Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Структурно-функциональные аспекты интрадиольного расщепления ароматического кольца - ключевой реакции микробной деградации ароматических соединений 8
1.1. Метаболические пути деградации ароматических соединений, ведущие к образованию ключевых интермедиатов 8
1.2. Пути разложения ключевых интермедиатов 11
1.3. Генетические, физико-химические и структурные аспекты интрадиольпых диоксигеназ 14
1.3.1. Степень идентичности аминокислотных последовательностей 14
1.3.2. Физико-химические свойства 16
1.3.3. Структурные свойства 26
1.3.3.1. Физические свойства кристаллов 26
1.3.3.2. Архитектура молекул 29
1.3.3.3. Координационная сфера Fe3+ активного центра 40
1.3.3.4. Механизмы связывания и расщепления субстрата 47
1.3.3.5. Взаимосвязь кинетических параметров и структуры ферментов. Характер взаимодействия субстратов и их аналогов с активным центром 54
Экспериментальная часть
Глава 2. Материалы и методы исследования 61
2.1. Штамм, использованный в работе 61
2.2. Культивирование штамма 61
2.2.1. Состав сред 61
2.2.2. Приготовление субстратов 61
2.2.3. Проведение ферментации и получение биомассы 61
2.3. Выделение ферментов 62
2.3.1. Получение бесклеточных экстрактов и определение концентрации белка 62
2.3.2. Определение активности ферментов 62
2.3.3. Очистка4-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназы 63
2.3.4. Очистка 3-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназы 64
2.4. Определение кинетических характеристик ферментов 65
2.5. Кристаллизация ферментов 65
2.6. Рентгеноструктурный анализ 69
2.6.1. Предварительный рентгеноструктурный анализ кристаллов ферментов..69
2.6.2. Рентгеноструктурный анализ, проводимый для разрешения трехмерной структуры ферментов 70
2.7. Методы структурного анализа 71
2.7.1. Структурный анализ белковых молекул 71
2.7.2. Структурный анализ молекул субстрата него аналогов 72
Глава 3. Результаты 73
3.1. Очистка ферментов 73
3.1.1. 4-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназа 73
3.1.2. 3-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназа 73
3.2. Кинетические свойства хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ 75
3.2.1. Субстратная специфичность ферментов 76
3.2.2. Ингибирование ферментов фенолом, его замещенными производными и бензоатом 79
3.2.3. Структурные свойства субстратов и их аналогов 80
3.2.4. Связь функционирования хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ с структурой субстратов и их аналогов 83
3.2.4.1. Связывание замещенных фенолов ферментами 83
3.2.4.2. Связывание замещенных пирокатехинов и его аналогов ферментами 84
3.2.4.3. Катализ замещенных субстратных аналогов 85
3.2.4.4. Избирательность хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ в отношении заместителя в положении СЗ-С4 бензольного кольца субстрата 87
3.4. Кристаллизация ферментов 87
3.4.1. Получение кристаллов 4-хлорпирокатехин 1,2-диоксигспазы 87
3.4.2. Получение кристаллов 3-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназы 89
3.5. Трехмерная структура молекул хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ, связь структуры и функции 92
3.5.1. Общая структура молекул 92
3.5.2. Молекулярная поверхность входа в активный центр хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ в сравнении с подобными структурами интрадиольных диоксигеназ известной структуры 95
3.5.3. Координационная сфера железа хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ 97
3.5.4. Форма и структура активных центров хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ 99
3.5.5. Сравнительный анализ структуры активного центра 4-хлорпирокатехип 1,2-диоксигеназы с структурами активных центров известных интрадиольных диоксигеназ 104
3.5.5.1. Структуры активных центров, соответствующие С4-атому бензольного кольца субстрата или субстратного аналога 104
3.5.5.2. Структуры активных центров, соответствующие СЗ-атому бензольного кольца субстрата или субстратного аналога. 104
3.5.5.3. Структуры активных центров, соответствующие С6-атому бензольного кольца субстрата или субстратного аналога 106
Обсуждение результатов 108
Выводы 122
Список литературы 123
- Степень идентичности аминокислотных последовательностей
- Кристаллизация ферментов
- Субстратная специфичность ферментов
- Координационная сфера железа хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ
Введение к работе
Актуальность проблемы. Ароматические соединения содержатся в биосфере повсюду и имеют как природное, так и искусственное происхождение. Самым большим природным источником ароматических соединений служит растительный полимер - лигнин. Другим не менее масштабным источником ароматических соединений является хозяйственная и промышленная деятельность человека. Большинство ксенобиотиков, обладая высокой токсичностью, используются или образуются в процессе промышленного производства пластмасс, бумаги, смазочных материалов, охлаждающих жидкостей, взрывчатых веществ. В качестве загрязнителей окружающей среды также выступают гербициды, пестициды и инсектициды, применяемые в сельском хозяйстве. Основная нагрузка по разложению ароматических соединений в биосфере ложится на микроорганизмы, имеющие специфические пути деградации. В процессе биодеградации множество ароматических соединении превращаются в относительно небольшое количество интермедиатов, которые содержат две смежные гидроксильные группы в ароматическом кольце. Такие интермедиаты в дальнейшем подвергаются ключевой реакции биодеградации, заключающейся в раскрытии ароматического кольца, которое осуществляется дециклизующими диоксигеназами. В этом случае, оба атома молекулярного кислорода посредством фермента включаются в субстрат с последующим его расщеплением. Такие реакции являются беспрецедентными в органической химии, и в настоящее время проявляется все больший интерес к структуре и механизмам действия дециклизующих диоксигеназ.
Состояние вопроса. На данный момент известны два типа дециклизующих диоксигеназ, различающихся по месту расщепления ароматического кольца -интрадиольные и экстрадиольные (Lipscomb and Orville, 1992; Lange and Que, 1998; Bugg, 2001, 2003). В зависимости от проявляемой ферментами специфической избирательности к тому или иному субстрату каждый тип подразделяется на группы. К интрадиольным диоксигеназам относятся протокатехат 3,4-диоксигеназы, пирокатехин 1,2-диоксигеназы, хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназы и гидроксигидрохинон 1,2-диоксигеназы. В свою очередь экстрадиольные диоксигеназы делятся на пирокатехин 2,3-диоксигеназы, протокатехат 2,3-диоксигеназы, гомопротокатехат 2,3-диоксигеназы, протокатехат 4,5-диоксигеназы и 2,3-дигидроксибифенил 1,2-диоксигеназы. Накоплены данные по физико-химическим свойствам ряда интрадиольных и экстрадиольных диоксигеназ. Однако существуют единичные работы, посвященные структуре этих ферментов. Так расшифрованы трехмерные структуры лишь пяти экстрадиольных диоксигеназ: пирокатехин 2,3-диоксигеназы из Pseudomonas putida (Kita et al., 1999), протокатехат 4,5-диоксигеназы из Sphingomonas paucimobilis SYK-6 (Sugimoto et al., 1999), 2,3-дигидроксибифенил 1,2-диоксигеназы из Pseudomonas sp. (Uragami et al., 2001, Sato et al., 2002), и двух гомопротокатехат 2,3-диоксигеназ из Arthrobacter globiformis и Brevibacterium fuscum (Vetting et al., 2004). Для интрадиольных диоксигеназ к началу нашей работы были известны структуры только трех ферментов: двух протокатехат 3,4-диоксигеназ из Pseudomonas putida (Orville et al., 1997a) и из Acinetobacter sp. ADP1 (Vetting and Ohlendorf, 2000) и одной пирокатехин 1,2-диоксигеназы из Acinetobacter sp. ADP1 (Vetting et al., 2000). К 2005 году в совместной работе нашей лаборатории и Флорентийского
рос национальнаяj БИБЛИОТЕКА I
университета была расшифрована трехмерная структура гидроксигидрохинон 1,2-диоксигеназы из Nocardioides simplex ЗЕ (Ferraroni et al., 2005). Однако ни одной структуры хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ не было известно.
Ранее в нашей лаборатории был выделен активный штамм Rhodococcus opacus 1СР, разлагающий 2- и 4-хлорфенолы (Горлатов с соавт., 1989; Maltseva et al., 1994; Моисеева с соавт., 1999, 2001). Изучены пути биодеградации этих соединений и выделены ферменты, участвующие в этом процессе, клонированы и секвенированы опероны, кодирующие эти ферменты. Показано наличие разных интрадиолышх 3-хлор- и 4-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ, существенно отличающихся от ранее известных пирокатехин 1,2-диоксигеназ этого штамма (Maltseva et al., 1994; Моисеева с соавт., 2001). Неизвестными оставались причины функционального различия 3-хлор- и 4-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ между собой и отличия от других интрадиолышх диоксигеназ известной структуры и функции. Ответить на этот вопрос стало возможным благодаря изучению трехмерной структуры данных ферментов и проведении структурно-функционального анализа.
Цель и задачи исследования. Целью работы было выявление взаимосвязи структуры и функции 3-хлор- и 4-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназы из штамма R. opacus 1СР, утилизирующего 2-хлор и 4-хлорфенолы в качестве единственных источников углерода и энергии соответственно, и выяснение причин субстратной специфичности ферментов при сравнении с структурой и функцией других интрадиольных диоксигеназ.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
-
Получение гомогенных препаратов 3-хлор- и 4-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ.
-
Детальное изучение кинетических свойств ферментов.
-
Получение кристаллов 3-хлор- и 4-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ, пригодных для проведения рентгеноструктурного анализа.
-
Расшифровка с помощью рентгеноструктурного анализа трехмерной структуры ферментов.
-
Проведение сравнительного структурно-функционального анализа 3-хлор- и 4-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ из штамма R. opacus 1СР параллельно с интрадиольными диоксигеназами известной структуры, с целью выяснения причин субстратной специфичности ферментов.
Научная новизна. Впервые закристаллизованы 3-хлор- и 4-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназы среди известных хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ.
Впервые расшифрованы трехмерные структуры 3-хлор- и 4-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ. Показано, что хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназы являются гомодимерами, состоящими из двух каталитических доменов и одного связующего домена, представляющего гидрофобный тоннель, внутрь которого погружены с обеих сторон две молекулы фосфолипидов. В каждом каталитическом домене хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ содержится активный центр с трехвалентным железом, в координационной сфере которого найдена дополнительная структура: молекула бензоата у 4-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназы и молекула бензогидроксамата в структуре 3-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназы.
На основе кинетических свойств ферментов и структурных свойств субстратных аналогов показано, что связывание последних в активном центре фермента определяется характером взаимодействия, образующегося между заместителем в молекуле субстратного аналога и внутренней поверхностью активного центра. Установлена прямая зависимость каталитического процесса от величины заряда на кислороде первой гидроксильной группы субстрата. Показано прямое соответствие рассчитанной последовательности депротонирования смежных гидроксильных групп субстрата с ранее известной последовательностью связывания субстрата с железом активного центра интрадиольных диоксигеназ.
Проведенный сравнительный структурно-функциональный анализ хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ между собой, а также с интрадиольными диоксигеназами известной структуры показал, что различия в их субстратной специфичности вызваны соответствующими изменениями в аминокислотном составе активных центров ферментов и их входов.
Практическое значение работы. Полученные данные открывают широкое поле деятельности для белково-инженерных работ с целью получения ферментов с высокой субстратной специфичностью и заданным спектром атакуемых субстратов. Это позволит оптимизировать процессы деградации ряда ксенобиотиков путем конструирования эффективных штаммов деструкторов методами генной инженерии, а также получать высокочувствительные биосенсорные пленки, используемые для тестирования пирокатехина и его производных в почве и сточных водах.
Апробация работы. Материалы диссертации представлены на ежегодных сессиях научных работ ИБФМ РАН (Пущино, 2002, 2003, 2004), конференциях молодых ученых (Пущино, 2002, 2003), на международных конференциях: "Oxizymes in Naples. 2nd European meeting" (Naples, 2004) и "Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды" (Саратов, 2005).
Публикации. Основное содержание работы изложено в 4 статьях и 4 тезисах.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 151 странице и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследования, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, включающего 315 источников. Работа содержит 16 таблиц, 1 схему и 51 рисунок.
Степень идентичности аминокислотных последовательностей
В дальнейшем пирокатехин и его аналоги подвергаются раскрытию ароматического кольца посредством включения в молекулу субстрата молекулярного кислорода (Lange and Que, 1998; Bugg, 2001, 2003). Этот процесс осуществляется двумя способами (Рис. 2): интрадиольным и экстрадиольным (Lipscomb et al., 1982; Lipscomb and Orville, 1992; Bertini et al., 1995; Bugg, 2003). В ходе реакции обязательным требованием для такого рода субстратов является наличие двух смежных ги дроке ильных групп-заместителей в ароматическом кольце.
Интрадиолыюе расщепление (Рис. 2Ь) заключается в разрыве двойной С-С связи между двумя соседними (в орто-положетт) гидроксильными группами и осуществляется интрадиольными диоксигеназами (Bugg, 2003; Costas et al., 2004): протокатехат 3,4-диоксигеназами (ПКК 3,4-ДО) (Lipscomb and Orville, 1992;), пирокатехин и хлоргшрокатехин 1,2-диоксигеназами (ПК 1,2-ДО и ХПК 1,2-ДО) (Hayaishi et al., 1957; Dorn and Knackmuss, 1978a; Maltseva et al., 1994), гидрокси- и хлоргидроксигидрохинон 1,2-диоксигеназами (ГГХ 1,2-ДО и ХГГХ 1,2-ДО) (Sze and Dagley, 1984; Zaborina ct al., 1995, Latus et al., 1995), субстратами которых являются протокатехат, (хлор)пирокатехины и (хлор)гидроксигидрохиноны соответственно. Экстрадиолыгое (мета-) расщепление ароматического кольца может осуществляться двумя способами: дистальным (Рис. 2а) -разрыв С-С связи между 6-м и 1-м углеродными атомами, и проксимальным (Рис. 2с) -разрыв С-С связи между 2-м и 3-м атомами углерода. К экстрадиольным диоксигеназам, осуществляющим дистальный разрыв, относятся 2,3-дигидроксибифенил 1,2-диоксигеназы (2,3-ДГБ 1,2-ДО), активно расщепляющие как 2,3-дигидроксибифенилы так и пирокатехин с хлорпирокатехином (Riegert et al., 2001; Vaillancourt et al., 2003; Hatta et al., 2003). Ферментами, проксимально раскрывающими ароматическое кольцо, являются: протокатехат 4,5-диоксигеназы (ПКК 4,5-ДО) (Dagley and Patel, 1957; Arcicro et al., 1983; Sugimoto et al., 1999), протокатехат 2,3-диоксигеназа (ПКК 2,3-ДО) (Wolgel et al., 1993), пирокатехин 2,3-диоксигеназы (ПК 2,3-ДО) (Nakai et al., 1983; Pascal and Huang; 1986; Winkler et al., 1995) и гомопротокатехат 2,3-диоксигеназы (ГПКК 2,3-ДО) (Miller and Lipscomb, 1996; Vetting et al., 2004). Протокатехат 4,5- и 2,3-диоксигеназы используют в качестве субстрата протокатехат, пирокатехин 2,3-диоксигеназы - пирокатехин, и гомопротокатехат 2,3-диоксигеназы - гомопротокатехат.
Интрадиольные и эк страд иол ьиые диоксигеназы, не смотря па схожие по структуре субстраты, имеют много различий. Ферменты обоих семейств значительно отличаются по структуре молекул, а также их активных центров. Так интрадиольные диоксигеназы содержат пятикоординированное трехвалентное железо (Fc ), напротив, в активном центре экстрадиольных диоксигеназ могут находиться четырехкоординированные двухвалентное железо (Fe ) или двухвалентный ион марганца (Мп ). Следствием этого становится появление существенных различий ферментов в механизмах раскрытия ароматического кольца субстрата и образования, соответственно, разного типа продукте (Рис. 2).
Более подробно остановимся на процессе интрадиольного расщепления ароматического кольца и ферментах, катализирующих данную реакцию (Рис. 2Ь),
Все пути микробного интрадиольного (орто-) расщепления ключевых метаболитов, в дальнейшем, сливаются в общий 3-оксоадипатный путь, приводящий, в конечном итоге, к образованию интермедиатов цикла трикарбоновых кислот (Рис. 3). Однако пути деградации ключевых интермедиатов, ведущие к 3-оксоадипату различны по количеству этапов разложения. Так, самым коротким путем является разложение гидроксигидрохинона (Rieble eta],, 1994; Daubaras et al., 1995; Joshi and Gold, 1993; Valliet al., 1991, 1992a,b; Armengaud et al., 1999) и включает лишь один этап - раскрытия кольца с образованием малеилацетата, который в свою очередь служит предшествующим метаболитом 3-оксоадипата (Рис. ЗА). Путь расщепления хлоргидроксигидрохинона увеличивается на один этап (Zaborina et al., 1995; Latus et al., 1995; Padilla et al., 2000; Louie et al., 2002; Matus et al., 2003) и включает раскрытие ароматического кольца через 3-хлормалеилацетат с последующим дехлорированием и образованием малеилацетата (Рис. ЗБ), Следующие два пути разложения протокатехата и пирокатехина (Ornston and Stanier, 1966; Eulberg et al., 1997, 1998a,b; Iwagami et al., 2000) сходятся только на этапе образования еноллактона, который затем, минуя стадию малеилацетата, ферментативно превращается в 3-оксоадипат (Рис. ЗВ,Г)- Пути разложения хлорпирокатехинов (Haggblom, 1990; Chaudhry and Chapalamadugu, 1991; Eulberg et al., 1998b; Moiseeva et al., 2002) отличаются от классического орто-пут. разложения пирокатехина выпадением одной из стадий - образования муконолактона и называются модифицированными орто-путями (Рис. ЗД,Е). Все они ведут к формированию транс- или г/мс-диенолактонов с соответствующим дехлорированием, которые служат предшественниками малеилацетата. При разложении дихлорпирокатехинов появляется дополнительный шаг, связанный с удалением второго атома хлора (Рис. ЗЖ). Относительно недавно был открыт новый модифицированный орто-пугь разложения 3-хлорнирокатехина (Рис. ЗД) у Rhodococcus opacus 1СР (Moiseeva et al., 2002), схожий с классическим оршо-пукм наличием дополнительного метаболита — 5-хлормуконолактона, аналогичного муконолактону.
Ферменты, осуществляющие одну и ту же функцию интрадиольного расщепления ключевого интермедиата различны для каждого соединения и разделяются на группы, в зависимости от физиологического субстрата: протокатехат 3,4-диоксигеназы, пирокатехин- и хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназы, гидрокси- и хлоргидроксигидрохиноп 1,2-диоксигеназы.
Рассмотрим более детально генетические, физикохимические и структурные аспекты интрадиольных диоксигеназ.
Все интрадиольные диоксигеназы, согласно выравниванию их аминокислотных последовательностей, имеют общее происхождение и разную степень родства друг с другом (Рис. 4). Так самой дальней по степени родства является ветвь протокатехат 3,4-диоксигеназ, проявляющая 18-22% идентичности с пирокатехин и хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназами (Neidle et al., 1988; Harnett et al., 1990; van der Meer et al., 1992). Ближе всего друг к другу оказались пирокатехин- и хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназы - 22-33% идентичности (Eulberg et al., 1998b; Cavalca et al., 1999). Группа гидроксигидрохинон 1,2-диоксигеназ имела большее сродство к пирокатехин- и хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназам - 22-30% идентичности (Armengaud et al., 1999; Hatta et al., 1999; Murakami et al., 1999; Ferraroni et al., 2005).
Кристаллизация ферментов
Для получения биомассы с целью очистки ферментов проводилось периодическое культивирование штамма R. opacus 1СР в 10-литровом биореакторе, содержащем 7 литров минеральной среды при 29С. В качестве субстрата использовали 4-хлорфенол и 2-хлорфеиол, которые вносились дробно по 0.3 мМ. За ростом культуры следили по снижению потребления кислорода, изменению значения рН и изменению оптической плотности при 545 им, рН поддерживался периодическим внесением 1 М NaOH. В качестве инокулятов (объем 500-600 мл) для культивирования в биореакторе использовали свежеприготовленные суспензии клеток штамма R. opacus 1СР, выращенные на 4-хлор- и 2-хлорфенолах в качестве единственных источников углерода и энергии, с оптической плотностью 0.5-0.6 при 545 нм.
Выращенные в биореакторе клетки осаждали центрифугированием при 5000 g в течение 10-15 мин, отмывали 50 мМ Трис/HCI буфером, рН 7.2 и хранили при -20С.
Для приготовления бесклеточных экстрактов слегка оттаявшую биомассу при комнатной температуре разрушали на ИБФМ-прессе (рабочее давление в дезинтеграционной камере 3500 кг/см , размер экструзионной щели 350 мкм). После добавления 0,01 мг/мл ДНКазы ("Sigma", США) разрушенную биомассу выдерживали в течение 5-15 мин при комнатной температуре и центрифугировали при 15 000-18 000 g в течение 30-40 мин. Осадок промывали 0,05 М три с-НС 1-6 уф ером (рН 7,2) и еще раз цетри фугировали при тех же условиях. Полученный в обоих случаях супернатант объединяли и центрифугировали при 18 000 g в течение 30 мин. Полученный бесклеточный экстракт использовали для очистки ферментов.
Концентрация белка определяли по модифицированному методу Брэдфорд с использованием бычьего сывороточного альбумина в качестве стандарта (Bradford, 1976).
Определение активностей ферментов проводилось спектрофотометрически на спектрофотометрах Shimadzu UV-160 и Shimadzu UV-2501PC (Япония) в кварцевой кювете с длиной оптического пути 10 мм при 25С.
Активность хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ определяли по модифицированному методу Хаяиши (Hayaishi et al., 1957). Реакционная смесь содержала: 50 мМ Трис/HCI, рН 7.2, 0,25 мМ пирокатехин или его замещенный аналог и фермент (в бесклеточном экстракте использовали 1.3 мМ ЭДТА, для предотвращения артефактов, возникающих при наличии активностей метапирокатехазы и муконатциклоизомеразы, ферментов, содержащих двухвалентные металлы в качестве кофакторов). Реакцию начинали добавлением фермента. Активность фермента рассчитывали по скорости образования продуктов при 260 нм, используя при расчете коэффициенты молярной экстиикции продуктов (є) (Dorn and Knackmuss, 1978): пирокатехина - 16,800 ІУГ см 1; 3-хлорпирокатехина - 17,100 NT CM"1; 4-хлорпирокатехина - 12,400 М см ; 3,5-дихлорпирокатехина - 12,000 М см"1; 4,5-дихлорпирокатехина - 12,400 VT CM" ; 3-метилпирокатехина - 18,000 М" см" ; 4-м етил пирокатехина - 13,900 М" см"1. Активность ферментов с протокатеховой кислотой рассчитывали по скорости образования продукта при 290 нм, используя є = 2,300 М" см"1 (Stanier and Ingraham, 1954), с 2,3-дигидроксибензойной кислотой по скорости образования продукта при 374 нм с є = 29,700 М" см" (Ito, 1993), с гидроксигидрохиноном по скорости образования продукта при 243 нм с s = 44,400 NT CM 1 (Tiedje et al., 1969; Daubaras et al., 1996), с пирогаллолом по скорости образования 2-пирон-6-карбоновой кислоты при 295 нм с є = 7,5 М см" (Saeki and Nozaki, 1980).
Единицу активности определяли как количество фермента, катализирующее превращение 1 мкМ субстрата или образование 1 мкМ продукта в минуту. Фермент был очищен из биомассы R. opacus 1СР, выращенной на 4-хлорфеноле до оптической плотности 1.8 при 545 нм. 1 этап. Получение бесклеточного экстракта описано в разделе 2.3.1. 2 этап. Бесклеточный экстракт наносили на колонку с Q-Sepharose Fast Flow (объем носителя - 150 мл), предварительно уравновешенную 0,05 М трис-НС1-буфером, рН 7,2 (буфер А). Колонку промывали двумя объемами этого же буфера. Элюцию проводили линейным градиентом 0 - 0,5 М NaCl в 1600 мл буфера А со скоростью 1,5 мл/мин. Объем фракций составлял 8.8 мл. Активные фракции объединяли и концентрировали в ячейке для ультрафильтрации ("Amicon", США) с мембраной UM-10. 3 этап. К полученному препарату добавляли (NH4)2SC 4 до конечной концентрации 1.6 М, центрифугировали при 18 000 g в течение 30 мин. Супериатант наносили на колонку с Phenyl Sepharose CL-4B (объем носителя - 150 мл), предварительно уравновешенную 1.6 М (NH SOt в буфере А. Колонку промывали двумя объемами того же буфера. Белки элюировали линейным градиентом сульфата аммония 1.6-0 М в 1600 мл буфера А со скоростью 1,5 мл/мин. Фракции с 4-хлорпирокатехазной активностью объединяли, обессоливали и концентрировали, 4 этап. Препарат объемом 1 мл наносили на колонку (1,5 х 70 см) с Superdex 200 prep grade (120мл), уравновешенную буфером А с 0,1 М NaCl. Элюцию вели тем же буфером со скоростью 0,8 мл/мин. Объем фракций сотавлял 0,5мл. Фракции, содержащие пик активности 4-ХПК-1,2-ДО, собирали, концентрировали в центриконе YM-10 и использовали в дальнейшей работе. 5 этап. Следующей стадией очистки 4-ХПК-1,2-ДО было проведение хроматографии на анионообменной колонке Mono-Q (1мл), уравновешенной буфером А. Элюцию проводили ступенчатым градиентом 1 М NaCl в буфере А: 0-10% в 5 мл; 10-20% в 30 мл; 20-100%) 1 М NaCl в 5 мл. Объем фракций составлял 0,5 мл, скорость протока - 1 мл/мин. 6 этап. К активным фракциям, полученным на предыдущем этапе очистки, добавляли сульфат аммония до конечной концентрации 1,6 М и центрифугировали при 18000 g в течение 30 мин. Супернатант наносили на колонку Resource ISO (1мл), уравновешенную буфером Ас 1,6 М сульфатом аммония. Элюцию проводили снижающимся линейным градиентом (NH4)2S04 (1,6-0 М) в 25 мл стартового буфера со скоростью протока 1,5 мл/мин. Объем фракций составлял 0,5 мл. Полученный обессоленный препарат использовали в дальнейшей работе. В качестве субстрата для измерения активности 4-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназы на всех этапах очистки использовался пирокатехин. 2.3.4. Очистка 3-хлорпнрокатехин-1,2-диоксигсназы Для очистки 3-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназы использовалась биомасса R, opacus 1СР, выращенная в биореакторе с использованием 2-хлорфенола в качестве единственного источника углерода и энергии до оптической плотности при 545 нм 1.6-1.7. 1 этап. Получение бесклеточного экстракта описано в разделе 2.3.1. 2-4 этапы. Дальнейшая очистка 3-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназы включала три последовательных стадии с применением Q-Sepharose Fast Flow, Phenyl Sepharose и Superdex 200 prep grade и осуществлялась по аналогичной схеме, описанной для 4-ХПК 1,2-ДО (2-4 этапы). Проведение дополнительных этапов очистки (5-6 этапы) для 3-ХПК 1,2-ДО не требовались в связи с достаточной гомогенностью получаемого препарата. В качестве субстрата во время очистки 3-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназы использовался пирокатехин. Чистота белковых препаратов контролировалась с помощью SDS-электрофореза при десятикратной перегрузке ферментом 12% полиакриламидного геля по модифицированному методу Лэммли (Laemmly, 1970). Гель окрашивали Кумасси G-250 (Diezeletal., 1972).
Субстратная специфичность ферментов
Ранее было показано, что в клетках штамма Rhodococcus opacus 1СР в процессе роста на 4-хлор- и 2-хлорфенолах в качестве единственных источников углерода и энергии индуцируются разные хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназы - 4-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназа и 3-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназа соответственно (Мальцева с соавт., 1991; Maltseva et al., 1994; Моисеева с соавт,, 2001). Ферменты находились в разных метаболических путях разложения данных ксенобиотиков, осуществляя интрадиольное расщепление ароматического кольца, различающихся по свойствам субстратов, с образованием разных продуктов (Рис. 3). Данные ферменты были частично охарактеризованы. Молекулярные массы нативной 4-ХПК 1,2-ДО и ее субъединицы были 64 и 26,5 кДа соответственно, а для 3-ХПК 1,2-ДО - 66 и 28,5 кДа. 4-ХПК 1,2-ДО проявляла избирательность к 4-хлорпирокатехину, а 3-ХПК 1,2-ДО - к 3-хлорпирокатехину. Идентичность аминокислотных последовательностей ферментов составила 42%.
Для кристаллизации и проведения рентгеноструктурного анализа, как известно, требуется белковый препарат с гомогенностью, превышающей 95% (Ducruix and Giege, 1992; McPherson, 1999; Drenth, 2002). Чтобы улучшить качество получаемых ферментативных препаратов были модифицированы ранее предложенные методы очистки ферментов (Maltseva et al., 1994; Моисеева с соавт., 2001) с помощью замены носителей или с применением дополнительных этапов. Так для 4-ХПК 1,2-ДО носитель DEAEoyopearl был заменен на более сильный анионообменный носитель - Q-Sepharose, на этапе гидрофобной хроматографии Phenyl Superose заменен па Phenyl Sepharose, на этапе гель-фильтрации - Sephacryl S200 на Superdex 200 и добавлена дополнительная стадия гидрофобной хроматографии на носителе средней силы Resource ISO. В процессе очистки 3-ХПК 1,2-ДО на стадии гидрофобной хроматографии Butyl Sepharose заменена на более сильный носитель Phenyl Sepharose и добавлен еще один этап очистки - гель-фильтрация на Superdex 200. Использование таких методов очистки позволило получить гомогенные препараты 4-ХПК 1,2-ДО и 3-ХПК 1,2-ДО, пригодные для последующего получения правильных, дифракционно качественных кристаллов и проведения рентгеноструктурного анализа.
Осуществление первоначального скрининга условий кристаллизации обоих ферментов и последующей оптимизации выбранных условий позволило получить дифракционно-качественные кристаллы 4-ХПК 1,2-ДО и 3-ХПК 1,2-ДО правильной, но отличающейся друг от друга формы. Как известно (Бландел и Джонсон, 1979; McPherson, 1999), форма кристалла белка зависит от того, каким образом кристаллизуемая молекула упаковывается в кристалл, что непосредственно зависит от самой структуры белка и от условий, в которых протекает кристаллизация: буфер, органические растворители, соли, температура, рН. Влияние формы и размеров кристаллизуемых молекул на индивидуальную форму кристалла бесспорно, но в то же время препарат одного и того же белка при различных условиях кристаллизации способен образовывать правильные кристаллы различной формы и симметрии, как это показано на примере протокатехат 3,4-диоксигеназы из Pseudomonas putida (Fujisawa and Hayaishi, 1968). В нашем случае использование коммерческих наборов для кристаллизации и проведение скрининга на предмет лучших условий кристаллизации 4-ХПК 1,2-ДО и 3-ХПК 1,2-ДО позволило выявить изначально отличающиеся условия кристаллизации двух ферментов. Следовательно, сама структура фермента обуславливает специфические оптимальные условия кристаллизации.
Ранее было показано (Мальцева с соавт., 1991; Моисеева с соавт., 2001), что 4-ХПК 1,2-ДО и 3-ХПК 1,2-ДО являются гомодимерами. Проведенный рентгеноструктурный анализ 4-ХПК 1,2-ДО и 3-ХПК 1,2-ДО позволил глубже понять структуру такого типа ферментов. Как 4-ХПК 1,2-ДО, так и 3-ХПК 1,2-ДО состояли из двух каталитических доменов и одного связывающего домена, внутри которого находятся два фосфолипида. В ранних работах нашей лаборатории методами атомной абсорбционной спектрометрии и рентгено-флуоресцеитной спектроскопии (Maltseva et al., 1994) было показано, что на один моль 4-ХПК 1,2-ДО приходится 0,4-0,7 М железа и 0,5-1,7 М марганца. Таким образом, стехиометрия молекулы фермента представлялась как c FeMr!. Данные рентгеноструктурного анализа опровергли результаты, касающиеся содержания ионов металлов и помогли установить более точную стехиометрию 4-ХПК 1,2-ДО, согласно которой молекула состоит из двух идентичных субъедипиц, содержащих по 1 атому железа Fe3+ в каждом активном центре. Никаких дополнительных ионов металлов ни в активном центре, ни на поверхности фермента не было найдено. Таким образом, молекула имела (aFe +)2 структуру. Для 3-ХПК 1,2-ДО ранее не проводилось дополнительного анализа количественного содержания ионов металлов. Рентгеноструктурным анализом впервые установлено, что молекула 3-ХПК 1,2-ДО имеет (aFe3+)2 стехиометрию, аналогичную 4-ХПК 1,2-ДО.
В активных центрах обоих исследованных ферментов содержалось трехвалентное железо, что лишний раз доказывает общность и консервативность данного факта для всех известных интрадиольных диоксигеназ (Que and Но, 1996; Bugg, 2003; Costas et al., 2004). Ранее Бриганти с соавторами (Briganti et al., 1998) с помощью рентгено-абсорбционной спектрометрии показали, что в нативиой форме 4-ХПК 1,2-ДО трехвалентное железо пятикоординированно по двум тирозиновым, двум гистидиновым остаткам, и пятая связь, по всей видимости, пренадлежит гидроксилу воды. В комплексе с 4-хлорпирокатехином железо оставалось также пятикоординированным, предполагая бидентантное хелатирование последнего двумя кислородами гидроксильных групп субстрата и одновременную диссоциацию одного тирозина и гидроксила воды из координационной сферы железа, что является общей характеристикой для интрадиольных диоксигеназ известной структуры. Рентгеноструктурный анализ подтвердил наличие в активном центре 4-ХПК 1,2-ДО четырех лигандов железа (двух гистидинов и двух тирозинов). Однако трехвалентное железо оказалось шестикоординированным за счет присутствия дополнительной экзогенной молекулы бензоата в координационной сфере. Бидентантное связывание молекулы бензоата с железом посредством кислородных атомов карбоксильной группы слабее, чем субстратное связывание, наблюдаемое у интрадиольных диоксигеназ (Таблица 5), что также подтверждается проведенным в данной работе ингибиторным анализом, согласно которому бензоат проявляет очень слабое ингибирующее действие на 4-ХПК 1,2-ДО. Присутствие поблизости с атомом железа молекулы воды, предполагает ее вытеснение из координационной сферы железа при связывании бензоата. В координационной сфере железа 3-ХПК 1,2-ДО также была найдена экзогенная молекула бензогидроксамата, бидентантно хелатирующего железо. Однако железо было пятикоординировано за счет диссоциации Тугі 67. Рядом с молекулой бензогидроксамата также была найдена молекула воды, что может свидетельствовать о возможности связывания ее с железом в отсутствии бензогидроксамата.
Координационная сфера железа хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ
С4-окружение в активном центре ГГХ 1,2-ДО из Nocardioides simplex ЗЕ представлено остатками Asp83 и Val84 (Рис. 48в, Таблица 16), причем они смещены так, что именно остаток аспарагиновой кислоты находится в непосредственной близости к С4-атому бензольного кольца субстратного аналога. Если обратиться к субстратной специфичности данного фермента, то окажется, что ГГХ 1,2-ДО(Ли.), как и все диоксигеназы этой группы (Таблица 3), проявляет строгую избирательность к гидроксигидрохинону, чье бензольное кольцо содержит в С4-положении гидроксильную группу. С 4-хлор- и 4-метилпирокатехинами ГГХ 1,2-ДО из Nocardioides simplex ЗЕ полностью неактивна (Travkin et.al., 1997), однако способна связывать эти соединения, но с гораздо меньшей силой по сравнению с гидроксигидрохиноном. Возможно, существование остатка аспарагиновой кислоты в С4 положении необходимо для лучшего связывания гидроксильного заместителя субстрата. На эту мысль наводит меньшая способность 4-ХПК 1,2-ДО и 3-ХПК 1,2-ДО связывать и расщеплять гидроксигидрохинон. В С4 окружении данных ферментов также присутствует аспарагиновая кислота (Asp52/52), однако этот остаток смешен немного в сторону от С4-атома бензольного кольца субстратного аналога. У ПК 1,2-ДО из Acinelobacter sp. ADPl существует подобная структура (Asp81), но ее местоположение в пространстве находится еще дальше от С4-атома субстрата, чем в активном центре изучаемых 4-ХПК и 3-ХПК 1,2-ДО-з, при этом, практически большинство пирокатехин 1,2-диоксигеназ не активны с гидроксигидрохиноном. Еще одним интересным отличием активного центра ГГХ 1,2-ДО(Лг.5г.) от всех интрадиольных диоксигеназ с известной структурой, является замена в СЗ-окружении остатка глутамина, характерного для других диоксигеназ, на гистидин His237 (Рис. 48г, Таблица 16). Будучи положительно заряженным, гистидин может участвовать в дополнительном координировании реакционных гидроксильных групп гидроксигидрохинона с железом активного центра, восполняя недостаток их реакционной способности. В СЗ-окружении активного центра ГГХ 1,2 0( .5.) находится Val251, близкий по свойствам с А1а221, присутствующим в структуре 3-ХПК 1,2-ДО. Несмотря на то, что ГГХ l,2-flO(7V.s.) не активна с 3-хлор- и 3-метили ирокатехи нами, она способна связывать эти соединения значительно сильнее, чем хлор- и метилзамещенные пирокатехины в «ара-положении (Travkin et al., 1997).
Для правильного связывания и позиционирования более гидрофильной карбоксильной группы протокатехата в своем активном центре ПКК 3,4-ДО из Acinelobacter sp. ADPl требуется уже три гидрофильных остатка, образующих с карбоксилом сеть водородных связей (Рис. 48д, Таблица 16). Приподнятость свода активного центра ПКК 3,4-ДО(Лс) в этом положении, скорее всего, позволяет субстрату с такой более объемной группой не иметь стерических конфликтов в полости. Высокая гидрофильность С4-области активного центра ПКК 3,4-ДО(Лс) должна ухудшать правильное позиционирование субстратов с гидрофобными группами-заместителями, находящимися в С4-положении ароматического кольца или самим ароматическим кольцом пирокатехина. К сожалению, экспериментальные данные по субстратной специфичности ПКК 3,4-ДО(Лс) отсутствуют, однако, если обратиться к ПКК 3,4-ДО из близкородственного штамма Acinelobacter calcoaceticus (Таблица 1), то наши выводы вполне подтверждаются. Этот фермент неактивен с пирокатехином и метилпирокатехином. Другие ПКК 3,4-ДО-азы так же либо неактивны с такими соединениями, либо проявляют слабую активность. СЗ-область активного центра ПКК 3,4-ДО из Acinelobacter sp. ADPl имеет в своем составе как гидрофильные, так и гидрофобные остатки (Рис. 48е, Таблица 16). Может быть это связано с чуть большей избирательностью ряда ПКК 3,4-ДО к замещенным пирокатехином в лшиа-положепии, не смотря на низкую к ним активность (Таблица 1),
Существенным дополнением к картине взаимосвязи структуры и функции изучаемых 4-ХПК 1,2-ДО и 3-ХПК 1,2-ДО при сравнении с интрадиольнымн диоксигеназами известной структуры является поверхность входа в активный центр ферментов. Так хлорпирокатехин- и пирокатехин 1,2-диоксигеназы имеют самые гидрофобные поверхности входов по сравнению с гидроксигидрохинон 1,2-диоксигеназой и протокатехат 3,4-диоксигеназой, что может играть дополнительную роль в привлечении более гидрофобных субстратов, таких как пирокатехин, хлор- и метилпирокатехины. Самым гидрофильным входом в активный центр обладает ПКК 3,4-ДО(Лс). Положительный заряд поверхности входа ПКК 3,4-ДО(Лс) может активней притягивать отрицательно заряженный протокатехат. Таким образом, под действием эволюционного давления появились ферменты со строгой субстратной специфичностью, вызванной определенными изменениями в структуре.
3-ХПК 1,2-ДО в отличие от 4-ХПК 1,2-ДО обладает еще одной интересной особенностью - наличием конфликта в активном центре с молекулами фенолов, имеющих хлор-заместитель в С6-положении ароматического кольца, что проявляется в отклонении линии тренда на рисунке 32. Однако такой эффект не найден для пирокатехина, содержащего атом хлора в этом же положении (Рис. 33). В С6-области активного центра 3-ХПК 1,2-ДО находится Туг78, имеющий гидроксильную группу, которая вполне может вступать в конфликт с хлорным заместителем ароматического кольца фенола (Рис. 476, Таблица 16). В отличие от 3-ХПК 1,2-ДО в структуре 4-ХПК 1,2-ДО в С6-положении находится гидрофобный остаток Phe78, напротив, способный улучшить связывание хлор-заместителя в активном центре. Возникает вопрос, почему молекула пирокатехина, имеющая в этом положении хлор не встречает конфликта в молекуле 3-ХПК 1,2-ДО. Опять вернемся к структуре. В работах Орвила с соавторами (Orville et al,, 1997a,b) показаны механизмы связывания субстрата и субстратного аналога с железом активного центра интрадиольных диоксигеназ, согласно которому молекула конкурентного ингибитора, имеющая только одну реакционную гидрокси-группу, связывается посредством кислородного атома последней с железом, в то время как молекула субстрата хелатирует железо кислородами двух смежных гидроксильных групп.
