Введение к работе
Актуальность проблемы. В последние годы повышается интерес к отдельным типам гемоглобина как диагностически значимым маркерам. Существует разнообразие патологических состояний красной крови (талассемии, онкопатология, гипоксии и др.), при которых важное диагностически-прогностическое значение имеет не только изменение количества общего гемоглобина крови, но и отдельных его типов. К наиболее физиологически и диагностически значимым типам гемоглобина человека относятся гемоглобины взрослого HbА1, HbА2, фетальный гемоглобин (HbF) и эмбриональный гемоглобин (HbP).
В современной клинической практике большинства стран для количественного анализа гемоглобинов в качестве стандартных применяются колориметрические циангемоглобиновые методы, рекомендованные комитетом по стандартизации Европейского и Международного Общества по Гематологии (Deutscher Normenausschuss, Normentwurf DIN 58931, 1964), основным из которых является унифицированный гемоглобинцианидный метод [Зорина Н.В., 1980; Делекторская Л.Н., 1992; Гаранина Е.Н., 1997]. Большинство колориметрических методов количественного определения гемоглобина не отличаются избирательностью: с их помощью определяется лишь общее количество гемоглобина крови, а не отдельных его типов. Даже в случае определения щелочеустойчивой фракции гемоглобина по Зингеру и Бетке регистрируются несколько типов гемоглобина, а не только фетальный [Betke K., 1958; Betke K., 1979]. Кроме того, методы Бетке и Зингера несовершенны при определении малых концентраций гемоглобина. Методика определения гемоглобинов путем электрофореза в геле крахмала, агарозы или ацетата целлюлозы при рН 8,4-8,6 [Huisman, T.H.J. 1996, Тиц Н.У. 1997, Fairbanks, V.P. 1999] является полуколичественной.
В современной медицинской лабораторной практике четко прослеживается тенденция перехода от определений фракций веществ к индикации каждого вещества фракции в отдельности, что, очевидно, повышает качество диагностики и оценки состояния пациента. Безусловно, современная медицина нуждается в появлении новой схемы тестирования гемоглобинового спектра человека, которая позволяла бы определять уровень каждого из основных типов гемоглобина. В последние годы появились единичные работы по изучению отдельных типов гемоглобина с помощью иммунохимических тест-систем [Никулина Д.М. 2002; Токарев Ю.Н. 2003].
Огромным преимуществом иммунохимических методов является их высокая специфичность, которую обеспечивают интимные избирательные взаимодействия: антиген–антитело. Кроме того, к преимуществам иммунохимических методов можно отнести высокую чувствительность, позволяющую количественно определять белки в малых пробах, а также то, что эти методы позволяют исследовать сложные биологические смеси без какой-либо предварительной очистки и выделения исследуемого белка.
Таким образом, моделирование моноспецифических иммунохимических тест-систем на основные типы гемоглобина (HbА1, HbF, HbP и др.), разработка комплексной схемы оценки гемоглобинового спектра крови и их внедрение в клиническую практику актуально и целесообразно.
Цель исследования: оптимизация клинической оценки состояния красной крови путем пополнения фундаментальных сведений по основным типам гемоглобина и формирования комплексной иммунохимической схемы оценки гемоглобинового спектра.
Задачи исследования
-
Провести сравнительное иммунобиохимическое изучение физико-химических свойств HbА1, HbА2, HbF и HbP.
-
Разработать рациональные способы выделения и очистки основных типов гемоглобина.
-
Смоделировать моновалентные иммунохимические тест-системы на гемоглобины А1, А2, F и P.
-
Разработать способы количественного иммунохимического анализа основных типов гемоглобина.
-
Определить сроки начала и динамику продукции HbР и HbF на ранних этапах онтогенеза человека.
-
Создать комплексную схему оценки гемоглобинового спектра крови на основе иммунохимических тест-систем и установить ее клинико-диагностическое значение при патологии эритрона и заболеваниях, сопровождающихся гипоксией.
Научная новизна исследования
Пополнены фундаментальные данные по физико-химическим свойствам HbA1, HbA2, HbF, получены новые сведения по некоторым физико-химическим свойствам эмбрионального гемоглобина: относительной электрофоретической подвижности в полиакриламидном и агарозном гелях, изоэлектрической точке, степени щелочной резистентности и отношению к осаждающим агентам, на основании чего разработаны и апробированы оригинальные алгоритмы их выделения и очистки.
Сконструирована моновалентная иммунохимическая тест-система на эмбриональный гемоглобин. Смоделированы и успешно апробированы новые точные и надежные оптимальные алгоритмы количественного анализа по гемоглобинам A1, A2, F и P. Впервые разработана комплексная схема количественной оценки гемоглобинового спектра, отличающаяся точностью, специфичностью, надежностью и экономичностью.
Уточнены сроки начала продукции антенатальных гемоглобинов и проведен параллельный иммунохимический анализ динамики концентрации HbР и HbF в раннем эмбриогенезе.
Впервые выявлен HbР и отмечено повышение концентарции HbF в крови больных эритремией, сублейкемическим миелозом, острым и хроническим миелолейкозом, что доказывает значение этих белков как канцероэмбриональных антигенов в диагностике миелопролиферативных заболеваний.
Впервые показано появление HbР и достоверное изменение уровня HbF в крови новорожденных с тяжелой внутриутробной гипоксией, задержкой внутриутробного развития и глубокой недоношенностью, доказывающее диагностическую роль тестов на HbP и HbF при патологии новорожденных.
Впервые отмечено значительное превышение концентрации фетального гемоглобина в крови больных опийной наркоманией и алкоголизмом.
Практическая значимость работы
Предложенные оригинальные алгоритмы выделения и очистки гемоглобинов А1, А2, F и P, позволят экономить исходный биоматериал, реактивы, временные и финансовые ресурсы. Полученные белковые препараты могут быть использованы для научных исследований и для практического применения.
Разработаны и используются в клинической практике следующие тесты: способ количественного анализа HbF ракетным электрофорезом с додецилсульфатом натрия, способ полуколичественного анализа HbP путем трехэтапной иммунодиффузии по Оухтерлони, способ количественного анализа HbA1 и HbA2 радиальной иммунодиффузией по Манчини. Составлена инструкция по применению сформированного набора реагентов для иммунохимической индикации HbF, HbP, HbA1 и HbA2. Разработана и используется в клинической практике комплексная схема оценки гемоглобинового спектра, основанная на сочетании оптических и иммунохимических методов индикации гемоглобинов.
Результаты диссертационного исследования и предложенные рекомендации могут быть использованы в работе клинико-диагностических лабораторий, поликлинических, гематологических, педиатрических, неонатологических, наркологических, пульмонологических, кардиологических, онкологических и терапевтических лечебно-профилактических учреждений.
Внедрение результатов исследования позволит оптимизировать способы аналитической и препаративной работы с основными типами гемоглобина человека, осуществлять более точный и полный анализ гемоглобинового статуса и состояния красной крови, что будет способствовать улучшению диагностики, лечения и прогноза заболеваний, сопровождающихся изменением концентрации общего гемоглобина или отдельных его типов.
Внедрение результатов исследования в практику
Разработанные в диссертации методики и полученные результаты исследований внедрены в практическую деятельность КДЛ учебно-научно-диагностического центра ГОУ ВПО АГМА; МУЗ «Клинический родильный дом» г. Астрахань; ГУЗ Александро-Мариинской ОЦКБ, г. Астрахань; НУЗ Медико-санитарная часть, г. Астрахань; МУЗ клиническая больница №5, г. Астрахань. Теоретические положения используются в учебном процессе на биохимии с курсом клинической лабораторной диагностики, патологической физиологии ГОУ ВПО АГМА Росздрава.
Материалы научных исследований используются в научных разработках и в педагогическом процессе на всех факультетах на кафедрах биохимии с курсом клинической лабораторной диагностики и патологической физиологии Астраханской государственной медицинской академии.
Положения, выносимые на защиту:
1. При очистке основных типов гемоглобина наиболее эффективны методы фракционирования, основанные на разделении по изоэлектрической точке: ионообменная хроматография и препаративный электрофорез. При электрофоретическом разделении гемоглобинов оптимальным является диапазон рН рабочего буфера от 6,0 до 6,6. Значительное влияние на электрофоретическую подвижность HbA1, HbA2, HbF и HbP в агарозе и ПААГ оказывают додецилсульфат натрия, тритон, мочевина и бихромат калия. На ранних этапах выделения HbP следует использовать модифицированную методику щелочной денатурации с 40-секундной экспозицией в 1,2 н NaOH.
2. Оптимальными для количественного определения основных типов гемоглобина являются методы иммунохимического анализа. Разработаны точные алгоритмы селективного количественного анализа HbA1, HbA2, HbF и HbP, основанные на методах двойной иммунодиффузии, ракетного иммуноэлектрофореза и РИД по Манчини. Создана и внедрена в клиническую практику комплексная схема количественной оценки гемоглобинового спектра по основным типам гемоглобина, основанной на модифицированных иммунохимических методах.
3. Иммунохимическим путем проведен количественный анализ динамики концентраций HbР и HbF в раннем эмбриогенезе (с 4 по 12 нед гестации), и уточнены сроки начала продукции антенатальных гемоглобинов.
4. Доказано значение HbP и HbF как канцероэмбриональных антигенов в диагностике миелопролиферативных заболеваний, оценке степени тяжести и прогноза гипоксии новорожденных, ЗВУР и глубокой недоношенности. Впервые отмечено значение иммунохимического теста на HbF в оценке тяжести и эффективности лечения больных опийной наркоманией и алкогольной зависимостью.
Апробация работы
Основные положения диссертации доложены на V научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» 2001; на III съезде биохимического общества РАН (Санкт-Петербург, 2002); на 2-й и 3-й научно-практической конференции и школе-семинаре для молодых ученых с международным участием «Белки-маркеры патологических состояний» (Астрахань-Москва, 2001, 2003); на научно-практической конференции с международным участием «Современные достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины» (Астрахань-Москва, 2004), (Астрахань-Волгоград-Москва, 2006), (Астрахань-Москва 2008); на VIII Международной научной конференции «Эколого-биологические проблемы бассейна Каспийского моря» (Астрахань, 2005); на международной научной конференции, посвященной 450-летию г. Астрахани (Астрахань. 2007), на VI Всероссийской конференции молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной онкологии» (Москва. 2007), IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск. 2008), межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные проблемы кардиологии детей и взрослых-2009» (Астрахань. 2009), Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы клиники, диагностики и лечения больных в многопрофильном лечебном учреждении» (С-Пб., 2009).
Материалы диссертации были представлены на выставке: «Инновационные достижения России» XI Петербургского международного экономического форума (С-Петербург. 2007).
Публикации
По материалам диссертации опубликована 41 научная работа, в том числе 12 в рецензируемых научных изданиях, рекомендуемых ВАК, 1 патент.
Структура и объем работы: Диссертация изложена на 264 страницах текста, иллюстрирована 34 таблицами, 39 рисунками, состоит из введения, обзора литературы, главы методов исследования, 6 глав собственных экспериментальных и клинических исследований, обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций. Указатель литературы содержит 251 отечественных и 139 иностранных авторов.
Личное участие автора в получении результатов исследования
Основной материал, представленный в диссертации, получен, обработан и проанализирован лично автором. Исследования проведены на кафедре биохимии с курсом клинической лабораторной диагностики АГМА, КДЛ учебно-научно-диагностического центра ГОУ ВПО АГМА; МУЗ «Клинический родильный дом»; ГУЗ Александро-Мариинской ОЦКБ, НУЗ Медико-санитарная часть, МУЗ клиническая больница №5, г. Астрахань.
