Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 14
1.1. Структура и физико-химические свойства ПХБ арохлор 23
1.2. Источники распространения ПХБ. Санитарные нормативы. токсические свойства пхб 24
1.3. Определение пхб в различных матрицах 29
1.3.1. Конгепер-специфическое определение ПХБ. 33
1.3.2. Скрининговые методы определения ПХБ . 35
1.4. Условия реакции хлорирования ароматических соединений
Экспериментальная часть 55
2.1. Лабораторное оборудование 55
2.2. Растворители, материалы и реагенты 56
2.3. Подготовка лабораторной посуды 58
2.4. Подготовка расходных материалов и очистка реактивов 59
2.4.1. Сульфат натрия 59
2.4.2. Безводный сульфат магния 59
2.4.3. Активированный силикагель 60
2.4.4. Импрегнированный серной кислотой силикагель (44%) 60
2.4.5. Импрегнированный серной кислотой порокварц. 60
2.4.6. Синтез силиката калия 60
2.4.7. Хлористый сульфурил 61
2.4.8. Монохлористая сера 61
2.4.9. Хлорид алюминия 61
2.5. Перхлорирование дибензо-я- диоксина, дибензофурана, дибен30-/7- дитиана, дибензотиофена, феназина 62
2.5.1. Газожидкостная хроматография с электронозахватным детектором. 62
2.5.2. Хромато-масс-спектометрия 62
2.5.3. Приготовление рабочих растворов. 63
2.5.4. Определение фактора отклика для ОХДД. 63
2.5.5. Препаративное перхлорирование диоксинов реагентом ВМС (общая методика 1) 65
2.5.6. Приготовление реагента ВМС для экспериментов в ампулах 68
2.5.7. Перхлорирование дибензо-п-диоксина реагентом ВМС в ампулах (общая методика 2) 69
2.5.8. Перхлорирование модифицированным реагентом ВМС in situ 69
2.6. Перхлорирование ПХБ 70
2.6.1. Газожидкостная хроматография с электронозахватным детектором. 70
2.6.2. Хромато-масс-спектрометрия 70
2.6.3. Приготовление рабочих растворов смесей ПХБ и стандартов. 71
2.6.4. Определение фактора отклика дляДХБ. 73
2.6.5. Методики экстракции ПХБ из воды, почв, донных осадков и биологических объектов 74
2.6.6. Методики пробоподготовки 76
2.6.7. Методики перхлорирования 80
Результаты и их обсуждение 82
3.1. Изучение реакции перхлорирования дибензо-/7-диоксина, дибензофурана и их гетероаналогов 82
3.2. Подбор реагентов и условий проведения реакции перхлорирования ГГХБ 91
3.3. Выбор внутреннего стандарта для проведения анализа 99
3.4. Подготовка проб при анализе методом перхлорирования И ГХ-ЭЗД 111
3.4.1. Лабораторная посуда и ее подготовка 113
3.4.2. Экстракция 115
3.4.3. Очистка на многослойной колонке 116
3.4.4. Выделение и очистка продуктов перхлорирования из реакционной смеси 118
3.5. Градуировка и количественный анализ 121
3.6. Анализ и оценка факторов, влияющих на точность получаемых результатов, при количественном анализе пхб методом перхлорирования и ГХ-ЭЗД 123
3.7. Определение суммарного количества пхб в объектах окружающей среды методом перхлорирования и ГХ-ЭЗД 128
3.8. Определение суммарного количества пхб в биологических объектах методом перхлорирования и ГХ-ЭЗД 131
3.9. Одновременное обнаружение ПХДД/Ф при перхлорировании экстрактов объектов окружающей среды для анализа пхб 133
Выводы 136
Литература 138
Приложение 157
- Скрининговые методы определения ПХБ
- Препаративное перхлорирование диоксинов реагентом ВМС (общая методика 1)
- Подбор реагентов и условий проведения реакции перхлорирования ГГХБ
- Определение суммарного количества пхб в объектах окружающей среды методом перхлорирования и ГХ-ЭЗД
Введение к работе
Одна из проблем, тесно связанная с обеспечением устойчивого развития России и ее интеграцией в мировое сообщество, - защита окружающей среды и населения от воздействия суперэкотоксикантов, к которым относятся полихлорированные дибензо-п-диоксины (ПХДД) и родственные им соединения — полихлорированные дибензофураны (ГГХДФ), а также полихлорированные бифенилы (ГТХБ) и другие соединения. Эти вещества обладают токсичностью в чрезвычайно низких дозах (1-Ю"9 - ЫО"14 г/г или г/мл), длительным периодом полуразложения или полураспада, способностью к биоаккумуляции, склонностью к трансграничному переносу - и входят в группу так называемых «стойких органических загрязнителей» (СОЗ) [1,2].
Проблемы оценки содержания суперэкотоксикантов в окружающей среде связаны, прежде всего, с достижением высокой чувствительности и надежности при аналитических измерениях. Это стимулирует развитие самостоятельного направления в органической аналитической химии -анализа "ультраследовых" количеств органических соединений, которое имеет свою методологию, отличия в процедуре выделения и концентрирования определяемых веществ из различных природных матриц, свои особые приемы в очистке, введении внутренних стандартов и определенные методы детектирования [3].
В настоящий момент лишь хромато-масс-спектрометрия (ХМС) низкого и высокого разрешения (и частично газожидкостная хроматография (ГХ) с электронозахватньш детектором) способна достоверно обнаружить названные ксенобиотики [1]. Проведение детального анализа этими методами является трудоёмким и дорогостоящим. Такое положение в анализе суперэкотоксикантов не позволяет проводить широкомасштабное изучение загрязненных территорий даже на стадиях исследования экологического состояния района, не говоря уже о мониторинге, в задачу которого входит периодическая оценка состояния природных объектов, прогноза развития их состояния в длительном интервале времени при существующей или изменяющейся технологической нагрузке [4,5].
Проведение работ по оценке существующих выбросов и сбросов СОЗ, мероприятия по их уничтожению и детоксикации загрязненных объектов и территорий, осуществление медико-биологических наблюдений и выявление последствий загрязнения СОЗ требует создания эффективной системы мониторинга. Такая система предполагает постоянный эколого-аналитический контроль в широкой сети пунктов наблюдения. Недавний скандал с заражением ПХБ куриного мяса в Бельгии лишний раз подчеркивает необходимость этого [6].
Проведение оперативного мониторинга все возрастающего количества контролируемых объектов невозможно без применения скрининговых методов анализа. Поэтому разработка скрининговых методов анализа представляет собой актуальнейшую задачу, поскольку потребность в такого рода методиках велика. На необходимость создания в России скринингового экспресс-метода анализа различных природных объектов на содержание СОЗов указывалось уже в первой государственной диоксиновой программе [7].
Эколого-аналитический контроль - система мероприятий по выявлению и оценке источников загрязнения, определению уровня загрязненности природных и пищевых объектов вредными веществами, образующимися в результате антропогенного воздействия (прямого, косвенного или катастрофического) на окружающую среду и человека
Если при анализе объектов окружающей среды на ПХДД/Ф прежде всего определяются 17 наиболее токсичных конгенеров [1, 4, 8], суммарный эффект которых соотносится с ПДК, то с ГГХБ ситуация обстоит иначе. В России величины ПДК касаются только суммарного содержания ПХБ, и учитывают суммарный токсический эффект [9,10].
В настоящее время большинство загрязнений ПХБ обусловлено применением промышленных смесей, состав которых хорошо изучен и не изменяется. Следовательно, для получения адекватной картины загрязнения достаточно проводить большое количество экспресс-анализов по определению суммарного содержания ПХБ, периодически контролируя получаемые результаты стандартными аналитическими методами. Поэтому, необходим простой и дешевый метод анализа для оперативного определения этих загрязнителей.
Актуальность темы
В настоящий момент в мире официально признаны два скриниговых метода для определения ПХБ в воде и почве: иммуноферментный ЕРА № 4020 и основанный на реакции перхлорирования ЕРА №5 08а.
Иммуноферментный метод достаточно удобен и прост. Однако часто из-за влияния матрицы он дает завышенные результаты. Более того, использование оптических спектрофотометров в качестве анализаторов сокращает динамический диапазон определения ПХБ в анализируемом образце. Также не предусмотрено использование внутренних стандартов, что вносит ошибки в получаемый результат.
Метод перхлорирования основан на превращении ПХБ в ДХБ реакционной смесью SbClj и порошкообразного железа при 270С. Этот метод был разработан только для анализа проб воды, и оказался ненадежным, прежде всего, из-за капризного поведения используемого реагента, который крайне чувствителен к алифатическим углеводородам.
При этом его использование связано с рядом неудобств, в частности необходимо соблюдать меры взрывобезопасности как на стадии проведения реакции (термостатирование при 270С), так и на стадии разложения реакционной смеси. Однако сам по себе метод перфорирования имеет ряд достоинств, в частности, наличие только одного анализируемого вещества и сдвиг его пика на хроматограмме в область больших времен удерживания, чем достигается минимизация наложений.
Целью настоящей работы является изучение реакции перхлорирования (т.е. исчерпывающего хлорирования) ароматических соединений, в частности, ПХБ, ПХДД, ПХДФ и создание на ее основе методики экспресс-анализа различных природных объектов на содержание ПХБ с применением доступного метода ГХ-ЭЗД.
Для достижения поставленной цели необходимо:
Найти эффективный хлорирующий реагент, позволяющий осуществлять перхлорирование вплоть до нанограммовых количеств ПХБ, ПХДД и ПХДФ;
Оптимизировать условия проведения реакции, изучить влияние катализаторов; > Подобрать надежный внутренний стандарт для обеспечения надежности проводимых измерений; > Отработать методические аспекты пробоподготовки при проведении анализа объектов окружающей среды и биологических материалов;
У Изучить влияние мешающих факторов при определении ПХБ в объектах окружающей среды; У Создать методику суммарного определения ПХБ в воде; У Оценить метрологические характеристики методики.
Научная новизна работы.
Предложен новый хлорирующий агент позволяющий проводить реакцию перхлорирования ПХБ и других загрязнителей, таких как ПХДД, ПХДФ, в широком диапазоне концентраций, с высоким выходом целевых соединений, за небольшое время (35 минут) в относительно мягких температурных условиях (105С);
Изучено поведение в условиях реакции перхлорирования ряда фторированных и бромированных соединений на основе бифенила для оценки возможности использования их в качестве внутренних стандартов;
Показана принципиальная возможность определения микроколичеств ПХДД, ПХДФ и ПХБ методом перхлорирования и ГХ-ЭЗД;
Показана возможность создания методики определения суммарного содержания ПХБ в воде, почвах, биологических объектах методом перхлорирования и ГХ-ЭЗД.
Практическая ценность работы.
Предложен новый реагент и найдены оптимальные условия проведения реакции перхлорирования ароматических соединений, включая ПХДД, ПХДФ, ПХБ, открывающий новые возможности для их анализа.
Отработана система пробоподготовки и очистки продуктов перхлорирования перед ГХ-ЭЗД анализом.
Предложен внутренний стандарт, позволяющий контролировать все стадии проведения анализа, включая перхлорирование.
Разработана и аттестована скрининговая методика определения ПХБ в воде методом перхлорирования.
На зашиту выносятся:
Данные о поведении ПХДД/Ф, ПХБ и ряда фторированных и бронированных соединений на основе бифенила при перхлорировании различными хлорирующими системами;
Новый хлорирующий агент для проведения реакции перхлорирования;
Принципиальная возможность применения метода перхлорирования для определения суммарного содержания ПХБ и других экотоксикантов в пробах поверхностных и сточных вод, почвы и биологических объектах.
Методика суммарного определения полихлорированных бифенилов в воде методом перхлорирования и ГХ-ЭЗД.
Апробация работы.
Основные материалы диссертации представлены на международных конференциях: DIOXIN'97 (Индианаполис, США, 1997), «Конференция по новым технологиям и применениям современных физико-химических методов в исследованиях окружающей среды» (Ростов-на-Дону, 2001), DIOXIN'2002 (Барселона, Испания, 2002), "Диоксины и родственные соединения: экологические проблемы, методы контроля" (Уфа, 2000), Экоаналитика-2002 (Краснодар, 2002), "100 years of Chromatography" (Москва, 2003), «Аналитика и аналитики» (Воронеж, 2003), World ECOFORUM (Санкт-Петербург, 2003), Экоаналитика-2003 (Санкт-Петербург, 2003), «Хроматография и хроматографические приборы» (Москва, 2004); на международных семинарах Second International Workshop on PCBs (Brno, Czech Republic, 2002), INCA Green Chemistry International Workshop (Venice, Italy, 2002); в летней школе по зеленой химии (Венеция, Италия, 2002); материал диссертации докладывался на московском семинаре по анализу объектов окружающей среды 15 января 2004 года.
Публикация результатов работы.
Основное содержание диссертации изложено в 7 научных статьях, 12 тезисах докладов.
Объем и структура работы.
Диссертация состоит из шести основных разделов, изложенных на 158 страницах машинописного текста, содержит 18 таблиц и 33 рисунка. Библиография включает в себя 147 наименований.
Скрининговые методы определения ПХБ
Основная идея, на которой основан целый ряд быстрых методов определения ПХБ, - химическое превращение всех конгенеров, содержащихся в образце, в один единственный определяемый. В данном случае - в декахлорбифенил (ДХБ), который анализируется методом ГХ-ЭЗД, весьма чувствительным к определяемому веществу, что значительно упрощает анализ. Информации о том, какие конгенеры и в каком количестве содержатся в анализируемой пробе и их токсикологической опасности, мы не получим, но сможем обнаружить присутствие ПХБ и оценить их количество в образце.
В настоящее время в мире существует всего лишь один официально признанный метод анализа суммарного содержания ПХБ в питьевой воде -метод ЕРА №508а. Рабочий диапазон определения ДХБ от 0,5 мкг/л до 5,0 мкг/л анализируемой воды.
По этому методу перхлорирование очищенного экстракта воды проводят в герметичной пробирке, используя в качестве перхлорирующего агента пятихлористую сурьму в присутствии порошка железа. Реакционную смесь термостатируют в течение 30 минут при температуре 205С, затем охлаждают, разлагают концентрированной соляной кислотой и экстрагируют гексаном. Экстракт очищают, упаривают и аликвоту полученного раствора вводят в газовый хроматограф с ЭЗД, откалиброванный стандартными растворами ДХБ. Данный метод допускает завышение результатов определения ПХБ за счет присутствия либо примесей, по времени удерживания совпадающих с ДХБ, либо веществ, которые при перхлорировании также образуют ДХБ (бифенил, гидрированные бифенилы, полигалогенированные бифенилы и терфенилы) [74]. Несмотря на отсутствие в методике данных о степенях конверсии ПХБ в ДХБ, существует целый пласт литературы, предшествующей появлению этого метода, в котором исследовались эти вопросы при действии различных реагентов. Первые публикации, касающиеся применения реакции перхлорирования для определения СОЗов, появились в начале 70-х годов XX века. В большинстве опубликованных работ в качестве перхлорирующего агента применялась пятихлористая сурьма при температурах от 160 до 220С со временами реакции от 2-х до 16 часов [75-80]. Армор с коллегами [78] достигал выходов ДХБ от 30 до 70% для Арохлор-1242, используя метод Берга [75], сообщавшего о количественных выходах перхлорированного продукта. Существенным ограничением этой процедуры является то, что приемлемые выходы достигаются при перхлорировании образцов ПХБ со степенями хлорирования менее трех и для количеств субстрата от 1 мкг. Достаточно точным оказался метод с использованием реагента ВМС (смесь А1С13, S2C12 и S02Cl2 [81]), однако вычисленная степень перхлорирования колебалась между 60 и 70% [82].
Авторы [83] с помощью смеси пятихлористой сурьмы с железным порошком превращали Хлорофен-А-30 и Хлорофен-А-60 в ДХБ с выходами 93-95% (при термостатировании реакционной смеси при 205С в течение 10 минут).
Использование пятихлористой сурьмы при 290С (время реакции 35 минут) показало, что для смесей ПХБ Арохлор-1016, 1242, 1254 и 1268 выходы ДХБ составляют 92 ± 17% в диапазоне количеств исходных смесей от 50 до 6000 нг [84]. Авторы также сообщают, что применяли разработанный метод для анализа образцов воздуха и крови, однако результатов измерений не приводят.
Сравнение метода анализа, основанного на реакции перхлорирования, с методом ГХ-ЭЗД было проведено в работе [85] на образцах воды, воздуха и крови (пятихлористая сурьма, температура 160С, время реакции 15 часов). Выходы в тестовых экспериментах со смесями ПХБ Арохлор-1016 и 1254 составляли 93-113% в диапазоне концентраций вводимых в реакцию смесей от 100 нг до 10 мкг. При работе с реальными образцами показано, что результат, полученный с использованием реакции перхлорирования, завышает значение содержания исходной смеси ПХБ до 30% (образцы крови, воздуха и воды). В качестве метода сравнения применялся один из «быстрых» методов ГХ-ЭЗД, согласно которому определение суммы ПХБ проводилось по базовым пикам, предположительно содержавшихся в образцах смесей ПХБ Арохлор-1242 и 1254 (по 6 пиков от каждой смеси). Реальные же смеси ПХБ состоят из гораздо большего числа конгенеров.
В нашей стране также неоднократно принимались попытки создать скрининговый метод для анализа ПХБ (а также ПХДД и ПХДФ), основанный на реакции перхлорирования: фирмой "Экрос" (Санкт-Петербург), лабораторией аналитической экотоксикологии Института проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова РАН, военным объектом "Шиханы" (Саратовская область). Но до сих пор не удавалось успешно осуществлять перхлорирование ультрамалых количеств СЭТ.
В частности, фирма «Экрос» предлагает методику для анализа проб природных вод (морские, поверхностные воды суши, грунтовых вод, атмосферных осадков, талых вод) [86]. Согласно этой методике очищенный экстракт пробы вводят в реакцию с фирменным реагентом «Перхлор» (смесь хлорирующих реагентов и катализаторов ионного хлорирования) при 75С в течение 2-х часов. Затем реакционную смесь разлагают, экстрагируют гексаном, упаривают и анализируют методом ГХ-ЭЗД. Идентификацию проводят по совпадению времени выхода хроматографического пика исследуемого образца со временем выхода пика на хроматограмме стандартного образца. Количественный расчет содержания каждого из трех компонентов проводят методом внутренних стандартов, в качестве которых предлагается использовать дифтордихлордиоксин и дибромдихлордиоксин, вводимых в образец перед началом экстракции, и проходящих, соответственно, через все стадии пробоподготовки и реакции перфорирования. Диапазон определяемых концентраций в воде составляет для ПХБ (сумма) - от 0,03 до 250,0 нг/л, ПХДД (сумма) - от 0,05 до 500,0 нг/л, ПХДФ (сумма) - от 0,05 до 500,0 нг/л при объеме пробы 10 литров.
Препаративное перхлорирование диоксинов реагентом ВМС (общая методика 1)
К кипящему раствору 50 мг АІСЬ в 7-8 мл SO2CI2, помещенному в колбу, снабженную обратным холодильником и подогреваемую на масляной бане, из капельной воронки медленно (-20 мин) добавляли раствор субстрата в 2-3 мл S02Cl2 и 30 мкл S2CI2. Затем убирали холодильник и упаривали раствор примерно до половины, после чего продолжали кипятить с обратным холодильником в течение нескольких часов, время от времени добавляя свежий SO2O2 для поддержания постоянного объема.
По истечении необходимого времени упаривали SO2O2, добавляли 15% раствор поташа до прекращения выделения газов. Содержимое колбы переносили в плоскодонную колбу (сама колба многократно промывалась с озвучиванием в ультразвуковой бане), добавляли органический растворитель (бензол или СНгС12) и воду и дважды озвучивали в ультразвуковой бане по 5 минут. Органический слой отделяли от водного на делительной воронке и сушили над сульфатом натрия. Затем органический слой пропускали через колонку с высокоактивным силикагелем (колонка промывалась тройным объемом растворителя) и упаривали. Часть сухого остатка растворяли в толуоле и исследовали методом ХМС. а) проводили по общей методике 1. 100 мг дибензо-и-диоксина хлорировали реагентом ВМС в течение 5 часов. В процессе эксперимента происходило выпадение осадка. Далее реакционную смесь обрабатывали, как указано в методике № 1 за исключением процедуры очистки. Экстракт пропускали через колонку, заполненную послойно силикагелем, импрегнированным серной кислотой, сульфатом натрия, силикатом калия, после чего промывали хлористым метиленом объемом равным трем объемам колонки. Далее по общей методике 1. Получено 105 мг ОХДД. Выход 42%. Чистота полученного ОХДД составляла 92%. Данные ХМС-анализа: время удерживания - 29,219 мин., масс-спектр — М M/Z=456, (М+2)+ M/Z=458. Содержание производных дибензо-я-диоксина с меньшей степенью хлорирования (от 4 до 7) составило 8%. б) проводили по общей методике 1. 100 мг дибензо-и-диоксина хлорировали реагентом ВМС в течение 4-х часов. Реакционную смесь обрабатывали, как указано в методике 1 за исключением процедуры очистки. Экстракт пропускали через колонку, заполненную послойно силикагелем, импрегнированным серной кислотой, сульфатом натрия, силикатом калия и так несколько раз, после чего промывали хлористым метиленом объемом равным трем объемам колонки. Далее по методике 1. Получено 232 мг ОХДД. Выход 93%. Чистота полученного ОХДД составила более 99,5%. Данные ХМС-анализа: время удерживания - 29,50 мин., масс-спектр -ЛҐ M/Z=456, (М+2)+ M/Z=458. Эксперимент проводили по общей методике 1. 24,8 мг дибензофурана хлорировали реагентом ВМС в течение 3,5 часов. Получено 62 мг октахлордибензофурана (ОХДФ). Выход 93%. Чистота полученного ОХДФ составила более 99,9% . Данные ХМС-анализа: время удерживания - 24,38 мин., масс-спектр - М M/Z=440, (М+2)+ M/Z=442. В мерную колбу с длинным узким горлом объемом 25 мл с кипящим SO2G2 (около 2 мл) вносили -10 мг А1С13, а затем добавляли по каплям - 6 мкл S2CI2. Выпавшие из раствора игловидные кристаллы растворяли добавлением свежего S02C12 (3-5 мл). Полученный горячий раствор пипеткой переносили в ампулы с ДД. В ампулу объемом около 1 мл помещали 100 мкл раствора ДД в СН2СІ2 концентрацией 500 нг/мл (50 нг вещества), отгоняли растворитель в вакууме, затем продували аргоном, после чего добавляли раствор реагента ВМС объемом около 200 мкл. Ампулы запаивали и термостатировали. После истечения времени реакции ампулы охлаждали, вскрывали, добавляли в каждую ампулу 50 мкл раствора DCB 1 (внутренний стандарт, 50 нг), затем растворители отгоняли в вакууме, добавляли около 200 мкл 15% водного раствора поташа, дважды экстрагировали бензолом по 200 мкл. Органическую фракцию отбирали пипеткой, помещали в пробирку с коническим дном, упаривали в токе воздуха при 40-45С, добавляли от 10 до 30 мкл толуола и анализировали методом ГХ-ЭЗД. Обезжиренным гексаном надфилем (N.0 или N.1) стачивали кусок дюралюминиевого сплава (марки Д18) для получения опилок. Раствор субстрата в органическом растворителе (хлористый метилен, толуол, ацетон) помещали во флакон, снабженный завинчивающейся крышкой с тефлонированной прокладкой вместимостью 1,5 мл. Раствор упаривали при температуре около 40С в токе воздуха. Затем во флакон помещали 30 мг дюралюминиевых опилок, 3-4 мг порошкообразной серы и 300 мкл хлористого сульфурила SO2CI2. Флакон закрывали и помещали в термостат с температурой 70С. Термостатировали 4 часа при 70С, и охлаждали до комнатной температуры. Флакон с реакционной смесью открывали и раствор переносили во флакон с коническим дном так, чтобы весь катализатор остался в первом флаконе. Флакон с S02C12 переносили в вакуумный эксикатор, на дно которого помещали щелочь (NaOH или КОН); эксикатор присоединяли к водоструйному насосу и откачивали до полного испарения SO2CI2, флакон вынимали, прибавляли 200-300 мкл толуола, обмывая стенки сосуда; раствор упаривали до 5-Ю мкл в токе азота.
Подбор реагентов и условий проведения реакции перхлорирования ГГХБ
На рисунке хорошо видно изменение профиля хроматограмм с течением времени. На рис.12А представлена хроматограмма реакционной смеси через полчаса после начала реакции. На ней фактически наблюдается профиль исходной смеси ПХБ «Совол», основные пики которой элюируются в интервале времен удерживания от 17 до 25 минут. Через час после начала реакции наблюдалось уменьшение количества элюируемых пиков и преобладание пиков с большими временами удерживания (рис. 12В). Через полтора часа после начала реакции (рис.12С), на хроматограмме преобладает сигнал ДХБ (30.051 мин.). Через два часа происходит полное превращение «Совола» в ДХБ (рис.12D). Сигнал ДХБ не искажается за счет наложения сигналов других веществ. На хроматограмме также присутствуют пики инструментального внутреннего стандарта 2-фтор-3-бром-6,7,8,9-тетрахлордибензо-л-диоксина (26.101 мин.), вводившегося в экстракт реакционной смеси перед анализом, и продукта перфорирования внутреннего стандарта-имитатора 4,4 -дибромбифенила (32.89 мин.), вводившегося в реакцию вместе с «Соволом».
В исследованиях реакции перхлорирования диоксиноподобных токсикантов наблюдалась сильная зависимость выхода перхлорированных соединений от количества вводимого в реакцию субстрата: выход значительно снижался при введении в реакцию следовых количеств субстрата. Поэтому необходимо было изучить эффективность перхлорирования разных количеств «Совола».
Реакцию проводили в следующих условиях: 30-40 мг дюралюминиевых опилок, 8-9 мг порошкообразной серы, 300 мкл хлористого сульфурила, \05С, продолжительность реакции 2 часа. ПХБ вводили в количествах от 16 нг до 160 мкг. При этом выход ДХБ составлял 91-97% (табл. 11). Этот результат стабильно воспроизводился от опыта к опыту вне зависимости от количества «Совола».
Поскольку перхлорирование «Совола», содержащего ПХБ с различной степенью хлорирования и положением атома хлора в молекуле, происходит почти количественно, то эффективность реакции в данных условиях не зависит от этих факторов. Дня подтверждения этого была определена эффективность перхлорирования незамещенного бифенила, которая составила 90%.
Практическая сторона любой методики анализа включает в себя стадии концентрирования определяемых веществ (упаривания растворителей), на которых возможны их потери, а также потери вводимых внутренних стандартов. Для предотвращения потерь анализируемых веществ и внутренних стандартов на стадии упаривания применяют так называемые растворители-киперы или просто киперы. Они представляют собой высококипящие нелетучие растворители.
Так, например, в иммуноферментном методе ЕРА USA № 4025 для определения диоксинов в качестве такого растворителя используют Triton Х-100 в смеси метанол/тетраэтиленгликоль (TEG) 80/20. Методики определения ГГХДД/Ф обычно предусматривают использование в качестве кипера высококипящих н-алканов, например, три- или тетрадекана [134-137].
В предварительных экспериментах при использовании в качестве внутреннего стандарта 4,4 -дифторбифенила (4,4 -ДФБ) наблюдалась его полная потеря, которую мы связали с его большей летучестью по сравнению с «Соволом».
Для изучения возможности предотвращения потерь «Совола» и внутренних стандартов мы провели ряд экспериментов с высококипящими растворителями разной природы: тридеканом, диметилсульфоксидом, диметил формамидом.
При введении тридекана в реакционную смесь в количестве 10 мкл происходила дестабилизация хода реакции. При этом время реакции, необходимое для завершения перхлорирования колебалось от 1,5 до 8 часов, а на хроматограммах продуктов перхлорирования наблюдался значительный фон, который часто не позволял идентифицировать сигналы ДХБ и 4,4 -дифтороктахлорбифенила (4,4 -ДФОХБ) (рис.13).
При введении в реакцию перхлорирования ДМСО в количестве 10 мкл также происходила потеря внутреннего стандарта, хотя хроматографический фон не повышался.
Введение в реакционную смесь 10 мкл ДМФА иногда приводило к потере внутреннего стандарта. Однако при этом наблюдалось значительное сокращение времени реакции полного перхлорирования — с 2-х часов до 25 минут, что, по-видимому, обусловлено наличием каталитического эффекта.
Этот каталитический эффект по всей видимости связан с существованием таутомерной формы ДМФА [126] (рис. 14), а не с образованием и действием получающегося при взаимодействии ДМФА с хлористым сульфурилом нового хлорирующего агента. Эксперименты, проведенные по схеме: 4,4 -ДФБ (50 мкг) + ДМФА (10 мкл) + S02C12 (300 мкл), 105С - не показали образования каких-либо продуктов хлорирования ароматического субстрата.
Мы предположили, что каталитический эффект связан прежде всего с наличием четвертичного атома азота в молекуле-таутомере ДМФА, поэтому провели ряд экспериментов с катализатором межфазного переноса AHquat-336, который представляет собой метил-трикаприламмоний хлорид (рисЛ 5). Это соединение, помимо четвертичного атома азота, содержит алифатические цепочки, которые должны хорошо «удерживать» компоненты анализируемой смеси, вводимой в реакцию перхлорирования и одновременно выступать как в роли катализатора, так и в роли кипера.
Определение суммарного количества пхб в объектах окружающей среды методом перхлорирования и ГХ-ЭЗД
Для проведения анализа ПХБ методами ХМС или ГЖХ необходима очистка экстракта пробы от мешающих компонентов. Для этого применяется многослойная колонка. Это известный и широко применяемый в практике прием пробоподготовки при выполнении анализов на ПХДД/Ф и ПХБ [134-137]. Многослойная колонка состоит из слоев силиката калия и силикагеля, импрегнированного серной кислотой, разделенных безводным сульфатом магния. При ее использовании необходимо удалить растворители, которые могут вступать в химические реакции при этих условиях (например, ацетон), а также воду. Данный метод основан на химическом разрушении и полимеризации примесей полициклических углеводородов, органических соединений, содержащих двойные и тройные связи и др., с последующей сорбцией продуктов на материале колонки.
При работе с экстрактами почв и донных осадков мы применяли многослойную колонку для очистки экстрактов от компонентов матрицы. Поскольку количество образца, подвергавшегося анализу, составляло 10-20 г, то применяли колонку, состоявшую из одного щелочного и одного кислого слоев (п. 2.6.6.1., стр. 76). В качестве элюирующего растворителя использовали смесь гексан/метиленхлорид (3:1) и гексан.
В процессе работы предпочтение было отдано гексану, потому что он позволяет избирательно элюировать с многослойной колонки малополярные ПХБ и фактически не элюирует полярные вещества (например, хлорированные фенолы) и продукты окисления различных ненасыщенных соединений. Дополнительное фракционирование ПХБ при очистке на многослойной колонке достигается при использовании в качестве нижнего слоя колонки активированного силикагеля. Его применение, по данным US ЕРА [145], позволяет при элюировании гексаном отделить ПХБ от фенолов и пестицидов (ДДТ, ДДЕ, диэлдрин, эндрин, эндосульфан, токсафен и др.). Для ускорения элюирования с колонок мы применяли небольшое избыточное давление, поддавливая шприцем так, чтобы скорость прохода растворителя через колонку не превышала 2 мл/мин. Для очистки экстрактов куриного мяса от жира нами была применена колонка с крупно дисперсным носителем порокварцем (размер частиц 300-500 мкм), импрегнированным серной кислотой. Традиционный способ разрушения липидной части биопроб состоит в многократной обработке их гексановых экстрактов концентрированной серной кислотой путем встряхивания в делительной воронке (п. 2.6.6.6.1., стр. 78). Этот способ имеет ряд недостатков. Во-первых, необходимость крайне осторожного обращения с концентрированной серной кислотой во избежание ее попадания на кожу, одежду, в глаза. Во-вторых, при встряхивании возможно образование устойчивых эмульсий, расслаивание которых, может протекать часами, а иногда и сутками.
В то же время применение колонки с порокварцем, ипрегнированным серной кислотой, позволило сократить время обработки экстракта до 15-20 минут. При этом повышается эффективность удаления жировой части. Так, после использования традиционного способа при дальнейшей подготовке экстракта требовалась его очистка на двух многослойных колонках (последовательно). При применении колонки с порокварцем, ипрегнированным серной кислотой, достаточно было только одной.
Для выделения продуктов перфорирования из реакционной смеси после упаривания хлористого сульфурила мы использовали два способа. Первый - это экстрагирование гексаном на ультразвуковой бане. Это быстро и эффективно; упрощает последующую очистку полученного экстракта реакционной смеси. Второй способ состоял в том, что сухой остаток реакционной смеси разлагали концентрированной соляной кислотой с последующей экстракцией гексаном.
После экстракции по первому способу применяется очистка на короткой многослойной колонке (п. 2.6.6.3., стр. 77). После экстракции вторым способом целесообразно для поглощения соляной кислоты в качестве верхнего слоя применять питьевую соду.
Для снижения общей интенсивности сигнала ЭЗД, создаваемого различными низкомолекулярными хлорсодержащими компонентами реакционной смеси, требуется дальнейшая очистка продуктов реакционной смеси. Для решения этой проблемы мы применяли два метода US ЕРА: очистка на флорисиле и очистка на окиси алюминия [138,146]. Применение обеих методик позволило значительно снизить общий уровень сигнала ЭЗД.
Практически применение очистки на флорисиле сложнее (п. 2.6.6.5., стр. 78), потому что необходимо применять смеси растворителей в определенной последовательности (сначала элюирование гексаном, затем смесью гексан/ацетон 9:1). Растворителей требуется больше по сравнению с очисткой на окиси алюминия. Кроме того, большое неудобство этой процедуры состоит в том, что перфорированный внутренний стандарт и ДХБ элюируются разными растворителями, в разных фракциях.
Гораздо более удобна и менее ресурсо- и трудозатратратна очистка на окиси алюминия (п. 2.6.6.4., стр. 78). Для этой процедуры используется исключительно гексан. В отличие от очистки на флорисиле в данном случае не происходит фракционирования перхлорированного внутреннего стандарта и ДХБ: они элюируются в одной фракции. При этом значительно уменьшается общий уровень сигнала ЭЗД (рис.26). Простота и удобство работы с окисью алюминия дало возможность миниатюризировать колонку до пипетки Пастера, снизить расход гексана до 3 мл. Для ускорения этой процедуры можно использовать специальные штативы с вакуумным подсосом, или применять поддавливание посредством шприца. Элюат при этом собирается непосредственно в пробирку с коническим дном. При необходимости он может быть упарен в токе воздуха до нужного объема для последующего ГХ-ЭЗД анализа. Поэтому в дальнейшем на последней стадии мы применяли очистку на мини-колонке с окисью алюминия.
