Содержание к диссертации
Введение
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Вирусные респираторные инфекции крупного рогатого скота 11
1.1.1. Распространение инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота 11
1.1.2. Распространение вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота 15
1.2. Терапия вирусных болезней 21
1.2.1. Роль интерферона в терапии вирусных болезней 27
1.2.2. Фармакологическое действие бетулина 31
1.3. Моделирование инфекционного процесса при вирусных инфекциях в культуре клеток эндотелия кровеносных сосудов 36
1.3.1. Функции эндотелия кровеносных сосудов 36
1.3.2. Клеточные медиаторы, продуцируемые эндотелием 39
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 44
2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.2.1. Влияние бетулина на экспериментальную инфекцию, вызванную вирусом инфекционного ринотрахеита у телят 52
2.2.2. Действие бетулина на спонтанную смешанную инфекцию, вызванную вирусом инфекционного ринотрахеита и вирусной диареи-болезни слизистых оболочек у крупного рогатого скота 57
2.2.2.1. Профилактическое действие бетулина 57
2.2.2.2. Действие бетулина на телят с признаками респираторной болезни 59
2.2.2.3. Действие бетулина при хронической респираторной болезни телят 61
4. Влияние бетулина на вакцинацию крупного рогатого скота живой вакциной против инфекционного ринотрахеита, вирусной диареи-болезни слизистых оболочек и парагриппа-3 62
Функционирование системы интерферона у крупного рогатого скота разного возраста при экспериментальной и спонтанной респираторной инфекции 63
1. Функционирование системы интерферона у крупного рогатого скота при экспериментальной инфекции; вызванной вирусом инфекционного ринотрахеита 64
2. Функционирование системы интерферона у крупного рогатого скота при спонтанной смешанной инфекции, вызванной вирусами инфекционного ринотрахеита и вирусной диареи-болезни слизистых оболочек 70
Противовирусное действие бетулина. 72
Моделирование инфекционного процесса, вызванного вирусами крупного рогатого скота, в культуре клеток эндотелия кровеносных сосудов 74
1. Отработка условий культивирования клеток эндотелия кровеносных сосудов крупного рогатого скота 75
2. Репродукция респираторных вирусов крупного рогатого скота в культуре клеток эндотелия кровеносных сосудов
крупного рогатого скота и человека 80
3. Индукция интерферона в культуре клеток эндотелия кровеносных сосудов вирусами инфекционного ринотрахеита, вирусной диареи-болезни слизистых оболочек и парагриппа-3 84
4. Продуция цитокинов в культуре клеток эндотелия кровеносных сосудов человека при инфировании вирусами инфекционного ринотрахеита, вирусной диареи-болезни слизистых оболочек и пар-гриппа-3 89
4 Способность бетулина индуцировть интерферон и цитокины в культуре клеток эндотелия кровеносных сосудов 94
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 99
ВЫВОДЫ 106
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 108
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 109
ПРИЛОЖЕНИЯ 126
- Распространение инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота
- Распространение вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота
- Влияние бетулина на экспериментальную инфекцию, вызванную вирусом инфекционного ринотрахеита у телят
Введение к работе
Актуальность темы. Разнообразие этиологии респираторных болезней крупного рогатого скота (КРС) являлось предметом многочисленных научных исследований. В то же время, как показал более чем пятидесятилетний опыт изучения этой проблемы, доминирующую роль в возникновении вспышек острых респираторных заболеваний в большинстве стран мира играют вирусы инфекционного ринотрахеита/пустулезного вульвоваги-нита (ИРТ/ИПВ) и вирусной диареи-болезни слизистых оболочек (ВД-БС) крупного рогатого скота.
Основным методом борьбы с этими инфекциями является вакцинация, эффективность которой зависит как от качества применяемых вакцин, схемы иммунизации, так и от состояния иммунной системы вакцинируемых животных. При заболеваниях ИРТ и ВД-БС применяются большое число вакцин. Сообщений об искоренении ИРТ и ВД-БС только за счет вакцинации в доступной литературе нет. Однако имеется информация о том, что обязательная иммунизация против ИРТ в сочетании с удалением серопозитивных животных в течение нескольких лет в ряде стран, например, в Нидерландах, привела к существенному улучшению эпизоотической ситуации. Вакцинация в большинстве стран не является обязательной. Кроме того, она проходит не всегда и не везде своевременно, и всегда остается поголовье восприимчивых животных. Возникает вопрос о том, какие меры принимать в условиях неблагополучного очага? Проблема с уже возникшим заболеванием актуализирует исследования, направленные на поиск альтернативных методов борьбы с данными болезнями.
Лечение животных, пораженных респираторными вирусами, включает применение иммунной терапии, симптоматических средств, иммуномо-дуляторов и антибактериальных препаратов для профилактики вторичных инфекций.
Количество противовирусных препаратов и лекарств, способствующих купированию вирусных инфекций в организме животных, крайне ог-
7 раничено. Поэтому поиски препаратов различного происхождения, обладающих подобным действием, неизменно остаются актуальными.
Вариантом борьбы с вирусными болезнями может быть использование иммуномодуляторов, основное действие которых заключается в активации факторов защиты при их гипореактивности и нормализации при гиперактивности, что помогает бороться с уже развившимся заболеванием. При вирусном инфицировании происходит активация врожденного неспецифического иммунитета, проявляющегося в продукции факторов неспецифической защиты — интерферона и цитокинов. От баланса между активностью инфицирующего агента и активностью противовирусных механизмов защиты зависит возникновение заболевания, его течение и исход.
Перспективным направлением представляется подбор препаратов как этиотропного, так и иммунотропного действия.
Наше внимание привлек препарат бетулин, выделенный из бересты и представляющий собой смесь тритерпеновых соединений, главным компонентом которого является пентациклический тритерпеновый спирт бетулин. При доклинических и клинических испытаниях бетулин проявил самые разнообразные свойства: антисептическое, бактериостатическое и бактерицидное против кишечных бактерий Escherichia coli, Salmonella typhi, Shigella flexneri и Staphylococus aureus, гепатопротекторную активность, антигипоксическое, антимутагенное, превентивное в отношении туберкулеза действия. Его противовирусная и интерферониндуцирующая активность выявлена при гриппе и гепатите С на лабораторных животных (Дерябин П.Г., Исаева Е.И., Львов Д.К., Балакшин В.В., 2003).
Вышеизложенная информация послужила основой для проведения исследований, обобщенных в данной диссертации.
Цель и задачи. Целью исследований было изучение лечебно-профилактической эффективности бетулина при вирусных респираторных инфекциях КРС.
8 Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:
- изучить терапевтическую и профилактическую эффективность бетулина
у КРС разных возрастных групп;
оценить влияние бетулина на функционирование системы ИФН у инфицированных животных;
изучить вирулицидное действие бетулина;
разработать модель инфекционного процесса, вызванного респираторными вирусами, на основе культуры ЭК кровеносных сосудов;
исследовать способность культур ЭК продуцировать ИФН и цитокины при инфицировании респираторными вирусами и под воздействием бетулина.
Научная новизна. Выявлена терапевтическая и профилактическая эффективность бетулина при экспериментальной инфекции, вызванной вирусом ИРТ. Установлена терапевтическая и профилактическая эффективность бетулина при смешанной инфекции, вызванной вирусами ИРТ и ВД-БС.
Впервые показана способность бетулина индуцировать синтез ИФН в организме телят при экспериментальной инфекции и вакцинации против ИРТ.
Впервые установлено вирулицидное действие бетулина в отношении вирусов ИРТ и ПГ-3.
Разработаны оптимальные условия выделения и культивирования ЭК кровеносных сосудов КРС.
Разработаны модели инфекционного процесса, вызванного респираторными вирусами КРС на основе культур ЭК. Установлена обратная зависимость между способностью респираторных вирусов индуцировать ИФН и их репродукцией в культурах ЭК КРС и человека.
Впервые показана способность бетулина индуцировать в культуре ЭК провоспалительные цитокины.
Практическая значимость. Проведенные исследования позволяют рекомендовать бетулин для лечения и профилактики респираторных болезней, вызванных вирусами ИРТ и ВД-БС; получен патент: Ru №2278683 СІ, «Способ лечения респираторных заболеваний крупного рогатого скота» Г.Н.Величко, А.Ф.Шуляк, О.Н.Щегловитова, К.П.Юров, В.В.Балакшин, Г.А.Преснова, А.Н.Чистяков, 2004.
Культура эндотелия кровеносных сосудов КРС может служить моделью для изучения патогенеза вирусных болезней, оценки продукции ИФН и цитокинов при вирусных инфекциях и использовании лекаственных средств, для скрининга иммуномодуляторов.
Разработаны и утверждены Ученым Советом ВИЭВ «Методические рекомендации по культивированию эндотелиальных клеток кровеносных сосудов крупного рогатого скота» и «Методические рекомендации по применению бетулина при вирусных репираторных болезнях крупного рогатого скота», протокол № 10 от 21 октября 2008 г.
Апробация работы. Материалы работы доложены на Международной конференции «Актуальные проблемы обеспечения ветеринарного благополучия животноводства», г. Ялта, 2005 г.; представлены на международной выставке «Аптека-2004», (Бельгия) и международной фармацевтической выставке (Испания, 2006 г.). Основные положения, выводы и практические предложения, изложенные в диссертации, обсуждены и одобрены на межлабораторном научно-производственном совещании научных сотрудников ГНУ ВИЭВ им. Я.Р.Коваленко (Москва, 2008).
Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 6 научных работ, в том числе 2 в журналах, рекомендованных ВАК; получен патент на изобретение РФ; рассмотрены Ученым Советом ВИЭВ 2 методические рекомендации.
Структура и объем работы. Материалы диссертации изложены на 127 страницах компьютерного текста и состоят из следующих разделов: введение, обзор литературы, собственные исследования, выводы, практи-
10 ческие предложения, список литературы, приложения. Список литературы содержит 166 источников, из них 47 - отечественные, 119 - иностранные. Диссертация иллюстрирована 21 таблицами, 24 рисунками.
Распространение инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота
ИРТ представляет собой энзоотическую болезнь. Антитела к данному вирусу выявляли у невакцинированного скота во всех странах, где проводились обследования. Учитывая то, что присутствие антител свидетельствует о контакте с вирусом, можно сказать, что болезнь присутствует во всем мире и, особенно, в странах с развитым животноводством [Straub О.С, 2001]. Возбудитель ИРТ (BHV-1) часто вызывает массовые вспышки болезни, протекающие в респираторной и генетальной формах. ИРТ относится к списку В справочника МЭБ, который включает контагиозные болезни, имеющие социально-экономическое значение как внутри страны, так и для международной торговли животными и животноводческими продуктами.
По данным МЭБ эта инфекция выявлена в большинстве стран, за исключением Исландии, Австрии, Финляндии и Швеции. Швейцария считается свободной от этой инфекции с 2004 г. [Ackermann М., Engels М., 2005], а единичные случаи выявления ИРТ после этого периода связаны с импортированием латентно инфицированных животных и контаминиро-ванной BHV-1 спермы [Ackerman М., Engels М., 2006]. Болезнь не регистрировали в последние годы в Норвегии, Дании [OIE, 2000]. Выявление этой инфекции составляет 62 -65 % в Бельгии, 13 - 79 % в Венгрии, 62 -85 % в Италии, около 40 % в Нидерландах и 20 - 38 % в Польше [Tekes L., Markos В., Kecskemeti S., Mehesfalvi J. et al., 1999; Boelaert F., Biront P., Soumare B. et. al., 2000; Ackermann M., Engels M., 2005].
В естественных условиях к вирусу ИРТ восприимчив крупный рогатый скот всех пород и возрастов. Заболевание широко распространилось по территории нашей страны после массового завоза племенного скота в конце 60-х гг. прошлого века и в настоящее время регистрируется во многих субъектах Российской Федерации, а также странах СНГ и носит, как правило, энзоотический характер. Количество серопозитивных животных по данным различных авторов составляет от 20 до 90 % [Андреев Е.В., 1974; Коннов Н.М. и соавт., 1982; Кондрахина К.Н. и соавт., 1984; Гуненков В.В. и соавт., 1987; Сухарев О.И., 1988; Красочко П.А., 1991; Петрова О.Г., 1995; Закутский Н.И., 1998; Красочко П.А., 2000; Глотов А.Г. и соавт., 2002; Петрова О.Г., 2002; Юров К.П. и соавт., 2003]. Последние 10 лет заболевание регистрируется во многих регионах России и эпизоотическую ситуацию по этой инфекции можно охарактеризовать как напряженную.
Заболеваемость при ИРТ составляет от 6 до 100 %, в большинстве случаев - от 18 до 45 % . Летальность при этом варьирует в пределах 2-25 %; при поражении нервной системы, а также развитии осложнений у молодняка может достигать 50-100%.
Возбудитель ИРТ/ИПВ - (BHV 1) Bovine herpesvirus 1- относится к роду Varicellovirus подсем. alphaherpesvirinae ceM.Herpesviridae и является важным патогеном КРС [Ackermann & Engels, 2006]. Представлен одним антигенным типом. По рестрикционному профилю ДНК делится на 2 подтипа: BHV 1.1., BHV 1.2. (а/в) [Metzler A.E.et al., 1985]. Штаммы 3-го подтипа (BHV 1.3.) в 1995 году были выделены в отдельный вид - BHV- 5 -возбудитель менингоэнцефалита [Roizman B.et al., 1995]. Хотя четкая корреляция между подтипом вируса и вызываемой им клинической формой отсутствует [Морозов И.А.и соавт., 1991], по мнению некоторых исследователей изоляты подтипа BHV 1.1. чаще ассоциируются с респираторным, a BHV 1.2. - генитальным синдромом [Metzler A.E.et al., 1986].
Распространение вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота
ВД-БС имеет широкое распространение во всех странах мира с развитым животноводством [Schlafer et al., 1990; Deregt D. et al., 1995; Goens D., 2002; Lindberg A.L.E., 2002, 2003]. По данным МЭБ в Европе ВД-БС диагностирована во всех странах, за исключением Исландии.
Вируснейтрализующие антитела к возбудителю ВД-БС выявляются у 50-90 % обследованного поголовья [Baker T.S., 1995]. Сообщения о вспышках ВД-БС, выявлении инфицированных вирусом животных и выделении возбудителя поступали из различных регионов СССР и России [Жидков С.А., 1976; Красочко П.А., 1991; Жидков С.А.и соавт, 1995; Воронин Е.С. и соавт., 1999; Иванова И.П. и соавт, 2000; Петрова О.Г. и соавт., 2002; Шегидевич Э.А. и соавт., 2003; Юров К.П. и соавт., 2003; Шуль-пин М.И. и соавт., 2003].
Вирус ВД-БС влияет на все стадии производства животноводческой продукции [Houe Н., 1999]. Инфекция сопровождается снижением оплодо-творяемости коров, абортами на любой стадии стельности и врожденными уродствами приплода. Ранняя эмбриональная смертность может достигать 78,6 % [Virakul P., Fanning M.L., Joo H.S. et al., 1988], а молочная продуктивность коров уменьшаться на 10 % [Moerman A., Straver P.J., de Jong M.C. et al., 1993]. Снижение иммунитета при ВД-БС способствует возникновению у большого количества животных в неблагополучных стадах диареи и пневмонии.
В неблагополучных странах огромные экономические потери - 10 — 40 млн $ - связаны с абортами, мертворожденностью, гибелью, вынужденным убоем, персистентной инфицированностью потомства, снижением продуктивности, яловостью, прекращением племпродажи, дополнительными ветеринарными обработками (лечебными, профилактическими, диагностическими) [Duffel S.J., Sharp M.V., Bates D., 1986; Purdy C.W., Loan R.W., Popham T.W., 1987]. В большинстве стран с интенсивным мясным и молочным скотоводством от 1 до 2 % КРС персистентно инфицированны [Houe Н., 2005]. В США ежегодный ущерб, наносимый ВД-БС, составляет в среднем 200 $/корову [Houe Н., 1999].
Впервые ВД-БС, как самостоятельное заболевание, было установлено в США в 1946 г. при острых вспышках болезни крупного рогатого скота, характеризующейся диареей, эрозивными поражениями пищеварительного тракта, коротким, 3-10 дней, течением часто со смертельным исходом [Olafson P., McCulum A.D., Fox F.H., 1946].
К настоящему времени сформировалось представление о ВД-БС как инфекционной контагиозной болезни КРС, преимущественно молодых животных, характеризующейся эрозивно-язвенным воспалением слизистых оболочек пищеварительного тракта, ринитом, увеличением лимфоузлов, лихорадкой, общим угнетением, лейкопенией, постоянной или перемежающейся диареей у части животных, эрозивным и язвенным стоматитом, сопровождающимся обильным слюноотделением, появлением слизисто-гнойных выделений из носа. У коров возможны аборты, а также внутриутробная смертность плодов.
Влияние бетулина на экспериментальную инфекцию, вызванную вирусом инфекционного ринотрахеита у телят
По данным литературы, бетулин обладает самыми разнообразными свойствами: противовирусным действием при гриппе и гепатите на модели лабораторных животных, а также способностью индуцировать ИФН. Представлялось целесообразным испытать этот препарат в качестве противовирусного при экспериментальной инфекции телят, вызванной вирусом ИРТ.
Опыт проводили на клинически здоровых телятах на опытной базе ВИЭВ о. Лисий. Для опыта отобрали 6 серонегативных (по результатам РН) клинически здоровых животных в возрасте 2-3 мес, которые проходили 5-дневный период адаптации. После этого трем телятам ежедневно в течение 5-ти дней давали бетулин per os в дозе 4 мг/кг живой массы, а затем заражали интраназально вирулентным штаммом ТНЛ вируса ИРТ в дозе 2x6,5 ТЦДзо/мл. В последующие 5 дней животные опытной группы продолжали получать бетулин по указанной схеме. Параллельно инфицировали аналогичным способом трех контрольных животных, которые не получали бетулин.
За телятами проводили клинические наблюдения в течение месяца. От них брали пробы крови для определения уровня постинфекционного антителообразования, пробы носовых секретов для вирусологического исследования и выявления ДНК вируса ИРТ в ПЦР.
У всех телят на протяжении опыта измеряли температуру тела. Температурная реакция телят представлена на рисунке 1.
Температурную реакцию оценивали по бальной системе (рис.1). У всех 3-х телят опытной группы наблюдали подъем температуры до 39,4С на 2-е сут после инфицирования. Максимальных показателей температура достигала на 3 сут и составила 39,8С. Через 4 дня происходило понижение температуры, через 10 дней наблюдали второй пик повышения температуры, который доходил до 39,6С.
