляции процесса перекисного окисления ПНЖК и их обмена, а также со способностью этого фермента использовать в катализируемых реакциях активные формы кислорода, возникающие в клетках и тканях растений при поражении. Полученные в настоящей работе экспериментальные результаты подтверждают возможность такой зависимости.
