Введение к работе
Актуальность проблемы. Развитие клеточных технологий и вовлечение новых методов молекулярной биологии открывает возможности для восстановления значительных дефектов тканей и органов с использованием созданных in vitro искусственных тканей. Основой искусственных тканей становятся носители трехмерного строения (их называют матриксами или матрицами), которые служат субстратом для адгезии аутологичных клеток, способствуя поддержанию их пролиферативной активности, определяют форму и физико-механические свойства медицинского изделия. В наше время предпочтение отдается полимерам биологического происхождения или композитным материалам на их основе, так как они, обладая высокой прочностью, не оказывают токсического действия, и более того, могут служить высокоэффективными биостимуляторами. Уникальным материалом, сочетающим высокую прочность и эластичность, является шелк паутинной нити. Эти свойства, наряду с хорошей биологической совместимостью, делают шелк перспективным материалом для использования в тканевой инженерии. Однако получение природного паутинного шелка связано со значительными трудностями и обычно нерентабельно, а количество шелка недостаточно для широкого практического применения. Успехи в расшифровке генов паутинных белков и создание их рекомбинантных аналогов позволило получить материалы, подобные природному шелку. В настоящее время исследуются свойства этих материалов, а также возможность их практического использования. В ГосНИИгенетика ранее был получен белок 1F9 - аналог спидроина 1 Nephila clavipes [Богуш В.Г. и др., 2006; Bogush V.G. et al., 2009], который может стать основой при создании матриксов для тканевой инженерии
Цель работы: получить и исследовать биологические свойства трехмерных матриксов из рекомбинатного аналога спидроина 1 для применения в тканевой инженерии.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
Разработать методику получения искусственных матриксов, изучить их физические, морфологические, топографические свойства и скорость деградации в модельной системе.
Изучить способность искусственных матриксов поддерживать адгезию, пролиферацию и жизнеспособность культивируемых эукариотических клеток.
Изучить местное действие матриксов после имплантации в ткани животных.
Научная новизна работы. Разработанный в ГосНИИгенетика рекомбинантный аналог природного спидроина Nephila clavipes был впервые использован для изготовления пористых трехмерных матриксов. Были изучены
макро- и микроструктурные особенности эти конструкций, их механические свойства и способность к деградации, а также возможности химической модификации. Мы показали, что матриксы из аналога спидроина 1 способны поддерживать адгезию и пролиферацию эукариотических клеток in vitro. Впервые было изучено местное действие матриксов из аналога спидроина 1 после имплантации в ткани животных. Показано, что после имплантации материал подвергается биодеградации и замещается васкуляризованной новообразованной тканью.
Практическая значимость. Спидроины, обладают уникальным сочетанием механических свойств, являются биосовместимым, биоинертным материалом, способным к биодеградации. Разработка методов получения рекомбинантных аналогов этих белков расширила возможности практического применения спидроинов. Матриксы из рекомбинантного аналога спидроина 1 можно использовать для создания конструкций медицинского назначения, таких как имплантаты для замещения дефектов ткани, целостность которых не может быть восстановлена естественной физиологической репарацией. Матриксы могут служить основой для создания трехмерных клеточных культур in vitro для моделирования различных биологических процессов, например, для изучения процессов репарации и клеточной миграции. Культивирование клеток в трехмерной среде расширяет возможности исследования нормальных физиологических функций клеток и влияния на эти функции микроокружения и топографии субстрата. Внедрение новых медицинских технологий и создание новых моделей для исследований в клеточной биологии позволяет серьезно продвинуться в области восстановительной медицины и решить ряд значительных медицинских проблем биотехнологическими методами.
Апробация работы. Результаты настоящей работы докладывались на X Китайско-Российском Симпозиуме «Новые материалы и технологии» (г. Дзясин, 2009). Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на заседании кафедры физиологии микроорганизмов биологического факультета МГУ от 23 октября 2009 г и секции «Молекулярная биология» Ученого Совета ФГУП «ГосНИИгенетика» от 25 февраля 2010 г.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ в рецензируемых журналах.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из следующих глав: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, выводы, список литературы. Работа изложена на 129 страницах машинописного текста и содержит 24 рисунка и 2 таблицы. Библиография включает 173 литературных источника.