Введение к работе
Актуальность проблемы. Полисахариды растений известны своими ценными техническими свойствами и физиологической активностью:
иммуномодулнрующей, противоязвенной, антитоксической, противоопухолевой и т.д. (Wagner et al., 1988; Roesler et al., 1991; SteinmuIJer el al., 1993; Оводов, 1998). В этом отношении значительный интерес представляют пектины, один из наиболее сложных классов этих биополимеров. В настоящее время, как в нашей стране, так и за рубежом проводятся интенсивные исследования (Witezak and Nieforth, 1997) по использованию растительных биополимеров в дизайне лекарственных препаратов. Это, прежде всего, связано со способностью полисахаридов повышать биоусвояемость лекарственных препаратов и пролонгировать их действие. Такие свойства известны для многих видов биополимеров - декстринов, альгинатов и др., в том числе растительных пектиновых веществ. Многие полисахариды сами обладают широким спектром биологической активности н используются в лечебно-профилактических целях при лечении диабета, ишемии сердца, желудочно-кишечных заболеваний и т.д. (Оводов, 1998; Комиссарекко и Спиридонов, 1998). Несмотря на то, что пектиновые вещества изучаются в течение длительного времени, проблема создания сырьевой базы для получения полисахаридов с заданными свойствами и определенной структурой сохраняет свою актуальность. При этом важными путями решения згой проблемы являются использование новых источников растительного сырья, создание биотехнологических методов промышленного получения полисахаридов с использованием культуры клеток растений.
Одно из главных преимуществ культуры клеток перед традиционным сырьем - это гомогенность системы, состоящей в основном из клеток с первичными клеточными стенками. Применение культуры клеток как модельной системы для изучения строения и различных аспектов метаболизма полисахаридов подразумевает получение штамма-продуцента, оптимизацию роста штамма и биосинтеза полисахаридов.
Растительная клеточная стенка - динамичная еложнеорганизованная система, состав которой может изменяться во время роста и дифференциации клеток (Stolle-Smits et al„ 1999; Geshi et al„ 2000; Kakegawa et al., 2000), а также под влиянием внешних факторов, таких как фитогормоны, источники углерода и азота (Masuda, 1990; Kobayashi et а!„ 1999; Konno ct al., 1999). Однако возможности физиологической регуляции процессов роста и биосинтеза полисахаридов в культурах клеток изучены недостаточно. Литературные данные о действии различных факторов на количественный и качественный состав полисахаридов малочисленны. Активная метаболизаиия пектиновых полимеров в экстремальных (которые создаются при получении каллусных культур) и естественных условиях развития растений и обнаружение биологически активных фракций полисахаридов дают основания предполагать, что в зависимости от у ел овйй"псшу^енйя7їг^ьіращиван ия каллусных культур могут НАУЧІ-Ь'.Я б'.лСЛ-.-'ЮТЕКА Моск. саль;.'>.*-і академии им. К, /*л їимй>їрї%
быть получены фракции пектинов, отличающиеся по своим свойствам от фракций из нативных растений. В то же время практически не проводилось сравнительное исследование полисахаридов различных органов интактного растения и клеточных культур, полученных из этих органов, а также полисахаридов, продуцируемых различными клеточными линиями растения.
Настоящая работа выполнена с использованием каллусиой культуры смолевки обыкновенной (Silerte vulgaris (Moench) Garcke), сем. гвоздичные (Caryophyllaceae) - лекарственного растения, применяемого в народной медицине. Пектиновый полисахарид этого растения, названный силенаном (Оводова и др., 2000), обладает иммуномодулиругощей активностью: усиливает поглотительную способность и миелопероксидазную активность фагоцитов периферической крови человека и макрофагов брюшной полости крыс (Popov etal., 1999).
Цель и задачи исследования. Цель работы заключалась в сравнительном изучении полисахаридов каллуса и интактного растения, а также в исследовании влияния различных факторов на биосинтез полисахаридов каллусиой культурой смолевки обыкновенной.
Для достижения цели исследования были поставлены следующие задачи:
-
получение линий каллусных культур смолевки обыкновенной из различных типов эксплантов интактных растений и растений, культивируемых in vitro;
-
изучение влияния различных факторов на каллусогенез и на рост полученных каллусных культур;
-
определение качественного и количественного состава полисахаридов в интактных растениях смолевки обыкновенной;
-
определение качественного и количественного состава полисахаридов в кадлусной культуре смолевки обыкновенной и био синтетической активности различных линий;
-
изучение динамики роста каллусиой культуры смолевки обыкновенной и биосинтеза полисахаридов (арабиногалактана и пектина) в цикле выращивания каллуса;
-
изучение влияния гормональных и трофических факторов культивирования на рост каллусиой культуры смолевки обыкновенной и на биосинтез
полисахаридов.
Научная новизна. Впервые получены каллусные культуры смолевки обыкновенной, высокопродуктивные по биомассе и но биосинтезу полисахаридов. Создана коллекция каллусных культур этого растения. Показана принципиальная возможность замены интактного растения каллусиой культурой для биотехнологического производства продуцируемых растением полисахаридов.
Оптимизированы и запатентованы питательные среды для получения и культивирования каллусной культуры смолевки обыкновенной. Разработан и запатентован способ получения пектиновых полисахаридов из биомассы культивируемых тканей растений.
Впервые изучен качественный и количественный состав полисахаридов каллусной культуры смолевки обыкновенной в сравнении с ннтактным растением, и выявлена различная бносинтетическая активность разных каллу сных линий.
Установлено, что в кадлусных культурах смолевки, наряду с силенаном (SV), пектином, характерным для интактных растений, синтезируется кислый арабиногалактан (AG). Каллус по содержанию продуцируемых полисахаридов сравним с ннтактным и растениями или заметно превосходит их.
Изучены качественные и количественные изменения полисахаридов в течение ростового цикла культуры смолевки. Биосинтез галактурона нового (или рамногалактуронаноаого) шра силенана происходит во время лаг-фазы, в начале экспоненциальной и в течение стационарной фазы роста культуры. Оптимальный биосинтез полисахаридов приходится на экспоненциальную фазу роста клеток. В середине экспоненциальной фазы образуется силеиан, содержащий главную линейную углеводную цепь и разветвленные участки макромолекулы.
Выявлена возможность физиологической регуляции процессов роста и биосинтеза полисахаридов в культуре клеток смолевки обыкновенной путем изменения содержания во внешней среде ауксина, сахарозы, кальция, азота или фосфата.
Впервые найдено, что полисахариды каллусной культуры смолевки являются биологически активными в отношении регуляции вторичного метаболизма растений. Установлен, в частности, стимулирующий эффект этих полисахаридов на накопление алкалоидов в клеточной культуре раувольфии змеиной.
Научно-практическая значимость. Полученные сведения о составе, содержании и закономерностях биосинтеза силенана и араби ногалактан а в каллусной культуре смолевки обыкновенной необходимы для практического использования культуры клеток. Каллусная культура смолевки может стать модельной системой для более углубленного исследования биосинтеза и метаболизма полисахаридов, в частности, силенана, в растении, для выяснения механизмов регуляции этих процессов.
Разработан способ получения образцов силенана с помощью культур тканей растений. Ряд каллусных линий смолевки обыкновенной с высоким уровнем биосинтеза полисахаридов SV и AG представляется перспективным альтернативным источником для получения физиологически активных патисахаридовбез^ербаприроднымпопуляшчям. Крометого, каллус смолевки является удобным объектом для исследования взаимосвязи структуры и физиологической активности полисахаридов данного растения.
Полисахариды каллусной культуры смолевки могут использоваться в качестве регуляторов вторичного метаболизма растений, в частности, процесса синтеза каллусной культурой раувольфии змеиной ценных алкалоидов, широко используемых в качестве лекарственных препаратов.
Каллусные линии с высоким содержанием полисахаридов; силенана5У и араби но гал акт ана AG, — можно рассматривать как перспективный исходный материал для получения суспензионных культур и создания на их основе линий-продуцентов пенных соединений для медицины, косметики, для пищевой и других областей промышленности и для сельского хозяйства.
Основные положения, выносимые на зашиту:
-
В качественном составе полисахаридов в недифференцированных культурах клеток относительно интактного растения имеются изменения, что позволяет расширить спектр синтезируемых полисахаридов.
-
Каллусные культуры смолевки продуцируют равное или значительно большее количество полисахаридов по сравнению с интактным растением.
-
Качественный и количественный состав полисахаридов в каллусной культуре смолевки обыкновенной изменяется в цикле вырашивания.
-
Условия культивирования каллусной культуры влияют на содержание и на моносахаридный состав полисахаридов, что дает возможность регуляции роста клеточных культур и биосинтеза ими полисахаридов.
-
Клеточные культуры смолевки обыкновенной эффективно продуцируют полисахариды (пектин и арабиногалактан) и могут в перспективе использоваться вместо интактного растения в биотехнологическим производстве полисахаридов данного растения.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Международном симпозиуме по глнкобиологии (Брауншвайг, Германия, 1998); Международном совещании *'Фнзиолого-биохимические аспекты изучений лекарственных растений" (Новосибирск, 1998); XIV Менделеевском съезде по общей и прикладной химии "Химия живого" (Москва, 1998); Ш Всероссийском совещании "Лесохимия и органический синтез" (Сыктывкар, 1998); Всероссийской электронной научной конференции "Биотехнология XXI века" (Ставрополь, 1999); Международном конгрессе по биотехнологии (Берлин, Германия, 2000); Всероссийской конференции "Химия и технология растительных веществ" (Сыктывкар, 2000); Третьей Международной выставке-ярмарке "Инновации-2000. Новые материалы и химические продукты" (Москва, 200О); П-м Европейском симпозиуме по углеводам (Лиссабон, Португалия, 2001); 1-й Российской научно-практической конференции "Актуальные проблемы инновацийс нетрадиционными растительными ресурсами и создания функциональных продуктов" (Москва, 2001); итоговом Ученом совете Института физиологии Коми НЦ УрО РАН (Сыктывкар, 2002); II Всероссийской конференции "Химия и технология растительных веществ" (Казань, 2002).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 19 работ, получено 3 патента Российской Федерации.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, четырех глав (обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты исследований, обсуждение результатов), выводов и списка литературы, включающего 2)2 источников, из них 174 зарубежных. Работа изложена на 163 машинописных страницах, содержит 27 таблиц и 18 рисунков.
