Введение к работе
Актуальность проблемы
Согласно данным ВОЗ онкологические заболевания занимают второе место по смертности после сердечно-сосудистых заболеваний. В России рак толстой кишки занимает второе место в структуре женской онкологической заболеваемости и третье место в мужской после рака предстательной железы и легкого (Чиссов В.И. и др. 2010). В связи с этим изучение биохимических особенностей течения рака толстой кишки является актуальной проблемой.
Дифференцировочная молекула CD38 кодируется геном, состоящим из восьми экзонов и расположенном на четвертой хромосоме в локусе 4p15. Ряд однонуклеотидных полиморфизмов гена влияют на уровень его экспрессии и ассоциированы с онкологическими заболеваниями крови и легких (. et al., 2012; T.K. et al., 2013). Еще одним регулятором экспрессии гена CD38 является метилирование сайтов связывания с транскрипционными факторами (Ferrero E. et al., 2000). Для гена описано две формы мРНК CD38 – полноразмерная и альтернативная. У альтернативной формы делетирован третий экзон, что приводит к сбою рамки считывания (Nata K. et al., 1997). Белковый продукт гена обладает энзиматической активностью в отношении цАДФ-рибозы. CD38 играет важнейшую роль в активации, пролиферации, адгезии и хемотаксисе клеток иммунной системы. Описана физическая ассоциация CD38 с T и В-клеточным рецептором, CD16 и молекулами HLA II класса. Известна мембранная и растворимая формы молекулы CD38 (Malavasi F., 2008; A.L. et al., 2013). Экспрессия белка CD38 на мембране клеток используется в качестве прогностического и диагностического маркера при лейкемиях, миеломе и хроническом лимфолейкозе (Pearce L. et al., 2010; . et al., 2012), а растворимая форма CD38 может быть использована при оценке эффективности лечения рака молочной железы (Новиков В. В. и др., 2005). При раке толстой кишки исследования гена CD38 проводились в основном с использованием клеточных линий (Yang S. et al., 2004). В литературе недостаточно представлены данные об экспрессии CD38 в периферической крови и первичных опухолевых очагах больных раком толстой кишки. Остаются не изученными ассоциации однонуклеотидных полиморфизмов в гене CD38, метилирование его промотора, уровень мРНК и растворимой формы белка у больных раком толстой кишки.
Целью работы явилось изучение особенностей экспрессии гена CD38 в периферической крови и первичных опухолевых очагах больных раком толстой кишки.
Задачи исследования
1) Установить частоту обнаружения полноразмерной и альтернативной форм мРНК CD38 в периферической крови и опухолевых очагах больных раком толстой кишки.
2) Оценить уровни мРНК и растворимой формы белка CD38 у больных раком толстой кишки и сопоставить с их клиническими особенностями течения заболевания.
3) Оценить наличие метилирования CpG динуклеотидов в промоторном регионе гена СD38 в периферической крови и опухолевых очагах больных раком толстой кишки.
4) Определить частоту однонуклеотидной замены 1470С/Т (rs1130169) в гене CD38 и сопоставить ее с уровнем мРНК и растворимой формы белка CD38 у больных раком толстой кишки.
Научная новизна работы
Впервые установлена частота обнаружения мРНК полноразмерной и альтернативной форм CD38 в периферической крови и опухолевых очагах больных раком толстой кишки, причем частота обнаружения полноразмерной формы мРНК была выше частоты обнаружения альтернативной формы.
Показано, что в крови здоровых доноров, в крови и опухолевых очагах больных раком толстой кишки уровень альтернативной формы мРНК CD38 значительно ниже уровня полноразмерной формы.
Установлено, что соотношение уровня полноразмерной формы мРНК CD38 к альтернативной в крови доноров, крови и очагах опухоли больных раком толстой кишки различается.
Продемонстрировано, что сывороточный уровень суммарной и олигомерной фракций растворимых молекул CD38 выше у больных раком толстой кишки, чем у доноров.
Установлено, что уровень мРНК полноразмерной и альтернативной форм CD38 в крови больных раком толстой кишки значительно выше, чем в опухолевых очагах тех же больных.
Впервые установлено, что CpG динуклеотиды в позициях +754, +761, +765 и +791 гена CD38 метилированы в периферической крови и опухолевых очагах, полученных от больных раком толстой кишки.
Впервые изучена частота полиморфного варианта 1470С/Т (rs1130169) гена CD38 у здоровых доноров и больных раком толстой кишки, проживающих на территории Нижегородской области. Продемонстрирована ассоциация аллели С с заболеванием. Показано, что у людей с генотипом СС повышен уровень мРНК CD38 по сравнению с генотипом ТТ по локусу 1470CD38.
Практическая значимость работы
На основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени разработан метод определения уровня полноразмерной и альтернативной форм мРНК CD38, который применим в качестве дополнительного мониторингового показателя при раке толстой кишки. Показано значительное увеличение уровня мРНК CD38 в периферической крови больных при метастазировании опухоли в лимфатические узлы.
На основе ПЦР разработан метод детекции однонуклеотидного полиморфизма 1470С/Т (rs1130169) гена CD38 человека, который может быть использован для определения групп с повышенным риском развития рака толстой кишки. Аллель 1470С ассоциирована с заболеванием.
Полученные данные могут быть использованы в преподавании курсов по биохимии в вузах биологического и медицинского профиля.
Основные положения, выносимые на защиту
1. В опухолевых очагах, полученных от больных раком толстой кишки, детектируется мРНК CD38.
2. Уровень мРНК полноразмерной формы выше альтернативной у доноров и больных раком толстой кишки.
3. В крови больных раком толстой кишки уровень мРНК CD38 полноразмерной формы выше, а уровень мРНК альтернативной формы ниже, чем в крови здоровых доноров.
4. В периферической крови и опухолевых очагах больных раком толстой кишки CpG динуклеотиды в позициях +754, +761, +765 и +791 гена CD38 метилированы.
5. Аллель 1470С (rs1130169) гена CD38 встречается чаще у больных раком толстой кишки, чем у здоровых доноров и ассоциирован с повышенным уровнем мРНК CD38.
Апробация работы
Результаты работы представлены на II Международной научно-практической конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии» (Казань, 2008), 14 Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология наука XXI века» (Пущино, 2012), II Всероссийской научной конференции с международным участием «Наноонкология» (Тюмень, 2010), XXIII зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнолигии» (Москва, 2011), X Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты» (Москва, 2011), III Научно-практической школе-конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских организаций Роспотребнадзора «Современные технолигии обеспечения биологической безопасности» (Оболенск, 2011), Всероссийской научно-практической конференции «Современные проблемы военной медицины, обитаемости и профессионального отбора» (С. Петербург, 2011), III Всероссийской научной конференции с международным участием «Наноонкология» (Саратов, 2011), III Международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине» (Казань,2012), ХI Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты (экспериментальная онкология)» (Н. Новгород, 2012), Белорусско-Российской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты» (Минск, 2013), VI Объединенном иммунологическом форуме (Н. Новгород, 2013).
Апробация диссертации состоялась на расширенном заседании кафедры молекулярной биологии и иммунологии ННГУ им. Н.И. Лобачевского 12 сентября 2013 года и на заседания кафедры биохимии Института фундаментальной медицины и биологии ФГАОУВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет» 5 февраля 2014 года.
Структура и объем диссертации
Диссертационная работа в объеме 143 листа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, собственных результатов и их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы. Диссертационная работа иллюстрирована 35 рисунками и 24 таблицами. Библиографический указатель включает 197 источников литературы (22 отечественных и 175 иностранных).
