Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 15
І.Свободнорадикальное окисление биомолекул и система антиоксидантной защиты 15
1.1. Свободные радикалы и оксидативный стресс 16
1.2. Антиоксидантная система защиты 24
1.2.1.Ферментативные и неферментативные звенья антиоксидантной защиты 24
1.2.2.Роль глутатионредуктазы в механизмах защиты от клеточного стресса 29
1.2.3.Структурная организация и биохимические свойства глутатион пероксидаз 32
1.2.4. Физиолого-биохимическое значение глюкозо-6-фосфатдегидроге-назы 35
1.2.5. Кооперативность функционирования антиоксидантных ферментов 36
2. Патологии, сопряженные с оксидативным стрессом 38
2.1. Миокардит и его патогенез 39
2.1.2.Механизмы влияния адреналина на уровень свободных радикалов в клеточных системах 40
2.2.Токсическое поражение печени 44
2.2.1.Общая характеристика гепатитов 44
2.2.2.Метаболические нарушения при токсическом гепатите 44
2.3.Сахарный диабет и его типы 47
2.3.1 . Свободнорадикальное окисление в патогенезе сахарного диабета 47
2.4. Пероксид водорода как индуктор оксидативного стресса 53
Экспериментальная часть
Глава 2. Объект и методы исследования 55
2.1. Объект исследования 55
2.2. Методы исследования 55
2.3. Индукция экспериментального токсического гепатита 55
2.4. Создание модели адреналинового миокардита 56
2.5. Моделирование сахарного диабета 2-го типа 56
2.6. Получение тканевых гомогенатов 56
2.7. Определение интенсивности процессов свободнорадикального окисления биосубстратов методом биохемилюминесценции 57
2.8. Определение содержания диеновых конъюгатов 59
2.9. Определение активности глутатионредуктазы 60
2.1.0 Определение активности глутатионпероксидазы 61
2.1.1. Определение активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы 61
2.1.2. Определение активности аланинаминотрансферазы и аспартат аминотрансферазы 61
2.1.3 .Определение активности креатинкиназы-МВ 63
2.1.4. Определение количества белка 64
2.1.5. Экстракция тотальной РНК тризоловым методом 64
2.1.6. Электрофорез РНК 65
2.1.7. Обратная транскрипция 66
2.1.8. ПЦР-амплификация в режиме реального времени 66
2.1.9. Определение уровня экспрессии генов глутатионредуктазы, глутатионпероксидазы и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы 68
2.2.0. Электрофорез ДНК 69
2.2.1. Среды для работы с культурами клеток 70
2.2.2. Оценка метаболической активности и жизнеспособности клеток 71
2.2.3. Оценка степени развития апоптоза в клеточной культуре фибробластов 72
2.2.4. Корреляционно-регрессионный анализ 72
2.2.5.Статистическая обработка экспериментальных данных 72
Глава 3. Интенсивность свободнорадикальных процессов и экспрессия глутатионпероксидазы и глутатион редуктазы в сердце крыс в динамике развития адреналинового миокардита 74
3.1. Активность ферментов-маркеров цитолиза кардиомиоцитов в сыворотке крови крыс при развитии адреналинового миокардита 74
3.2. Содержание диеновых конъюгатов в сердце крыс в динамике развития адреналинового миокардита 75
3.3. Динамика параметров биохемилюминесценции в сердце крыс при адреналиновом миокардите 76
3.4. Активность глутатионредуктазы и глутатионпероксидазы в сердце крыс в динамике развития адреналинового миокардита 78
3.5. Активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в сердце крыс при адреналиновом миокардите 81
3.6. Корреляционный анализ активностей глутатионредуктазы, глутатионпероксидазы и интенсивности свободнорадикальных процессов при адреналиновом миокардите 83
3.7. Экспрессия глутатионредуктазы в сердце крыс при адреналиновом миокардите 84
3.8. Экспрессия глутатионпероксидазы в сердце крыс в при адреналиновом миокардите 104
3.9. Уровень экспрессии глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в сердце крыс при адреналиновом миокардите 109
Глава 4. Интенсивность свободнорадикального окисления биосубстратов и экспрессия глутатионпероксидазы и глутатионредуктазы при токсическом поражении печени крыс 112
4.1. Активность ферментов-маркеров цитолиза гепатоцитов в сыворотке крови крыс при токсическом поражении печени, индуцированном тетрахлорметаном 112
4.2. Содержание диеновых конъюгатов в печени крыс в динамике развития токсического гепатита 113
4.3. Параметры биохемилюминесценции в печени крыс в динамике развития токсического гепатита, индуцированного тетрахлорметаном 114
4.4. Активность глутатионредуктазы и глутатионпероксидазы при токсическом поражении печени 116
4.5. Активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в печени крыс при токсическом гепатите 118
4.6. Корреляционный анализ активностей глутатионредуктазы и глутатионпероксидазы и интенсивности свободнорадикальных процессов в печени крыс при экспериментальном токсическом гепатите 120
4.7. Экспрессия глутатионредуктазы при токсическом поражении печени 121
4.8. Экспрессия глутатионпероксидазы при токсическом поражении печени 122
4.9. Экспрессия глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы при экспериментальном токсическом гепатите 124
Глава 5. Интенсивность свободнорадикального окисления биосубстратов и экспрессия глутатионпероксидазы и глутатионредуктазы в печени крыс в динамике развития экспериментального сахарного диабета 2 типа 126
5.1. Уровень глюкозы в сыворотке и моче крыс в динамике развития сахарного диабета 2 типа 126
5.2. Содержание диеновых конъюгатов в печени крыс в динамике развития экспериментального сахарного диабета 2 типа 127
5.3. Параметры биохемилюминесценции в печени крыс в динамике развития сахарного диабета 2 типа 129
5.4. Активность глутатионредуктазы и глутатионпероксидазы в печени крыс при сахарном диабете 2 типа 132
5.5. Активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в печени крыс при сахарном диабете 2 типа 135
б
5.6.Корреляционный анализ активностей глутатионредуктазы и глутатион пероксидазы и уровня свободнорадикальных процессов в печени крыс при сахарном диабете 2 типа 136
5.7. Экспрессия глутатионредуктазы в печени крыс при развитии сахарного диабета 2 типа 137
5.8. Экспрессия глутатионпероксидазы в печени крыс при сахарном диабете 2 типа 138
5.9.Экспрессия глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в печени крыс при сахарном диабете 2 типа 140
Глава 6. Влияние пероксида водорода на экспрессию глутатионпероксидазы и глутатионредуктазы, метаболическую активность и пролиферацию фибробластов линии L929 141
6.1. Уровень клеточной гибели в культуре фибробластов линии L929 при оксидативном стрессе, индуцированном пероксидом водорода 141
6.2. Дыхательная активность фибробластов линии L929 при оксидативном стрессе, индуцированном пероксидом водорода 143
6.3. Экспрессия гена глутатионредуктазы и глутатионпероксидазы при интенсификации свободнорадикального окисления в культуре фибробластов линии L929 пероксидом водорода 144
Заключение 147
Выводы 154
Список литературных источников 156
- Свободные радикалы и оксидативный стресс
- Свободнорадикальное окисление в патогенезе сахарного диабета
- Экспрессия глутатионредуктазы в сердце крыс при адреналиновом миокардите
- Экспрессия гена глутатионредуктазы и глутатионпероксидазы при интенсификации свободнорадикального окисления в культуре фибробластов линии L929 пероксидом водорода
Введение к работе
Актуальность работы. Окислительный стресс или некомпенсированное образование в клетке активных форм кислорода (АФК), является причиной систематического повреждения ДНК, белков и липидов, что может приводить к клеточной смерти и лежит в основе ряда патологических состояний, таких как сердечно-сосудистые заболевания, токсическое поражение печени и сахарный диабет, относящихся к свободнорадикальным патологиям. В ответ на интенсификацию свободнорадикального окисления (СО) биосубстратов происходит активизация антиоксидантной системы (АОС) клетки. Глутатионредуктазная/ глутатионпероксидазная (ГР/ГП) система является важнейшим компонентом антиоксидантной защиты организма (Владимиров Ю.А., 1972), поддерживающей на стационарном уровне интенсивность протекания свободнорадикальных процессов (Владимиров Ю.А., 1972, Kowaltowski A.J., Шишкина Л.Н., 2000). Благодаря функционированию ГР/ГП системы в клетках млекопитающих обеспечивается детоксикация гидроперекисей и перекисей, являющихся основным источником гидроксильного радикала, образующегося в реакции Фентона в присутствии ионов Fe2+ (Осипов А.Н., 1990, Skulachev V.P., 1997). Учитывая то обстоятельство, что большинство известных патологических состояний сопровождаются усилением СО (Ланкин В.З., 2001, Bakker S.J., 2000, Kowaltowski A.J., 1999) биосубстратов и изменением активности АОС, весьма актуальной проблемой представляется оценка состояния этих систем с целью ранней диагностики и выбора тактики лечения заболеваний.
Установлено, что при патологиях, сопряженных с оксидативным стрессом, может изменяться гормональный статус организма, в связи с чем, индукция оксидативного стресса может иметь опосредованный нейрогуморальный характер. Клеточные культуры являются удобной модельной системой для исследования оксидативного стресса, поскольку их использование позволяет исключить многие неспецифические факторы, сопровождающие индукцию оксидативного стресса. В этой связи, изучение экспрессии ГП и ГР на клеточных культурах in vitro при оксидативном стрессе, индуцированном пероксидом водорода, является также актуальной задачей.
В настоящее время в литературе имеются данные относительно изменения функционирования некоторых звеньев антиоксидантной системы в тканях животных и человека (Gutterer J.M., 1999, Madamanchi N.R., 1992, Krauth-Siegel R.L., 1982) в условиях патологии. Однако имеющиеся сведения носят часто разрозненный, противоречивый и несистематизированный характер. Вместе с тем, представляет интерес выявление общих закономерностей и особенностей функционирования ГП/ГР АОС при оксидативном стрессе различной этиологии, в частности, вызванным развитием патологических состояний - адреналинового миокардита, токсического гепатита, сахарного диабета 2 типа (СД 2), а также индуцируемым АФК в клеточных культурах. Использование различных модельных систем позволяет
выявить важнейшие молекулярные механизмы регуляции глутатионовой АОС с одной стороны, а также ее специфические особенности - с другой.
Цель и задачи исследования. Цель данной работы - исследование экспрессии ГР и ГП в тканях крыс в условиях оксидативного стресса, вызванного индукцией свободнорадикальных патологий: адреналинового миокардита, токсического поражения печени, сахарного диабета 2 типа, а также воздействием пероксида водорода на клеточные культуры фибробластов. В связи с поставленной целью решались следующие задачи: 1.Корреляционный анализ активностей ГР, ГП и интенсивности свободно-радикальных процессов в тканях крыс при адреналиновом миокардите, экспериментальном токсическом гепатите (ЭТГ) и СД2.
2.Оценка уровня экспрессии ГП, ГР и Г6ФДГ в тканях крыс при адреналиновом миокардите, ЭТГ и СД2.
3. Исследование влияния пероксида водорода на метаболическую активность, особенности пролиферации и клеточную гибель фибробластов мыши линии L929
4.Исследование уровня экспрессии ГП и ГР в фибробластах линии L929 при воздействии пероксида водорода.
Научная новизна. Впервые проведено комплексное исследование экспрессионной регуляции ГР, ГП и Г6ФДГ при патологиях, сопряженных с оксидативным стрессом, а также индукции апоптотических процессов в клеточных культурах. Выявлены особенности экспрессии данных ферментов и проведен сравнительный анализ активности ГР/ГП-системы при оксидативном стрессе, вызванном адреналиновым миокардитом, ЭТГ, СД2. Осуществлен компьютерный дизайн олигонуклеотидов для определения уровня экспрессии генов ГП, ГР и Г6ФДГ. Установлено, что пероксид водорода подавляет метаболическую активность клеток и индуцирует апоптоз фибробластов линии L929, что сопровождается повышением степени экспрессии ГР и ГП.
Полученные данные представляют интерес с точки зрения регуляции образования АФК за счет изменений активностей ГР и ГП, взаимосвязанных с модификацией их экспрессии. Проведенные исследования способствуют расширению и углублению фундаментальных представлений о механизмах регуляции образования АФК с помощью ключевых ферментов глутатионовой антиоксидантной системы при развитии свободнорадикальных патологий.
Апробация работы. Основные результаты, полученные при выполнении
диссертационной работы, представлены на Всероссийской научно-
методической конференции с международным участием «Фармобразование-
2010» (Воронеж, 2010), на научно-практической конференции «Актуальные
вопросы экспериментальной и клинической онкологии» Томск, 2010), на
научно-практической конференции с международным участием «Актуальные
проблемы современной науки и образования» (УФА, 2010), на международной
Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века»
(Пущино, 2010), на школе-конференции «Фундаментальная наука для
биотехнологии и медицины» (Москва, 2010), на конференции
«Информационно-вычислительные технологии в решении фундаментальных проблем и прикладных научных задач», (Москва, 2010).
Публикации. Основные результаты диссертационной работы изложены в
13 публикациях - в 3 статьях и 10 тезисах.
На защиту выносятся следующие положения:
В условиях оксидативного стресса, вызванного развитием адреналинового миокардита, выявлена корреляционная зависимость уровня ДК, параметров БХЛ, отражающих скорость свободнорадикальных процессов, и активностей ГП и ГР в сердце крыс, возрастающих за счет индукции синтеза ферментов de novo.
При токсическом поражении печени крыс интенсификация свободнорадикального окисления биосубстратов коррелирует с возрастанием активностей ГП и ГР, что сопряжено с увеличением уровня их экспрессии.
Развитие СД2 сопровождается интенсификацией свободнорадикальных процессов, что коррелирует с активацией ГП/ГР- системы. Однако в условиях данной патологии происходит индукция синтеза ГР и снижение уровня экспрессии ГП.
Воздействие пероксида водорода на фибробласты линии L929 приводит к снижению их метаболической активности, пикнозу и кариорексису, являющимися признаками апоптоза, развивающегося в клеточной культуре, и возрастанию степени экспрессии ГП и ГР.
Предложена схема процессов регуляции экспрессии ГП и ГР и их участия в контроле свободнорадикального гомеостаза при оксидативном стрессе различной этиологии.
Структура и объем работы. Диссертация представлена на 180 страницах текста, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения полученных результатов (6 глав), заключения, выводов, списка литературы. Иллюстративный материал включает 59 рисунков и 25 таблиц.
Свободные радикалы и оксидативный стресс
Компоненты САЗ сами подвергаются повреждающему действию АФК, что приводит к нарушению их правильного функционирования и, как следствие, к повреждению последующих компонентов. Ситуацию, когда наблюдается нарушение баланса между образованием активных форм кислорода и работой антиоксидантной системы защиты принято называть окислительным стрессом. Это определение в 1985 году ввел Sies в своей книге “Oxidative Stress” [239]. В процессе окислительного стресса происходит повреждение основных клеточных структур: ДНК, белков и липидов. Часто не ясно, что является первичной мишенью действия АФК, так как механизмы окислительного стресса сильно перекрываются.
Молекула ДНК может повреждаться напрямую, в основном -гидроксил-радикалом. ОН может действовать на пуриновые и пиримидиновые основания, а также на остатки рибозы и дезоксирибозы [202]. Супероксид-анион обладает более избирательным действием, взаимодействуя с гуаниновыми основаниями, в результате чего образуются окисленные производные, в том числе и 8-гидроксигуанин. Радикалы, образующиеся при перекисном окислении липидов (R(V, RO") также повреждают молекулы ДНК.
В ряде экспериментов было показано, что митохондриальная ДНК (мтДНК) подвергается окислительному действию АФК в большей степени, чем ядерная [139, 231, 97]. При взаимодействии пероксида водорода, образующегося из супероксид-аниона из дыхательной цепи, с ионами Fe и Си, пулы которых находятся в митохондриальных мембранах, образуется гидроксилрадикал, который и повреждает молекулу мтДНК, тем более, что митохондриальная ДНК в отличие от ядерной не защищена гистонами и находится в непосредственной близости от источника АФК [114]. Повреждение мтДНК приводит к неправильному синтезу компонентов дыхательной цепи, кодируемых ею, вследствие чего нарушается правильная работа ЭТЦ и усиливается образование супероксид-аниона.
Повреждение ДНК также может происходить в результате действия эндонуклеаз, которые активируется при повышении концентрации внутриклеточного Са2+, что в свою очередь может происходить в ходе окислительного стресса [233].
Вследствие действия АФК на молекулу ДНК образуются одноцепочечные и двухцепочечные разрывы, и вторые более опасны, чем первые. Такая модификация оснований приводит к появлению мутаций. которые возникают напрямую или в результате репарации или репликации ДНК [189].
Другая мишень окислительного действия АФК - полиненасыщенные цепи жирных кислот, входящих в состав клеточных мембран, а также липопротеины. Процесс пероксидного окисления липидов (ПОЛ) состоит из четырех последовательных стадий [264].
В процессе инициации ПОЛ происходит атака сопряженных двойных связей ненасыщенных жирных кислот НО и НО2 , что приводит к появлению липидных радикалов;
Липидный радикал может реагировать с О2 с образованием пероксил-радикала, который в свою очередь взаимодействует с новыми молекулами ненасыщенных жирных кислот и приводит к появлению липидных пероксидов, которые достаточно стабильны при температуре тела (стадия пролонгации). Скорость этой реакции зависит от активности антиоксидантной системы клетки.
Однако при взаимодействии с комплексами железа они превращаются в активные радикалы, продолжающие цепь окисления липидов (стадияразветвления):
Реакции ПОЛ могут терминироваться при взаимодействии радикалов друг с другом: люминесценция. Липидные радикалы, образующиеся в результате данных реакций, являются нестабильными интермедиатами, которые нельзя выделить или измерить их количество обычными биохимическими методами. Для характеристики ПОЛ обычно измеряют накопление малонового диальдегида (МДА), конечного продукта пероксидного окисления липидов. Однако это не совсем корректно, так как МДА является также конечным продуктом окисления аминокислот и нуклеотидов [198]. Более чувствительным и корректным является метод хемилюминесценции, с помощью которого возможно измерить уровень липидных диоксидных радикалов (ЬОг ), так как их взаимодействие приводит к эмиссии фотона [264].
Образующиеся липидные радикалы, в том числе и вторичные, такие как 4-гидроксиноненаль и МДА, как уже упоминалось выше, могут атаковать молекулы белков и нуклеиновых кислот. Альдегидные группы этих соединений образуют межмолекулярные сшивки, что сопровождается нарушением структуры макромолекул и дезорганизует их функционирование [93].
Окисление липидов, входящих в состав клеточных мембран, приводит к нарушению их структурной целостности, что может вызвать повреждение мембранносвязанных белков [230]. Так, например, ПОЛ может приводить к инактивации мембранных рецепторов, а также таких ферментов, как глюкозо-6-фосфатаза, глицерол-З-фосфатацилтрансфераза, Са2+-АТФаза эндоплазматического ретикулума и Na/K-АТФаза, принимающей непосредственное участие в поддержании ионного гомеостаза клетки [13, 120]. В митохондриях могут повреждаться как ферменты матрикса, так и компоненты дыхательной цепи.
Белки также могут повреждаться и непосредственно при действии свободных радикалов. В активных центрах ферментов могут окисляться SH-группы либо сами аминокислоты. Если белок содержит молекулу металла с переменной валентностью, то в присутствии пероксида водорода образуется гидроксильный радикал, окисляющий аминокислоты в активном центре фермента, что может привести к его инактивации. Так, повреждение митохондриальной аконитазы, комплекса I и сукцинатдегидрогеназы, ферментов, содержащих железо-серные кластеры, в организме мышей, нокаутных по Мп-СОД, где супероксиданион не утилизируется в достаточной степени, приводит к нарушению функционирования цикла трикарбоновых кислот, работы ЭТЦ, образованию АТФ, что вызывает накопление лактата и развитие лактацидоза с повреждением базальных ганглиев [225]. Гликирование белков и окисление карбоксильных групп приводит к образованию поперечных сшивок между белковыми молекулами [232, 99] и нарушению их активности. Инактивация ферментов, отвечающих за репарацию ДНК, таких как эндонуклеазы, лигазы и др., может увеличивать уровень поврежденности ДНК и частоту появления мутаций [155].
Поврежденные макромолекулы либо подвергаются репарации, либо уничтожаются, однако темпы репарации отстают от темпов появления нарушений, и в ходе онтогентического развития в организме накапливаются поврежденные молекулы [152, 203].
Накопление неисправимых повреждений макромолекул может приводить к смерти клетки либо по пути некроза, либо по пути апоптоза.
Во время некроза наблюдается потеря целостности всех клеточных мембран, включая плазматическую, митохондриальную, пероксисомальную и лизосомальную. После этого происходит разрыв мембран клетки и выход ее содержимого в окружающую среду. Таким образом, затрагиваются и все окружающие клетки, так как наружу попадают лизосомальные ферменты и различные прооксиданты, включая ионы металлов с переменной валентностью.
В отличие от некроза, на ранних стадиях апоптоза наблюдается сморщивание клетки, конденсация и фрагментация хроматина. Кроме этого, наблюдается нарушение структуры цитоскелета, фрагментация ядра и распад клетки на апоптотические тельца, в результате чего не происходит нарушения целостности лизосомальной и митохондриальной мембран и высвобождения содержимого органелл в окружающую среду [262].
Свободнорадикальное окисление в патогенезе сахарного диабета
Окисление глюкозы в условиях гипергликемиии подавления активности ферментов гликолиза происходит альтернативными путями, включая полиольный путь, гексозаминовый путь, путь неферментативного гликозилирования, в результате чего и генерируются свободные радикалы [8]. Подтверждено, что в образовании источников свободных радикалов при СД участвуют шесть путей метаболизма глюкозы. Во-первых, активируется аутоокисление глюкозы и ее метаболических интермедиатов (глюкозо-6-фосфата и фруктозо-6-фосфата) [8, 100, 168, 269, 270], в результате чего образуются реактивные дикарбонильные сахара — метилглиоксаль и 3-дезоксиглюкозон, запускающие процесс неферментативного, или аутоокислительного, гликозилирования белков с образованием активных форм кислорода [217]. Этот процесс ведет к апоптозу клетки [236], что подтверждает причинно-следственную связь окислительного и карбонильного стрессов [56]. Во-вторых, происходит гликозилирование протеинов и накопление конечных продуктов [6, 8, 100, 116]. Другие белки модифицируются в процессе гликозилирования, включая липопротеины низкой плотности (ЛПНП) и коллаген [270, 109, 104]. В-третьих, активация обмена сорбитола, или полиольного пути метаболизма глюкозы, приводит не только к генерации свободных радикалов, но и к снижению уровня восстановленного глутатиона. В-четвертых, в результате утилизации глюкозы по гексозаминовому пути образуется конечный продукт — уридинфосфат-К-ацетилглюкозамин, который может участвовать в гликозилировании белков по остаткам серина и треонина, что коррелирует с инсулинорезистентностью, а также с продуцированием активных форм кислорода [90]. В-пятых, при подавлении гликолиза одновременно накапливаются триозофосфаты, которые могут превращаться в а-глицерофосфат — предшественник диацилглицерола, с последующей активизацией протеинкиназы С (РКС). Кроме того, накопление триозофосфатов также приводит к образованию карбонильных соединений, участвующих в окислительной модификации белков, липидов и ДНК [43]. В-шестых, происходит повышение скорости процессов окислительного фосфорилирования. Необходимо отметить, что при СД чрезмерно увеличивается продукция супероксида митохондриальными клетками [111], цитохромом Р-450, ксантиноксидазой, РКС-зависимой активацией НАДН/НАДФН-оксидазой [156]. Ишемия, гипоксия и псевдогипоксия тканей, наблюдаемые при СД, являются дополнительными факторами, способствующими повышенному образованию реактивных оксидантов в различных органах и тканях [6]. В механизмах повышения степени ОС при диабете участвует и гиперинсулинемия, которая активирует симпатическую нервную систему. Результатом этого является увеличение катехоламин вызванного образования свободных радикалов, как непосредственно, так и через повышение продукции неэтерифицированных жирных кислот. Это усиливает неблагоприятные эффекты гипергликемии [6, 208]. Однако при СД происходит одновременно истощение антиоксидантов [6, 100, 145, 131, 259]. Так, генерация глутатиона задерживается в присутствии высокого уровня глюкозы [100]. Снижение уровня глутатиона является одной из причин уменьшения активности N0 при СД [206]. Вследствие нарушения концентрации ионов некоторых металлов и гликозилирования изменяется активность СОД. Немаловажное значение имеют истощение или гликирование липопротеинов высокой плотности (ЛПВП), что значимо изменяет их функцию [228].
Подтверждением первичности окислительной модификации белковых молекул является наличие выраженных изменений в области анулярных липидов [75]. Установлено, что окисленные модифицированные белки продуцируют свободные радикалы, истощая клеточные антиоксиданты. Карбонильные интермедиаты (глиоксаль, метилглиоксаль,3-деоксиглюкозон) обеспечивают окислительное гликирование белков, формируя конечные продукты неферментативного гликозилирования (КПНГ), которые, в свою очередь, могут быть источниками АФК [56]. Связывание КПНГ с рецепторами на клеточной мембране может приводить к генерации прооксидантного состояния в клетках эндотелия, характеризующегося активацией пострецепторного сигнала, генерацией внутриклеточных супероксидных радикалов и активацией экспрессии генов [208, 88]. Липидная пероксидация и неферментативное гликозилирование включают аналогичные реакции и промежуточные продукты и, вероятно, могут усиливать друг друга. Свободные радикалы, образующиеся при аутоокислении глюкозы, или продукты гликозилирования, могут инициировать пероксидацию липидов в липопротеиновых частицах, способствуя прогрессированию атерогенеза [56]. Рецепторы для продуктов гликозилирования найдены на макрофагах, эндотелиальных клетках — такие рецепторы называются рецепторами КПНГ (рКПНГ). Через взаимодействие КПНГ с рКПНГ следует череда внутриклеточных модификаций, что может быть значимо в развитии атеросклероза [89]: при этом усиливается продукция молекул адгезии, которые являются начальной ступенью в повреждении сосудов. В добавление к этому следует сказать, что инкубация эндотелиальных клеток со специфическими КПНГ приводит к внутриклеточной генерации пероксида водорода через НАДФН-оксидазу — опосредованный механизм [265]. КПНГ-опосредованная индукция ОС также запускает каскад внутриклеточных сигнальных систем (вовлекая р21 и МАР-киназу), приводящих к транскрипции фактора активации [86]. Свободные радикалы активизируют ядерный фактор транскрипции (NF-кВ), в итоге индуцируются полиольный путь, диацилглицерол и РКС, неферментативное гликозилирование, выброс цитокинов [6, 208, 100, 156, 145, 89]. Фактор NF-кВ является своеобразным мостом между метаболическими и сосудистыми нарушениями.
Он опосредует выделение цитокинов, которые, в свою очередь, приводят к эндотелиальной дисфункции, а также к дефициту секреции и действия инсулина. Свободные радикалы через фактор NF-кВ активируют как стресс-чувствительные механизмы развития инсулинорезистентности, так и уменьшение синтеза инсулина [208], особенно на первой стадии глюкозоиндуцированной секреции инсулин. Усиление ПОЛ провоцирует дальнейшие разрывы в структуре митохондриального белка фратаксина в Р-клетках поджелудочной железы, что приводит к прогрессированию заболевания [250]. Свободные радикалы увеличивают число мутаций в митохондриальной ДНК, имеющей ограниченные возможности к репарации. Необходимо учесть, что с возрастом накапливаются точечные мутации в митохондриальной ДНК. СД характеризуется глюколипотоксичностью, которая вызывает дисфункцию митохондрий и избыточное образование свободных радикалов, инициирующих апоптоз клеток [55].
Окислительный стресс через ядерный фактор транскрипции активирует РКС. Эта активация объясняет многие сосудистые нарушения, в том числе изменения сосудистой проницаемости, факторов роста [254], экстрацеллюлярных компонентов матрикса [250], апоптоз [229]. Многие авторы указывают на роль РКС в развитии эндотелиальной дисфункции [6, 56], а также в активации экспрессии гена сосудистого эндотелиального фактора роста, который оказывает влияние на сосудистую проницаемость и ангиогенез [146] через РКС-зависимые пути и стресса активированные протеинкиназы [234], что способствует развитию микро- и макроангиопатий. Повышением активности РКС можно объяснить активацию адгезии тромбоцитов к сосудистой стенке и ускоренное развитие атероматоза [56].
Исследования показывают, что КПНГ со специфическими рецепторами не только увеличивают разрушение модифицированных протеинов, но и стимулируютсигнальные пути [250, 88], что приводит к изменению эндотелий зависимой вазодилатации, повышению прокоагуляционной активности, индукции молекул адгезии, увеличению вазоконстрикции [182], т.е. возникает дисфункция эндотелия. Гликирование антиоксидантных ферментов усиливает продукцию свободных радикалов и еще более усугубляет выраженность ОС. Наличие гликирования существенно изменяет скорость модифицирования ЛПНП, а значит, и прогрессирование атеросклероза. КПНГ способствуют нарушениям структуры лизина и аргинина, а значит, и нарушению синтеза оксида азота.
Следовательно, механизмы, лежащие в основе развития как самого СД, так и его осложнений, одни и те же, значит, корригируя их, возможно остановить прогрессирование заболевания и провести профилактику осложнения. Как уже было показано, для СД характерен замкнутый порочный круг образования свободных радикалов и разорвать этот круг возможно только с помощью антиоксидантов. Состояние ОС и активность антиоксидантных ферментов у больных СД изучаются давно. Особый интерес вызывает дисбаланс этих систем при СД 2-го типа (СД 2). Установлено [73, 100], что активация свободнорадикального окисления наблюдается как при впервые выявленном СД 2, так и при его длительном течении. Высокий уровень окисления отмечен уже на доклинических стадиях [9].
Экспрессия глутатионредуктазы в сердце крыс при адреналиновом миокардите
Для оценки экспрессии гена глутатионредуктазы были использованы 3 гена “домашнего хозяйства”: альбумин (Alb), -актин (Act), глицераль-дегид-3-фосфатдегидрогеназа.
Белок альбумин проявляет высокую связывающую способность по отношению к различным низкомолекулярным соединениям и содержит гидрофильные и липофильные связи. Альбумин широко используется в качестве “гена домашнего хозяйства” и является высокопредставленным транскриптом во многих тканях, включая печень и сердце. Ген, кодирующий альбумин (идентификационный номер 24186), расположен в 14 хромосоме в локусе 14р22 (рис.15). Для амплификации участка транскрипта в работе использовались праймеры, подобранные с помощью программы «Primer Express» (таблица 2). Все возможные системы праймеров, подвергались компьютерному анализу на предмет образования димеров и шпилек. Для работы выбирали оптимальные олигонуклеотиды, характеризующиеся минимальной энергией образования шпилек и димеров (табл. 3, 4, 5).
Глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназа является ферментомлиза. Глицеральдегид-3-фосфат окисляется с образованием 1,3 бисфосфоглицерата. Фермент состоит из четырех идентичных полипептидов, образующих тетрамер. Каждый полипептид содержит по четыре - SH-группы, принадлежащие остаткам цистеина. Одна из них находится в активном центре фермента. Полагают, что она принимает участие в окислении глицеральдегид-3-фосфата. Сначала субстрат соединяется с остатком цистеина дегидрогеназы, образуя тиополуацеталь, который окисляется в тиоловый эфир. Атомы водорода, отщепляемые при этом окислении, переносятся на связанный с ферментом НАД. Глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназаявляется “геном домашнего хозяйства” и присутствует во всех органах млекопитающих. Идеограмма, показывающая локализацию гена на хромосоме (локус 4q42) представлена на рис.16. Праймеры для амплификации транскрипта глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы представлены в таблице 6. Олигонуклеотиды анализировались с помощью программного обеспечения Oligo Analyzer 3.1 на предмет образования шпилек и димеров. Для эксперимента выбирали праймеры, характеризующиеся самой низкой энергией образования шпилек и димеров (табл.7,8,9).
Актин —белок, полимеризованная форма которого образует микрофиламенты, которые являются одними из основных компонентов цитоскелета эукариотических клеток. Вместе с белком миозином образует основные сократительные элементы мышц— актомиозиновые комплексы саркомеров.
Актин часто используется в качестве “гена домашнего хозяйства” и характеризуется стабильной экспрессией во многих тканях. Ген актина локализован в локусе 12р11(рис.17). Для проведения ПЦР в режиме реального времени транскрипта актина в работе использовались олигонуклеотиды, подобранные с помощью программы «Primer Express» (таблицаЮ), которые подвергались дальнейшему анализу. Для проведения ПЦР выбирали праймеры, характеризующиеся минимальной способностью к образованию шпилек и димеров (табл.11,12,13).
Ген глутатионредуктазы (ГР) локализован в 16 хромосоме (рисЛ 8) и характеризуется незначительной экспрессией в сердце. Для ПЦР-амплификации участка мРНК гена ГР в работе использовались праймеры, подобранные с помощью программы «Primer Express» (таблица 14). Все возможные системы праймеров, подвергались компьютерному анализу на предмет димерообразования. Для работы выбирали оптимальные олигонуклеотиды, характеризующиеся минимальной энергией образования шпилек и димеров (табл.15,16,17).
Для определения уровня экспрессии гена ГР из сердца крыс на 24ч развития адреналинового миокардита была экстрагирована тотальная РІЖ. Электрофореграмма выделенной РІЖ свидетельствует, что количество 28S рРНК значительно преобладает над 18S рРНК (рис.19). Это позволяет сделать заключение об отсутствии деградации полученной РНК под действием рибонуклеаз. После проведения реакции обратной транскрипции, были оптимизированы временные и температурные характеристики ПЦР-РВ и подобрана концентрация праймеров для обеспечения высокой эффективности амплификации.
Анализ экспрессии гена ГР с учетом эффективности амплификации позволил установить, что через 24 часа после индукции патологии уровень этих транскриптов увеличивается. Экспрессия ГР возрастала в 2,8 раза относительно нормы (рис.20).
Очевидно, возрастание экспрессии ГР связано с её участием в поддержании определенного пула GSH, необходимого как для непосредственного лимитирования образования СР, так и для более интенсивного функционирования ГП-реакции в условиях окислительного стресса.
Экспрессия гена глутатионредуктазы и глутатионпероксидазы при интенсификации свободнорадикального окисления в культуре фибробластов линии L929 пероксидом водорода
После инкубации клеточной культуры фибробластов Ь929 с 50мкМ пероксидом водорода в течение Зч из них была выделена РНК, которую использовали для проведения реакции обратной транскрипции и ПЦР-амплификации в режиме реального времени с геноспецифичными праймерами.
Проведенные исследования экспрессии гена ГР показывают, что при воздействии 50мкМ пероксида водорода уровень транскриптов Gsr увеличивается в 1,7 раза относительно нормы (рис.37).
Было обнаружено увеличение экспрессии ГП в 6,1 раза (рис. 38). По всей видимости, индукция ГП может происходить также за счет активации свободными радикалами фактора транскрипции NFkB.
Возможно, что интенсификация транскрипции гена ГР и ГП вызвана активацией транскрипционного фактора NFkB свободными радикалами, образующимися в результате вовлечения пероксида водорода в реакцию Фентона. Поскольку пероксид водорода способен легко проникать через мембраны клеток и генерировать гидроксил-радикал в присутствии двухвалентного железа, вызывать окисление 8Н-групп белков, пероксидное окисление ненасыщенных жирных кислот, то, очевидно, он может выступать в качестве фактора, индуцирующего апоптоз.
Образование ОН может также осуществляться в реакции Хабера-Вайса, в которой также участвует Н2О2 и ионы металлов переменной валентности (например, Ре , ОТ), восстанавливающиеся в ходе этого процесса [70], что также может вносить вклад в усиление СО биосубстратов.
Таким образом, полученные данные свидетельствуют о возможности координации функционирования ГР, ГП с интенсивностью протекания реакции Фентона и Хабера-Вайса.
Многоступенчатая система антиоксидантной защиты выполняет в организме функцию контроля за уровнем клеточных АФК и является показателем резистентности клеток к окислительному стрессу. Специфичность в распределении отдельных компонентов САЗ в тканях и разных компартментах клеток указывает, что она выполняет роль не столько подавления, сколько регуляции образования и взаимопревращений АФК.
Согласно полученным результатам к 24ч развития адреналинового миокардита происходит увеличение удельной активности ГР и ГП в сердце крыс в 1,8 в 1,4 раза соответственно по сравнению с контрольной группой животных. Также показано, что происходит активация процессов СО биосубстратов в сердце в условиях данного патологического состояния. Интенсивность патологического процесса в сердце при введении адреналина оценивали с помощью активностей АлАТ, АсАТ и сердечной изоформы креатинкиназы (КК-МВ) в сыворотке крови. Активность КК-МВ и АсАТ, являющихся маркерными ферментами повреждения миокарда, возрастала при адреналиновом миокардите в 7,2 и 2,6 раза соответственно по сравнению с контролем. Наблюдающиеся изменения активностей ферментов, являющихся критериями выраженности процессов цитолиза в тканях сердца (АсАТ, КК-МВ), свидетельствуют о нарушении функционирования сердца при патологии. Показано, что параметры биохемилюминесценции - Imax и 8, отражающие уровень АФК, значительно возрастают к 24 часу развития адреналинового миокардита. Коэффициенты корреляции, отражающие зависимость между активностью ГР и содержанием диеновых конъюгатов, Imax и 8 имеют значения 0,9, 0,8, 0,6. Значения коэффициентов корреляции между концентрацией диеновых конъюгатов, Imax, 8 и активностью ГП: 0,7, 0,9, 0,8 соответственно. Таким образом, показано, что зависимость между содержанием диеновых конъюгатов, Imax, 8 взаимосвязана с активностью ГР/ГП системы при адреналиновом миокардите. Необходимо отметить, что согласно результатам определения показателей биохемилюминесценции в сердце крыс при адреналиновом миокардите происходит мобилизация АОС. Об этом свидетельствует увеличение tga2 кривой биохемилюминесценции. При этом уровень компенсаторных механизмов, направленных на снижение интенсивности свободнорадикальных процессов, оказывается недостаточным и в клетках миокарда в условиях адреналинового миокардита происходит увеличение содержания продуктов ПОЛ. Исследование экспрессии ГР/ГП системы при адреналиновом миокардите у крыс показало, что активация ферментов происходит за счет гиперэкспрессии их генов в условиях патологии. По всей видимости, повышенная активность ГР и ГП необходима для подавления свободнорадикальных процессов.
