Содержание к диссертации
Введение
2. Генамплификационная диагностика: современное состояние, проблемы и перспективы (литературный обзор) 13
2.1. Проблема вирусной безопасности донорской крови и ее компонентов 13
2.2. Генамплификационные методы анализа, их возможности и основные проблемы 16
2.2.1. Полимеразные цепные реакции и другие генамплификационные методы 16
2.2.2. Способы преодоления ложноположительных результатов ПЦР 19
2.2.3. Анализ индивидуальных особенностей генома - генотипирование 22
2.3. Методы детекции продуктов генамплификации . 24
2.3.1. Метод гель-электрофореза 24
2.3.2. ПЦР с «горячим стартом» 25
2.3.3. Гибридизационная детекция в растворе 27
2.3.3.1. Измерение гибридизационной защиты хемилюминесцентных меток зонда- НРА (hybridization protection assay) 27
2.3.3.2. Экзонуклеазная активность Taq-полимеразы (система TaqMan) 28
2.3.3.3. Молекулярные бакены и праймеры-скорпионы 30
2.3.3.4. Система двух зондов с передачей энергии ,. 32
2.3.3.5. Зажигаемые зонды (light-up probes) 33
2.3.4. Гибридизационная детекция на твердой фазе 34
2.4. ПЦР в реальном времени , 38
2.5. ПЦР с внутренним стандартом и ее применение для количественных и диагностических анализов 44
2.5.1, Внутренние стандарты конкурентного типа 45
2.5.2. Внутренние стандарты неконкурентного типа. Значение внутренних стандартов при ПЦРвреальном времени 47
2.6. Обработка крови и другого клинического материала для генамплификационных анализов 49
2.6.1. Методы обработки .сыворотки и плазмы крови для получения суммы ДНК и РНК для ПЦР-анализа 49
2.6.2. Упрощенные методы получения препаратов ДНК для ПЦР-анализа 53
2.7. Международные стандарты для генамплификационных анализов. Деятельность SoGAT 55
2.7.1.МАТ-стандартынаРНКВИЧ 57
2.7.2. NAT-стандарт для ДНК HBV 58
2.7.3. NAT-стандарт для РНК вируса гепатита С 59
2.7.4. NAT-стандарт для ДНК парвовирусаВ19 59
2.7.5. Новые цели SoGAT. Перспективы развития международных NAT-стандартов 60
2.8. Краткие итоги мирового опыта генотестирования донорской крови и ее компонентов 64
3. Материалы и методы 70
4. Генамплификационное тестирование донорской крови на патогены: технологии, системы и стандарты (результаты и их обсуждение) 73
4.1.. Основные задачи работы 73
4.2. Обработка проб крови, ее компонентов и белковых препаратов для генотестирования вирусных и бактериальных ДНК и РНК 76
4.2.1. Выделение ДНК из лейкоцитов и других клеток с использованием протеиназы К и термического лизиса с сорбентом 77
4.2.2. Методы, применяемые для выделения вирусных ДНК и РНК из сыворотки и плазмы крови: метод фенольной депротеинизации и метод сорбции на силикагеле 79
4.2.3. Однопробирочный метод для одновременного выделения суммы РНК и ДНК 80
4.2.4. Получение суммы ДНК и кДНК биопробы без изоляции РНК 82
4.3. Применение внутренних стандартов как способ преодоления ложноположительных и ложноотрицательных результатов 84
4.3.1. Конструирование внутренних стандартов методом направленного соединения фрагментов ДНК. Первый опыт количественной ПЦР 85
4.3.2. О возможном применении простых методов для конструирования внутренних стандартов конкурентного типа 89
4.3.3. Внутренние стандарты для практического генотестирования гемотрансмиссивных вирусов и других патогенов 93
4.2.2. Калибровка внутренних стандартов 96
4.4. Оптимизация компоновки реагентов для ПЦР-анализ а, обеспечивающей их сохранность и удобство постановки анализа 97
4.4.1. Двухрастворная компоновка реагентов для ПЦР и обратной транскрипции 98
4.4.2. «Сухие» тест-системы для ПЦР и другие варианты компоновки тест-систем для пользователей 101
4.5. Характеристика разработанных и применяемых наборов генодиагностических реагентов 104
4.5.1. Наборы реагентов для обработки биопроб ...104
4.5.2. Наборы реагентов для обнаружения возбудителей инфекций 107
4.5.2.1. Тест-системы для обнаружения вируса гепатита В 107
4.5.2.2. Тест-система (набор реагентов) для определения вируса
гепатита С (HCV) в плазме крови путем двукратной РНК-ПЦР 108
4.5.2.3. Тест-системы для определения ДНК и РНК ВИЧ 112
4.5.2.4. Тест-системы (набор реагентов) для определения ДНК цитомегаловируса методом двукратной ПЦР 114
4.5.2.5. Тест-система (набор реагентов) для определения бледной трепонемы методом РНК-ПЦР 116
4.5.2.6. Комплект тест-систем для определения возбудителей урогенитальных и других инфекций методом ПЦР 117
4.5.4, Тест-системы для генотипирования 119
4.6. Проба флуоресцентной детекции продуктов ПЦР. Детекция продуктов ПЦР в закрытой системе как наиболее перспективный способ преодоления ложноположительных результатов 123
4.6.1. Конструирование зондов для флуориметической детекции продуктов ПЦР 124
4.6.2. Зонд для флуоресцентной детекции ДНК гепатита В с использованием экзонуклеазной активности Taq-полимеразы (система типа TaqMan) 125
4.6.3. Пара зондов для детекции ДНК вируса гепатита В с внутренним стандартом. DABCYL как эффективный нефлуоресцирую ший тушитель 127
4.6.4. Варианты зонда - молекулярного бакена и праймера-скорпиона 130
4.6.5. Амгагафиконы как основной источник ложноположительных результатов ПЦР-анализов. О простом приеме ухода от контаминации и перспективности детекции продуктов ПЦР в закрытой системе 131
4.7.О результатах применения разработанных методов и тест-систем при генотестировании крови доноров и пациентов 134
4.7.1. Первый российский опыт ручного и полуавтоматического минипул-NAT-тестирования донорской крови на ВИЧ и вирусы гепатитов В и С 134
4.7.2. Генотестирование серопозитивных донаций крови. О возможной реабилитации доноров и пациентов на основе результатов генодиагностики 137
4.7.3. О вирусоносительстве среди больных гемофилией 139
4.7.4. Оценка распространения носительства цитомегаловируса среди кадровых доноров СПК КЗ г.Москвы 140
4.7.5. Проблема бактериальной безопасности донорской крови 142
4.7.5.1. Об отсутствии бледной трепонемы в крови серопозитивных лиц 142
4.7.5.2. Обнаружение бактерий в крови методом ПЦР на универсальной последовательность гена рибосомальной РНК 144
5. Заключение 149
6. Выводы 155
7. Практические рекомендации 157
Литература 158
Приложение 168
- Полимеразные цепные реакции и другие генамплификационные методы
- Методы обработки .сыворотки и плазмы крови для получения суммы ДНК и РНК для ПЦР-анализа
- Конструирование внутренних стандартов методом направленного соединения фрагментов ДНК. Первый опыт количественной ПЦР
- Тест-системы (набор реагентов) для определения ДНК цитомегаловируса методом двукратной ПЦР
Введение к работе
Контролю вирусной безопасности донорской крови всегда уделялось особое внимание, но его эффективность была и остается ограничена возможностями применяемых серологических методов. Последние же по своей основе являются косвенными и не всегда дают однозначные результаты. Специальные методы инактивации вирусов в донорской крови были предложены лишь в последнее время, и их эффективность пока еще нельзя считать абсолютной, и поэтому они применяются лишь в сочетании с ИФА-или NAT-тестированием. Эпидемия СПИДа обострила проблему инфекционной безопасности донорской крови настолько, что был поднят даже вопрос об отказе от переливания крови. Очень серьезную проблему в настоящее время представляет собой распространение вирусов гепатитов, особенно среди наркоманов и других лиц, относимых к группе социального риска.
Идентификация возбудителя по нуклеотидной последовательности его генома обеспечивает наиболее прямую и точную диагностику, и ее реализация в виде доступной лабораторной методики является целью многих работ последних десятилетий. Применение гибридизации - комплементарного связывания известной ДНК или РНК (зонда) с определяемой ДНК или РНК (мишенью) позволило вплотную подойти к практической генодиагностике [Mattews J. and Kricka L., 1988]. Однако решающим оказалось открытие полимеразных цепных реакций (ПЦР) [Mullis К.В., 1985; Saiki R.K, et al., 1985], особенно их современного варианта, осуществимого в автомате-термоциклере [Saiki R.K. et al., 1988]. С помощью ПЦР оказалось возможным размножить заданный фрагмент генома во много миллионов раз, что позволяет далее его идентифицировать простым методом. Именно с появлением ПЦР стало возможным проведение генодиагностических анализов практически в любой клинической лаборатории.
Необходимость внедрения генамплификационных анализов для повышения инфекционной безопасности донорской крови стала очевидной еще в 1995 году. Тогда же по инициативе Национального института биологической стандартизации и контроля Великобритании (NIBSC) Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) создала рабочую группу по стандартизации генамплификационных методов исследования, применяемых в службе крови (WHO International working group on the standartisation of genomic amplification techniques for the virological safety testing of blood and blood products: WHO SoGAT). Основной задачей этой группы, помимо обмена информацией, является создание международных стандартов для контроля чувствительности генамплификационных методов и аппаратов. Опираясь на накопленный мировой опыт, SoGAT исходит из того факта, что задача внедрения молекулярно-биологических методов в службу крови достаточно сложна и по крайней мере в настоящее время не может иметь однозначного решения. В то же время повседневный контроль эффективности и чувствительности генамплификационных анализов с помощью международных стандартов или их аналогов позволит как гарантировать достоверные результаты анализов, так и объективно сравнить различные генамплификационные методы, аппараты и технические решения.
Применение в генотестировании крови и других материалов тест-систем собственного изготовления ("in-house") является сложившейся мировой практикой, что, вероятно, обусловлено спецификой пока еще новой области, каковой является генодиагностика. Тем не менее опыт нескольких лет применения таких анализов в США [Dodd R.Y. et al., 2002], во Франции [Pillonel J. et al.,. 2002], в Италии [Velati С. et al., 2002] и в Испании [Alvarez М. et al., 2002] свидетельствует о реальном снижении риска инфицирования через препараты донорской крови. С учетом невысокой сложности исполнения генамплификационных анализов и создания в последнее время относительно недорого оборудования, в том числе и отечественного производства, внедрение генотестирования в практику службы крови России является назревшей и актуальной задачей.
Полимеразные цепные реакции и другие генамплификационные методы
Определение возбудителей на основе обнаружения и идентификации его генома, являющееся наиболее прямым и точным диагностическим методом, стало принципиально возможным еще в 80-е годы благодаря развитию методов гибридизационного анализа нуклеиновых кислот [Mattews J.A. and Kricka L.J., 1988]. Однако для появления простых и доступных для клинической практики генодиагностических методов решающим оказалась возможность размножать практически любой выбранный фрагмент ДНК во много миллионов раз, после чего он может быть обнаружен и идентифицирован либо простым электрофорезом в геле, либо гибридизацией по простой методике. Такое размножение обеспечивают полимеразные цепные реакции (ПЦР) [Mullis К.В., 1985; Saiki R.K. et al., 1988]. Общая схема ПЦР приведена во многих учебниках и методических пособиях (в частности, «Молекулярная клиническая диагностика», М., «Мир», 1999; монографии Б.Глика и Дж.Пастернака и многих других; первые обзоры и пособия по ПЦР [Ehrlich Н.А., ed„ 1989; Innis М.А. et al,, 1990] достаточно интересны и сейчас). ПЦР состоит из повторяющихся циклов денатурации ДНК, гибридизации ее двух цепей с двумя олигонуклеотидными праймерами и затем достройки этих праймеров термостабильной ДНК-полимеразой на двух цепях ДНК навстречу друг другу; процесс проходит в программируемом термоциклере. В результате на каждом цикле происходит удвоение (при 100%-ном выходе) заключенного между праймерами участка ДНК. При этом высокая специфичность процесса гарантируется гибридизацией праймеров с ДНК при довольно высоких температурах (55С и выше).
ПЦР не является единственным методом амплификации нуклеиновых кислот: введен даже термин NAT-методы (Nucleic Amplification Techniques). Из других методов амплификации нуклеиновых кислот, помимо ПЦР, при генодиагностике применяется изотермическая амплификация с помощью трех ферментов, а также лигазная цепная реакция (Hgase chain reaction, LCR). Эти процессы можно считать полными аналогами ПЦР, поскольку в них происходит экспоненциальное размножение определяемого фрагмента генома. Другие методы, также относимые к NAT (анализ с помощью разветвленных (branched) ДНК и с использованием Q-beta репликазы), представляют собой гибридизационный анализ с высокочувствительной меткой. Наконец, можно отметить и малоизвестные методы, описанные наряду с другими NAT-методами [D.L.Wildbrauk and D.H.Faras, 1995]: SDA (strand displacement amplification, внедренная фирмой Becton Dickinson), использующую полимеразную достройку в присутствии тиоаналога dATP и расщепление рестриктазой Hindi, LAT (ligase activated transcription), похожую на ТМА, а также Cycling probe technology - расщепление РНКазой Н гибридного ДНК-РНК-ДНК-зонда на матрице одноцепочечной ДНК.
Авторы [Guatelli J.C. et al., 1990], предложившие изотермическую трехферментную амплификацию, сравнивают ее с процессом ретровирусной инфекции в пробирке, В настоящее время она является наиболее широко применяемым альтернативным ПЦР NAT-методом. В качестве определяемой мишени может использоваться только одноцепочечная РНК, процесс катализируется тремя ферментами (обратной транскриптазой, РНКазой Н и РНК-полимеразой Т7) и проходит при постоянной температуре (40-42 С). Как и при ПЦР, размножаемый участок ограничен двумя олигонуклеотидными праймерами, полимеразная достройка которых направлена навстречу, друг другу, но в этом процессе один из праймеров (антисмысловой по отношению к РНК-мишени) имеет на 5 -конце 17-звенный промотор РНК-полимеразы Т7. Именно с достройки этого праймера обратной транскриптазой на матрице определяемой РНК начинается процесс амплификации. Далее РНКаза Н (этот фермент добавляется специально, собственной Н-активности обратной транскриптазы недостаточно) разрушает цепь РНК в комплексе с кДНК, в результате чего на последней освобождается место для посадки второго праймера. Этот праймер достраивается на матрице кДНК обратной транскриптазой (которая на ДНК работает так же эффективно, как и на РНК) до промоторного конца первого праймера, в результате чего образуется двухцепочечная ДНК-копия определяемого участка с промотором РНК-полимеразы Т7, На этом завершается стадия инициации и становится возможной собственно амплификация. РНК-полимераза Т7, узнавая свой промотор, синтезирует несколько сотен РНК-копий. Далее с этими РНК (антисмысловыми по отношению к исходной) связывается второй праймер, происходит его достройка обратной транскриптазой, разрушение РНК в образовавшемся комплексе РНК-ДНК, на освободившуюся цепь ДНК садится первый праймер с промотором Т7-полимеразы и после достройки вновь образуется двухцепочечная ДНК с промотором. Такие циклы (транскрипция — обратная транскрипция - разрушение РНК — синтез второй цепи кДНК - транскрипция новосинтезированной ДНК) повторяются далее аналогично ГТЦР, но в отличие от последней проходят непрерывно при постоянной температуре и на каждом цикле определяемый участок размножается не в два раза, а в несколько сотен раз. В результате сопоставимые с ГТЦР уровни амплификации образуются уже через час после начала реакции, и размноженный материал представлен в основном одноцепочечной РНК, удобной для гибридизационного обнаружения.
Процесс изотермической амплификации весьма сложен в исполнении, поскольку требует согласованной работы трех нетермостабильных и дорогостоящих ферментов (кроме того, для сохранности РНК в смесь вводят ингибитор рибонуклеаз RNAsin). Его применение требует использования РНК-мишени, но это не является недостатком, так как диагностика РНК-содержащих вирусов (ВИЧ, вирус гепатита С) является весьма актуальной. Кроме того, в последнее время для генодиагностики бактериальных инфекций начала широко использоваться рибосомальная РНК, многокопийность которой позволила резко увеличить чувствительность анализа по сравнению с обычной ДНК-ПЦР. Естественно, большим достоинством изотермической амплификации является возможность обходиться без термоциклера. Кроме того, такая амплификация полностью аналогична ШДР в плане возможности использования внутренних стандартов для устранения ложноотрицательных результатов (см. раздел 2.5). Это определяет довольно широкое применение изотермической амплификации в настоящее время и в перспективе. Метод известен под названием NASBA (nucleic acids sequence-based amplification), данным ему фирмой Organon Teknika Corporation (Нидерланды, сейчас эта фирма называется BioMereiux), на его основе начавшей еще в 1992 году выпуск тест-системы для определения ВИЧ-1, и под названием ТМА (transcription-mediated amplification), данным ему фирмой Gen Probe (США).
Методы обработки .сыворотки и плазмы крови для получения суммы ДНК и РНК для ПЦР-анализа
Сложность обработки проб наиболее важного при контроле вирусной безопасности материала - плазмы крови состоит не только в уже отмеченной необходимости работать с РНК, но и в неизбежном концентрировании вирусных нуклеиновых кислот в минимальном объеме. Так как вирусные частицы нельзя собрать, подобно клеткам (см. ниже раздел 2.6.2) в небольшом плотном осадке, в процесс выделения приходится использовать достаточно большой по сравнению с объемом реакционной смеси ПЦР объем жидкой пробы - 100-200 мкл даже после концентрирования вирусов посредством ультрацентрифугирования. Кроме того, стабилизированная плазма крови содержит довольно много белков и других биополимеров, которые могут быть агрегированы вплоть до образования видимой взвеси. Вирусные частицы, если они есть, практически всегда покрыты антителами, и для таких иммунокомплексов весьма вероятно нахождение их внутри белковых агрегатов.
Выделение нуклеиновых кислот из такой сложной смеси при одновременной гарантии сохранности РНК обеспечивает метод фенольной депротеинизации. В его исходном варианте [Chomczynski P. and Sacchi N., 1987] он предназначался для выделения из клеток суммы весьма нестойких мРНК. Метод включал лизис осадка клеток в концентрированном гуанидинтиоцианате с детергентом и затем экстракцию белков смесью фенола и хлороформа, далее проводилось осаждение ДНК и РНК изопропанолом. Однако для этого метода существует и успешно применяется более удобный вариант. В смесь гуанидинтиоцианата, фенола и воды (вода и фенол не расслаиваются благодаря присутствию гуанидинтиоцианата в высокой концентрации) с добавками детергента и меркаптоэтанола (производится московской фирмой «Литех», а также зарубежными фирмами под названиями "RNAzol", "Trizol") добавляется исследуемый жидкий материал (плазма крови), при перемешивании образуется однородный прозрачный раствор. В такой сильноденатурирующей среде разрушаются все агрегаты биомолекул и высвобождается ДНК и РНК. Далее в смесь добавляется хлороформ, что приводит к ее разделению на нижний (фенольно-хлороформовый) и верхний (водно-гуанидинтиоцианатный), причем последний содержит все РНК и вирусные ДНК (но не хромосомные ДНК, которые оказываются в фенольном слое и на границе слоев [Chomczynski P. and Sacchi N., 1987]). В отобранный водный слой добавляют изопропанол, осаждающий ДНК и РНК (для лучшего осаждения обычно вводится РНК-носитель), осадок отделяют на настольной центрифуге при 12000g и промывают этанолом. Метод весьма эффективен и гарантирует выделение РНК даже из сложных проб, перегруженных белками и их агрегатами (в частности, применим для цельной крови [Zhang Y. and Yunis J.J,, 1995], но слишком трудоемок для массовых анализов и связан с использованием токсичных реагентов.
Для выделения ДНК гепатита В из сыворотки крови был описан более простой метод [Ishizawa М. et al., 1991]. Он предусматривает лизис биоматериала в концентрированном йодистом натрии и последующее высаживание ДНК изопропанолом прямо из полученного лизата. Аналогичный однопробирочный метод применяет и фирма Roche в своих тест-системах серии Ampltcor, но отличие состоит в том, что лизирующий реагент содержит концентрированный гуанидинтиоцианат, и выделение эффективно проходит для самых малых количеств вирусных ДНК и РНК [Sun R. et al., 1998]. Подобный метод намного проще в исполнении, чем фенольная депротеинизация, и эффективно применяется для проб типа стабилизированной плазмы крови.
К наиболее широко применяемым методам обработки проб плазмы крови и других биоматериалов относятся методы, основанные на сорбции нуклеиновых кислот на твердом носителе и их последующей элюции. Метод связывания ДНК и РНК на силикагеле был предложен еще в 1990 году [Boom et al., 1990]. Эффективность этого метода была подтверждена многолетней практикой, хотя свойство ДНК и РНК сорбироваться на силикагеле в концентрированном растворе гуанидинтиоцианата не объяснено до сих пор. В оригинальном варианте после стадии лизиса-сорбции (проходит при комнатной температуре) силикате ль со связанными ДНК и РНК отмывается вначале два раза концентрированным гуанидитиоцианатом (условия наилучшего растворения биоматериала и удаления примесей), затем два раза водным этанолом и один раз ацетоном. Далее силикагель высушивается и с него смываются ДНК и РНК водой или водным буфером.
Привлекательность метода сорбции на силикагеле связана прежде всего с возможностью получения хорошо очищенного материала для ПЦР из сложных клинических проб, поскольку в данном методе сорбент со связанными ДНК и РНК промывается концентрированным раствором гуанидинтиоцианата, то есть в условиях наиболее полного лизиса и растворения клеток и вирусов и блокирования действия РНКаз. Особую привлекательность этому методу придает возможность его автоматизации, поскольку все его стадии легко осуществимы в проточной системе. На основе этого метода фирмой Organon Teknika Corp. в 1997 году (сейчас эта фирма называется BioMereiux) был создан автоматический экстрактор Nucli Sense, позволивший, кроме того, повысить чувствительность определения вирусов в плазме крови путем увеличения объема обрабатываемого материала [Cuypers Н.Т.М. et al., 1999].
Принцип сорбции-отмывки-элюции ДНК и РНК применяется в большинстве предлагаемых систем выделения ДНК и РНК. Фирма Qiagen. производит одноразовые колонки со специальными связывающими фильтрами и наборы реагентов, которые обеспечивают выделекие вирусных РНК и ДНК из плазмы крови с высоким (70-90%) выходом. Очень характерным является то, что выделение ДНК и РНК на колонках с фильтрами фирмы Qiagen используется в очень многих работах последнего времени, В одной из публикаций [Lee D.-H. et al., 2001] для ПЦР-скрининга донорской плазмы описан автоматический вариант выделения ДНК и РНК путем фильтрования через поливинилиденфторидный (PVDF) фильтр в микропланшетном формате .
Особый интерес в плане упрощения и автоматизации процесса обработки проб для ПНР представляет собой сорбция ДНК и РНК на магнитных частицах. Эти частицы вместе со связанными с ними НК могут быть легко удалены из раствора при воздействии внешнего магнитного поля; при этом нет необходимости в использовании центрифуг и весь процесс проходит в закрытой системе в автоматическом режиме. В уже упомянутом аппарате MagNAPure LC используется проточная система с отделением магнитных частиц, с которых затем проводится элюция ДНК и РНК прямо в капилляры прибора LightCycler [MagNA pure LC, 2002]. В то же время фирма Dynal предлагает магнитные частицы, которые после сорбции материала и отмывки примесей не требуют элюции и вводятся прямо в смесь ПЦР или РНК-ПЦР. Описаны удобные способы выделения ДНК с помощью таких частиц из крови, костного мозга и клеточных культур [Deggerdal A. and Larsen F., 1997], из бактерий, грибов, водорослей и других организмов и тканей [Rudi К. et al., 1997].
Конструирование внутренних стандартов методом направленного соединения фрагментов ДНК. Первый опыт количественной ПЦР
Описанная в главе 2.5 литобзора количественная ПЦР с внутренним стандартам предоставляет возможность контроля чувствительности анализа и достоверности отрицательного результата. Внутренний стандарт ПЦР конкурентного типа, добавленный в реакционную смесь в известном количестве, будет и в отрицательных пробах давать сигнал, указывающий на эффективность протекания ПЦР. Если его количество минимально и соответствует чувствительности ПЦР (это, как уже отмечалось, 10 молекул для двукратной ПЦР и 100 молекул для однократной), то сигнал ог внутреннего стандарта не будет «гасить» даже самые слабые сигналы от мишени. С другой стороны, именно конкурентный характер подобных внутренних стандартов позволяет отличить положительные результаты от ложноположительных. Небольшие случайные контаминации смеси реагентов до ПЦР амплификонами могут быть просто «заглушены» внутренним стандартом, особенно если условия анализа позволяют ввести его в достаточно большом количестве. При наличии небольших контаминации отношение сигналов мишени и внутреннего стандарта в отрицательном контроле даст фоновый уровень - аналог "cut-off в ИФА-анализе. В положительных пробах этот уровень будет заметно превышен, а пробы, в которых сигнал мишени не превышает фона, можно считать отрицательными, особенно если фоновый сигнал слабее сигнала внутреннего стандарта, взятого в указанной выше минимальной концентрации. Кроме того, внутренние стандарты конкурентного типа, изначально применяемые для количественной ПЦР, позволят оценивать величину вирусной нагрузки в положительных пробах и контролировать эффективность лечения.
Первый опыт конструирования внутренних стандартов и количественной ПЦР был проведен еще в 1993 году в ходе уже упомянутой работы по определению содержания провирусной ДНК ВИЧ в лейкоцитах крови разных пациентов в ходе лечения, проводимой в Институте вирусологии РАМН. Как уже отмечалось, для получения точных результатов вне зависимости от потерь ДНК при подготовке пробы была применены две количественных ПЦР с внутренними стандартами: одна на фрагмент вирусного гена рої, другая на фрагмент клеточного гена HLA-DQa. По отношению величин, полученных при этих двух анализах, определялось число копий ВИЧ-ДНК на 1000 лейкоцитов. Подобный вариант анализа позднее представлялся идеальным и с точки зрения генодиагностики, поскольку определяется количество возбудителя в расчете на объем введенного в анализ материала с учетом потерь.
В качестве внутренних стандартов было решено использовать двухцепочечные продукты ПЦР - амплификоны, что являлось наиболее простым вариантом и было возможно согласно литературным данным [Cell F. et al., 1993]. С другой стороны, очень серьезные требования близости структур размножаемых участков в ДНК-мишени и внутреннем стандарте, выдвигаемые в ранних работах по количественной ПЦР, определяли необходимость получения внутреннего стандарта, в котором последовательность ДНК-мишени вблизи мест посадки праймеров была бы полностью сохранена, а примерно в середину размножаемого участка была бы введена вставка или делеция. Однако применяемый тогда количественный метод, основанный на вырезании из геля после электрофореза полосок с продуктами гибридизации амплификонов с радиоактивно-мечеными зондами (см. подпись к табл.5), требовал введения довольно больших вставок или делений. Для лучшего разделения при гель-электрофорезе полосок-сигналов определяемой ДНК и внутреннего стандарта для ВИЧ была запланирована вставка 81 н.п. в размножаемый участок длиной 130 н.п., а для клеточного гена - делеция 40 н.п. в размножаемом участке 242 н.п. Такие различия противоречили данным одной из работ [Pannetier S. et al., 1993], где применялась вставка 4 н.п. в размножаемый участок длиной 159 н.п. и для анализа продуктов использовался ДНК-секвенатор. С другой стороны, была описана количественная ПЦР, где длины продуктов мишени и стандарта составляли 180 и 260 н.п. соответственно [Piatak М. et al., 1993]. Поэтому оценка эффективности работы полученных внутренних стандартов в количественной ПЦР представляла особый интерес.
С учетом перечисленных довольно высоких требований оптимальным методом конструирования внутренних стандартов представляется направленное соединение фрагментов ДНК методом ПЦР. Этот метод под названием «полимеразная рекомбинация» был предложен нами еще в 1990 году, и он был опубликован в журнале Nucleic Acids Research почти одновременно с серией аналогичных работ других авторов. Закрепившееся за этим методом название DNA splicing by overlap extension [Horton С, et al, 1989] как раз отражает механизм процесса соединения (рис.19). При этом перекрывающиеся последовательности на концах, обеспечивающие соединение по такой схеме, вводятся при предварительном ПЦР-копировании соединяемых фрагментов с использованием праймеров соответствующей структуры. Этот метод позволяет соединять с помощью ПЦР выбранные фрагменты одной или разных ДНК практически в любой заданной точке, что удобно для конструирования внутренних стандартов и применяется до настоящего времени [Drosten С. et al., 2000].
Схема конструирования внутреннего стандарта на ВИЧ, имеющего вставку 80 н.п, в размножаемом при ПЦР участке, показана на рис.20, а в таблице 4 приведена структура используемых при этом праймеров, заданная в соотетстсвии с их назаначением.,Как видно из приведенных в таблице 5 данных, внутренний стандарт на ВИЧ обеспечивал прямую пропорциональную зависимость (при учете небольшого фона) отношения сигналов мишени и стандарта от количества возбудителя в пробе. Аналогичные данные были получены и для внутреннего стандарта на ген HLA-DQa, концы которого, в отличие от стандарта на ВИЧ, соответствовали местам посадки прайм еров ПЦР (рис.21). Проведение двух количественных ПЦР с внутренними стандартами (на ген ВИЧ и на клеточный ген) для проб крови нескольких ВИЧ-инфицированных пациентов показало, что содержание вирусной ДНК в крови составляет от 2 до 500 копий на 1000 лимфоцитов и сильно различно для разных пациентов. Обнаружены его закономерные уменьшения при азидотимидиновой терапии. Такая же методика (но с применением анализа изображения гель-электрофореграммы после видеокомпьютерной регистрации) была применена нами и позднее, в ходе небольшой совместной работы с Главным военно-клиническим госпиталем им.Н.Н.Бурденко. Было замечено снижение содержание ВИЧ-ДНК в лейкоцитах крови пациентов в 1,5-2 раза в ходе волновой терапии [Скворцов С.В и др., 2000]. Опыт работы, однако, показал, что дополнительная количественная ПЦР на клеточный ген делает методику довольно громоздкой. Тем не менее такой дополнительный контроль количества лейкоцитарной ДНК оказался полезен для подтверждения вывода о весьма низком содержании ДНК цитомегаловируса в лейкоцитах крови немногочисленных вирусоносителей, обнаруженных среди доноров (см.ниже).
Результаты рассмотренного первого опыта по количественной ПЦР показали, что различия в длине продуктов ПЦР — сигналов ДНК-мишени и внутреннего стандарта могут быть достаточно велики, чтобы для их разделения использовать обычный гель-электрофорез. Это явилось основанием для последующего синтеза по аналогичной рис.13 схеме внутренних стандартов на вирусы гепатитов В и С, цитомегаловирус, а также на ген токсина холерного вибриона.
Тест-системы (набор реагентов) для определения ДНК цитомегаловируса методом двукратной ПЦР
Перспективой развития генодиагностики в настоящее время является, как уже можно с уверенностью сказать, переход к рассмотренной в главе 2.4 литобзора ПЦР в реальном времени. Ее главной особенностью, определяющей решающее преимущество данной технологии по сравнению с электрофорезом и гибридизацией на твердой поверхности, представляется флуоресцентная детекция продукта ПЦР в закрытой пробирке. Как уже отмечалось, это устраняет главный источник контаминации, резко снижает требования к лаборатории и трудоемкость анализов, делая в конечном счете генодиагностику намного более простой и доступной. Это определяет перспективность данной технологии, несмотря на ее нынешнюю дороговизну, именно для обычных ПЦР-анализов.
Основной причиной дороговизны аппаратов для ПЦР в реальном времени представляется сложность измерения флуоресценции реакционной смеси ПЦР непосредственно в работающем термоблоке. Это вызывает естественное предложение разделить процессы ПЦР и флуоресцентной детекции, пусть даже ценой потери большинства уникальных возможностей ПЦР в реальном времени. Поскольку образование продукта ПЦР приводит к увеличению флуоресценции смеси, причем последнее не может быть вызвано какими-либо другими процессами в ходе ПЦР, то для детекции продукта и получения результата анализа может быть достаточно измерить флуоресценцию реакционной смеси в пробирке до и после ПЦР (проводимой, конечно, в обычном термоциклере) и определить разницу. Этого может быть достаточно для решения вопроса о наличии возбудителя в пробе, вполне допустим также контроль достоверности результата с помощью внутреннего стандарта (дающего отличную от возбудителя флуоресценцию, см. главу 4 литобзора) и при этом сохранено главное преимущество ПЦР в реальном времени -возможность регистрации продукта в герметически закрытой пробирке.
К сожалению, для такого метода детекции следует ожидать лишь небольшой разницы во флуоресценции до и после ПЦР. Это обусловлено не только рассмотренными в литобзоре свойствами флуоресцирующих зондов, но и фоновой флуоресценцией или светорассеиванием пластика пробирки, масла или парафина, а также несущественных для ПЦР микропримесях в реагентах, воде и тем более в анализируемом материале. Подобная проблема совершенно естественна и неизбежна, поскольку к материалам для ПЦР никогда не применялось и не будет применяться требование флуоресцентной чистоты. Поэтому для успешной работы должно быть достаточно небольшой, но обязательно стабильной и воспроизводимой разницы во флуоресценции до и после ПЦР. Именно эта разница, и притом в лучших условиях строго фиксированной пробирки, регистрируется при ПЦР в реальном времени, так что величина этой разницы может быть совсем невелика с учетом высокоточных и чувствительных аппаратов, используемых для этой цели.
В пользу значимости подобной идеи регистрации продуктов ПЦР методом простейшей флуориметрии говорит и тот факт, что к похожему решению одновременно пришли и в московской фирме «ДНК-технология», возглавляемой Д.И.Трофимовым. В их возможностях было (в отличие от нас) сделать простой и удобный флуориметр «Джин», специально приспособленный для ПЦР с регистрацией результатов на компьютере. Однако используемая при этом программа (по крайней мере в версии января-июня 2002 года) предусматривает лишь флуориметрию образцов после ПЦР, а не определение рассмотренной выше разницы до и после. На наш взгляд, это серьезно ограничивает возможности метода, так как величина флуоресценции в отрицательных образцах будет также существенной, а ее характерное постоянство в ходе ПЦР в данном варианте не проявляется. Однако наличие уникального «Джина» (серийное производство которого к концу 2002 года еще не начато) и любезное содействие Д.И.Трофимова позволило нам провести первые опыты по детекции продуктов ПЦР с помощью флуоресцентных зондов.
Следует сразу отметить, что переход от ПЦР в реальном времени к простой флуориметрии сразу исключает использование красителей-интеркаляторов типа SYBR и любых других, поскольку идентификация амплификонов в этом случае возможна только по температурной зависимости флуоресценции, Флуориметрия при комнатной температуре может быть практически возможна лишь в том случае, когда образование специфического амплификона сопровождается необратимыми изменениями в структуре флуоресцентных зондов, приводящих к их устойчивой светимости в условиях извлечения из термоциклера после ПЦР и реального проведения измерений. Этому дополнительному требованию отвечает лишь экзонуклеазное расщепление зонда и в несколько меньшей мере - использование праймера-скорпиона (см.также ниже). Комплексы амплификонов с молекулярным бакеном или с передающей энергию по типу FRET парой зондов, хорошо наблюдаемые на стадии отжига (annealing) при ПЦР в реальном времени, после извлечения пробирки из термоциклера полностью устранится при реассоциации двух цепей амплификона. Преодолеть этот эффект может только получение одноцепочечных амплификонов при асимметричной ПЦР [Poddar S К, 2000], но это приведет к снижению чувствительности и, возможно, другим проблемам.
Далее в разделах 4.6.2-4.6.4 приводятся варианты структур флуоресцентных зондов разного типа для определения ДНК гепатита В, взятого в качестве первого примера. Некоторые из этих зондов были синтезированы в московской фирме «Синтол» и опробованы в ПЦР с регистрацией на флуориметре «Джин» (раздел 4.6.2).
Этот зонд соответствует звеньям 2035-2015 в ДНК вируса гепатита В (нумерация по HPBADW2, AC D00330) и расположен внутри участка, амплифицируемого при использовании описанной в главе 5. тест-системы. Подобная структура зонда и пара флуорофор FAM - тушитель TAMRA использована во многих работах. Этот зонд был синтезирован ЗАО «Синтол» прежде всего для сравнения Taq-полимераз от разных производителей по их 5 -экзонуклеазной активности. Как уже отмечалось, именно такая активность обеспечивает необратимый характер отщепления 5 -концевого FAM и стабильный даже после ПЦР эффект разгорания его флуоресценции.
Первой проверкой синтезированного зонда было его расщепление ДНКазойї. Этот фермент неспецифически расщепляет любые цепи ДНК, что для зонда FTB2 должно привести к разделению пары флуорофор-тушйтель и к разгоранию флуоресценции FAM. Этот эффект оказался заметным даже на трансиллюминаторе, используемом для обычного просмотра агарозных гелей после электрофореза ДНК. Бледно-розовая флуоресценция TAMRA, видимая при освещении на трансиллюминаторе пробирки с FTB2 в концентрации 2-5 пмоль/мкл, сменяется после обработки ДПКазойї на ярко-зеленую флуоресценцию FAM. Этот результат полностью подтверждает работоспособность данного зонда в системе TaqMan. Однако в реальной ПГДР зонд вводится в количествах намного меньших (1-2 пмоль на пробу объемом 20-40 мкл, то есть в концентрации около 0,05 пмоль/мкл), и его флуоресценцию невозможно рассмотреть визуально. Это определяется тем, что при ПЦР обычно образуется не более 0.5-5 пмоль амплификона, и такие количества хорошо видны при обычном электрофорезе, эффективность же экзонуклсазного расщепления в ходе ПЦР, вероятно, довольно невелика.
