Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 7
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ II
ГЛАВА I. ФЕРМЕНТАТИВНОЕ РАЗРУШЕНИЕ КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИ ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ
1.1. Структурные вещества клеточных стенок высших растений и характеристика ферментов, расщепляющих эти вещества II
1.2. Изолирование жизнеспособных протопластов растений под действием ферментных препаратов 20
ГЛАВА 2. ПЕКТОЛИТИЧЕСКИЕ И ЦЕЛЖЛОЛИТИЧЕСКИЕ КОМПЛЕКСЫ И МЕТОДЫ ИХ ВЫДЕЛЕНИЯ
2.1. Неполитические и целлюлолитические системы у микроскопических грибов 29
2.2. Гель-хроматография как эффективный метод очистки белков и ферментов 35
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1. Ферментные препараты как источник получения высокоактивных комплексов пекти-назного и целлюлазного действия 41
3.2. Методы определения активности ферментов
3.2.1. Определение активности ферментов пектолитического комплекса 41
3.2.2. Определение активности целлюлаз 43
3.2.3. Определение активности ферментов, присутствующих в пектиназном и целлюлазном комплексах (ксиланаза, лихениназа, ламинариназа, инвертаза, Ы -ацетил- Jb- D-глю-козаминидаза, протеаза, амилаза) 48
3.3. Определение содержания белка, нейтральных Сахаров и цветности в ферментных препаратах 50
3.4. Методы выделения и очистки пектиназных и целлкшазных препаратов 51
3.5. Методы биохимической характеристики очищенных ферментных препаратов 56
3.6. Выделение растительных протопластов 57
ГЛАВА 4. РАЗРАБОТКА НОШХ ПРИЕМОВ ГЕЛЬ-ХРОМАТОГРАФИИ НА АКРИЛЕКСЕ ДНЯ ОЧИСТКИ ІЖТОЛИТИЧЕСКЙХ И ЦЕЛЛЮ-ЛОЛИТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ .
4.1. Влияние концентрации белков и солей на структуру зерен полиакриламидного геля
в статических условиях 59
4.2. Влияние вязких концентрированных растворов на структуру геля при хроматографии на
колонках 60
4.3. Изучение режима гель-хроматографии кон цен трированных ферментных растворов для
масштабирования процесса очистки 67
ГЛАВА 5. РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ ВЫСОКОАКТИВНОГО ПРЕПАРАТА ПЕКГИНАЗЫ ("ПЕКТИНАЗА-бОО") НА ОСНОВЕ ГЕЛЬ-ХРОМАТОГРАФИИ
5.1. Испытание разных приемов очистки пектоли-тического комплекса из препаратов пекто-фоетидина ПГОх и пектофоетидина ГЗх 74
5.2. Получение высокоактивного пектолитического препарата по разным схемам и их сравни 4 тельная оценка 82
5.3. Характеристика компонентного состава препарата пектиназа-500 (в сравнении с пектиназой мацерозим 5-Ю) 90
5.4. Разделение ферментного комплекса пектиназы-500 гель-хроматографией на ультрагеле АсА-44 93
5.5. Разделение пектиназы-500 методом изоэлек-трического фокусирования и определение изоэлектрических точек отдельных компонентов 96
5.6. рН-зависимость эндополигалактуроназы как основного компонента пектиназного комплекса, ответственного за процесс мацерации растительной ткани 100
ГЛАВА 6. РАЗРАБОТКА СХЕМЫ ПОЛУЧЕНИЯ ВЫСОКОАКТИВНОГО ЦЕЛЛКЖОЛИТИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА ("ЦЕЛЛКШАЗА-1000") С ПРИМЕНЕНИЕМ ГЕЛЬ-ХРОМАТОГРАФИИ
6.1. Испытание целліаяолитичеоких препаратов целлоконингин ПЮх, целлолигнорин ШОх, целловиридин ГЗх, целлокандин ГЗх при очистке их концентрированных растворов гель-хроматографией 103
6.2. Получение высокоактивного целлкшолити-ческого препарата из целлокандина ГЗх по разным схемам и их сравнительная оценка 107
6.3. Характеристика компонентного состава препарата целлкшаза-ЮОО (в сравнении с целлюлазой Онозука В-10) Ill
6.4. Изучение влияния рН на целлюлазную активность препаратов целлкшаза-1000 и Онозу ка К-10 ,. ИЗ
6.5. Стабильность высокоактивных целлюлолити ческих препаратов, полученных из целло кандина ГЗх, при хранении 114
ГЛАВА 7. ИЗУЧЕНИЕ И ПОДБОР УСЛОВИЙ ДНЯ ВЫДЕЛЕНИЯ РАСТИТЕЛЬНЫХ ПРОТОПЛАСТОВ С ПОМОЩЬЮ ПЕКТИНАЗЫ-500 И ЦЕЛЛКЖАЗЫ-ЮОО
7.1. Замена японского препарата мацерозим В-10 на препарат пектиназа-500 в методике выделения протопластов 117
7.2. Замена японского препарата целлюлазы Оно-зука К-10 на препарат целлюлаза-1000 при выделении протопластов 122
7.3. Получение жизнеспособных растительных протопластов с помощью двух препаратов -пектиназы-500 и целлкшазы-1000 126
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 129
ВЫВОДЫ 134
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 136
ПРИЛОЖЕНИЕ 1
Введение к работе
Развитие научно-исследовательских работ в области физико-химической биологии и биотехнологии и использование их достижений в медицине, сельском хозяйстве и промышленности определены директивами ХХУІ съезда КПСС.
Важнейшим звеном биотехнологии наших дней является клеточная технология, предусматривающая широкое применение в практике культур растительных и животных клеток. Возможности клеточной инженерии существенно увеличиваются при использовании протопластов, получаемых в результате удаления клеточной оболочки.
Протопласты являются удобной моделью при изучении генетических и физиологических свойств растений. Результаты этих исследований оказывают прямое влияние на получение для селького хозяйства новых гибридов с высокой урожайностью и максимальной устойчивостью к неблагоприятным факторам среды.
Благодаря интенсивному развитию энзимологии стало возможным выделение больших количеств протопластов с использованием мягких ферментативных методов. Для этих целей применяют ферментные препараты, содержащие комплекс таких ферментов, как пектиназы, цел-люлазы, гемицеллюлазы и ряд других.
В настоящее время микробиологическая промышленность нашей страны производит для различных отраслей народного хозяйства целый ряд технических и очищенных ферментных препаратов, в том числе препаратов пектиназного и целлюлазного действия, из которых могут быть выделены высокоактивные ферментные комплексы, пригодные для гидролиза межклеточного вещества и клеточных оболочек растений. Ряд зарубежных фирм выпускает такие препараты в качестве биохимреактивов с целью выделения растительных протопластов.
Принимая во внимание растущие масштабы клеточной инженерии, следует ожидать повышенного спроса в таких реактивах в ближайшем будущем.
Целью данной работы являлось создание новых отечественных препаратов "пектиназа-500" и "целлюлаза-1000", предназначенных для использования в качестве биохимреактивов для проведения исследований в области биохимии, физиологии и генетической инженерии растений.
Исходя из цели работы, были поставлены следующие задачи:
- исследовать особенности гелевой хроматографии концентрированных ферментных растворов в интенсивном режиме и разработать способ хроматографической очистки пектиназных и целлюлазных комплексов, обеспечивающий непрерывное использование гелевой колонки в течение многих хроматографических циклов;
- разработать схему очистки пектолитических и целлюлолити-ческих ферментных препаратов с сохранением их многокомпонентного состава на основе гель-хроматографии;
- охарактеризовать ферментные комплексы полученных препаратов по компонентному составу, биохимическим свойствам и сравнить их с зарубежными аналогами;
- исследовать действие пектиназы-500 и целлюлазы-1000 на растительную ткань и установить оптимальные условия образования изолированных клеток и протопластов на модели-листовой ткани табака;
- разработать метод ферментативного выделения жизнеспособных протопластов высших растений с использованием отечественных биохимреактивов для применения в клеточной технологии.
Изучение литературы по данному вопросу показало, что для получения высокоактивных, многокомпонентных пектиназно-целлюлазных систем необходима групповая очистка, которая может быть осуществ - 9 лена гель-хроматографией.
Научная новизна исследования состоит в разработке приёмов гель-хроматографии на плотно сшитом геле для концентрированных ферментных растворов. Изучение влияния интенсивных факторов (концентрации растворов, скорости элюирования, размеров колонок) на сжимаемость геля типа акрилекс и условий его регенерации позволило достигнуть многократного использования гелевой колонки объёмом 30 л и хорошей воспроизводимости хроматографического процесса. На способ хроматографической очистки получено авторское свидетельство $ 679588.
На основе гель-хроматографии разработаны схемы групповой очистки пектиназных и целлюлазных комплексов и получены новые высокоактивные ферментные препараты-биохимреактивы пектиназа-500 и целлюлаза-1000. На способ получения пектолитического препарата получено авторское свидетельство № 891775.
Впервые охарактеризован состав пектиназы-500 и целлюлазы-1000 по компонентам, их изоэлектрическим точкам и молекулярным массам.
Изучены сочетания ферментных отечественных и зарубежных препаратов (пектиназы-500, целлюлазы-1000, мацерозима 5-Ю и целлюлазы Онозука R-I0) при действии на листовую ткань табака как модельный растительный объект. Показано, что полученные нами препараты пектиназа-500 и целлюлаза-1000 обеспечивают хорошее изолирование жизнеспособных протопластов, а также выделение отдельных клеток растительных тканей.
Практическая ценность работы заключается в разработке и внедрении способа гелевой хроматографии высококонцентрированных ферментных растворов в интенсивном режиме, пригодного для очистки любых ферментов и других высокомолекулярных соединений от солей и низкомолекулярных примесей.
Разработанный способ хроматографической очистки положен в основу схемы получения высокоактивных препаратов пектиназы и целлшазы, внедрённой на Московском опытном заводе ферментных препаратов.
Созданы два новых отечественных биохимреактива - пектиназа-500 и целлкшаза-ЮОО, и разработана эффективная методика изолирования жизнеспособных протопластов высших растений с использованием этих препаратов. Показано, что препараты пектиназа-500 и целлюлаза-1000 могут быть с успехом использованы вместо зарубежных аналогов при выделении клеток и протопластов высших растений.
