Содержание к диссертации
Введение
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8
1.1. Особенности продукции ферментов первичного метаболизма культивируемыми клетками растений 8
1.2. Биотехнологические аспекты получения и использования рибонуклеаз 10
1.3. Физиологическая роль рибонуклеаз и участие в защитных реакциях растений 15
1.4. Классификация патогенобусловленных (PR) белков растений 21
1.5. Регуляция содержания PR белков в норме и условиях стресса 29
1.6. Рибонуклеазоподобные белки группы PR-10 33
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 36
2.1. МАТЕРИАЛЫ 36
2.2. МЕТОДЫ 37
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 42
3.1. Рибонуклеазная активность в культивируемых клетках растений 42
3.2. Стабильность продукции рибонуклеаз в штамме R-1. Ростовой цикл
и динамика накопления рибонуклеаз 44
3.3. Иммуноферментный анализ рибонуклеаз 46
3.4. Специфичность и кинетические параметры рибонуклеаз женьшеня. Первичная структура белков Pgl и Pg2 50
3.5. Механизмы индукции и возможные способы регуляции активности рибонуклеаз в культуре клеток женьшеня 56
3.5.1. Влияние стрессовых факторов на рибонуклеазную активность и ростовые характеристики клеточной культуры женьшеня 56
3.5.2. Влияние компонентов питательной среды на рибонуклеазную активность и ростовые характеристики клеточной культуры женьшеня 61
3.5.3. Регуляция активности рибонуклеаз веществами — индукторами защитных реакций растений 72
3.5.4. Влияние ингибиторов киназ и фосфатаз на активность и содержание рибонуклеаз в каллусах женьшеня 76
3.6. Роль рибонуклеаз в процессе ингибирования роста Agrobacterium tumefaciens при их культивировании с клетками женьшеня 77
3.7. Динамика активности и количества рибонуклеаз при совместном культивировании клеток женьшеня с Y. pseudotuberculosis 80
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 83
ВЫВОДЫ 92
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
- Особенности продукции ферментов первичного метаболизма культивируемыми клетками растений
- МАТЕРИАЛЫ
- Рибонуклеазная активность в культивируемых клетках растений
Введение к работе
Ферменты, катализирующие гидролиз нуклеиновых кислот, необходимы на многих стадиях биохимических превращений генетического материала. РНКазы играют важную роль в регуляции жизнедеятельности растительной клетки. Они вовлечены в деградацию РНК, рециркуляцию азотистых оснований и неорганического фосфата (Тарчевский, 1992; Raines, 1998).
Изучение вновь открываемых РНКаз чаще всего проводится с целью определения возможности их использования в биохимии, молекулярной биологии и биотехнологии. В клинической практике эти ферменты применяют для лечения вирусных, бактериальных и грибковых заболеваний, в терапии злокачественных новообразований (Wang and Ng, 2000). РНКазы растений ввиду их низкой токсичности для человека являются перспективным объектом для создания новых лекарственных препаратов. Трансгенные растения, экспресси-рующие РНКазы, отличаются повышенной устойчивостью к фитопатогенам (Sano et al., 1999).
В настоящее время достаточно полно исследованы панкреатические РНКазы человека, а также РНКазы бактерий, грибов и земноводных (Leland and Raines, 2001; Matozek, 2002). Физиологическая роль и пути регуляции рибонуклеаз растений изучены недостаточно (Green, 1994). Особенно в этом отношении перспективны культуры клеток, поскольку, по сравнению с целым растением, они обладают повышенной вариабельностью по многим физиолого-биохимическим признакам. Велика вероятность обнаружения в коллекциях растительных культур продуцентов ферментов с уникальной специфичностью и активностью, удовлетворяющих практическим потребностям современной биотехнологии. Культуры клеток являются технологичными источниками ферментов, т.к. они обладают высокой скоростью роста и могут осуществлять синтез биологически активных веществ в контролируемых условиях. Клетки женьшеня в этом отношении представляют интерес, поскольку штамм R1 адаптирован к применению в промышленных масштабах. Поэтому изучение РНКаз клеток женьшеня
5 является актуальным.
Культивируемые клетки женьшеня Panax ginseng, штамм R-l (ВСКК-ВР 38) обладают высокой стабильностью и скоростью роста, адаптированы к культивированию в промышленных масштабах (Булгаков и др., 1991). В качестве продуцента рибонуклеаз культура клеток женьшеня исследовалась впервые.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было изучение культивируемых клеток женьшеня как продуцента рибонуклеаз. Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
Изучить содержание рибонуклеаз в клеточной культуре женьшеня в процессе долговременного культивирования.
Установить степень корреляции между активностью и содержанием РНКаз в клетках женьшеня при различных условиях культивирования.
Изучить физико-химические характеристики и аминокислотные последовательности рибонуклеаз Pgl и Pg2.
Определить пути индукции рибонуклеаз и стабилизации продукционных характеристик культуры.
Исследовать влияние стрессовых факторов на продукцию РНКаз культивируемыми клетками женьшеня.
Определить характер изменений продукции рибонуклеаз при варьировании состава питательной среды для культивирования клеток.
Изучить влияние РНКаз на размножение фитопатогенных бактерий Agrobacterium tu-mefaciens при совместном культивировании с клетками женьшеня.
Положения, выносимые на защиту
Культивируемые клетки женьшеня являются перспективными источниками РНКаз.
Рибонуклеазы женьшеня относятся к патоген-обусловленным (PR) белкам группы PR-10.
Активность и количество PR-10 РНКаз в культуре клеток женьшеня повышается под воз- действием ключевых регуляторов защитных реакций растений - этилена и жасмоновой кислоты.
Наиболее вероятная физиологическая роль Pg-РНКаз состоит в защите растения от патогенов.
Культивируемые клетки женьшеня с индуцированной РНКазной активностью демонстрируют устойчивость к заражению фитопатогеном (A. tumefaciens).
Научная новизна. Впервые установлено, что культивируемые клетки женьшеня могут служить перспективным источником для получения РНКаз. Показана высокая продуктивность и стабильность синтеза РНКаз в культивируемых клетках в течение долговременного пассирования.
Установлено, что РНКазы культивируемых клеток женьшеня представлены двумя изо-формами - Pgl и Pg2. Установлена первичная структура рибонуклеаз, определена их специфичность и кинетические параметры. РНКазы расщепляют РНК по фосфодиэфирным связям, на З'-конце которых находятся гуанозин, аденин и уридин. На основании анализа аминокислотной последовательности Pg-РНКазы женьшеня отнесены к патоген-обусловленным белкам группы PR-10.
Впервые получены антитела к Pg-РНКазам женьшеня, модифицирована методика количественного определения Pg-РНКаз иммуноферментным анализом.
Впервые показано увеличение количества и специфической активности PR-10 РНКаз, индуцированное этиленом и жасмоновой, но не салициловой кислотой. Приведены доказательства участия киназ и фосфатаз в индукции этилена Pg-РНКаз.
Варьирование условий культивирования (освещение, температура, компоненты сред, фи-тогормоны) влияет на продукцию РНКаз. Подбор оптимальных условий культивирования, способствует увеличению продукции РНКаз клетками женьшеня.
Изучено взаимодействие культивируемых клеток женьшеня с патогенными микроорганизмами. Показано, что повышенная РНКазная активность препятствует заражению и гибели
7 растительных клеток. Определена возможная физиологическая роль Pg-РНКаз в защитной системе растительной клетки.
Практическая значимость. Впервые установлено, что культивируемые клетки растений могут служить источником получения рибонуклеаз. Показано, что штамм R-1 культуры клеток женьшеня является перспективным для биотехнологического использования. Модифицирована питательная среда для повышения продукции РНКаз, что позволяет более рационально использовать клеточную культуру в промышленных условиях.
Апробация работы. Результаты исследований были представлены на конференциях молодых ученых Биолого-почвенного института ДВО РАН (1997, 1998, 2000), на международных конференциях «Физиология растений - наука III тысячелетия» (Москва, 1999), «Сигнальные системы растительных клеток» (Москва, 2001), «Сознание и наука: взгляд в будущее» (Владивосток, 2001), на 8-й международной конференции по женьшеню (Сеул, Корея, 2002).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ.
Работа выполнена в лаборатории биотехнологии Биолого-почвенного института ДВО РАН. Иммуноферментный анализ выполнен совместно с сотрудниками лаборатории основ неинфекционного иммунитета Тихоокеанского института биоорганической химии ДВО РАН. Определение первичной аминокислотной последовательности проведено совместно с сотрудниками Л.И. Федореевой и Г.П. Моисеевым.
Особенности продукции ферментов первичного метаболизма культивируемыми клетками растений
В литературе опубликовано относительно мало сведений о культурах клеток растений -продуцентах ферментов. Некоторые ферменты растений, такие как карбогидразы, фосфата-зы, супероксиддисмутазы, хитиназы, гидролазы, пероксидазы и каталазы, важны для биотехнологического исследования, поскольку представляют интерес для сельского хозяйства, практической медицины и косметологии.
До недавнего времени хитиназы, глюканазы, пероксидазы, каталазы и другие важные растительные ферменты выделяли из дикорастущих либо культивируемых растений. Изучено большее количество гликозидаз, хитиназ и рибонуклеаз растений, протеолитические ферменты папайин, фицин из плодов фигового дерева, бромелаин ананаса, и актинидии плодов киви (Pastorello et al., 1988). Препараты пероксидазы выделяют из корней хрена. Биотехнологический способ получения веществ первичного метаболизма, однако, может быть альтернативой традиционному способу. С помощью методов культивирования тканей, клеток и органов растений создан ряд клеточных технологий, позволяющих получать вещества вторичного метаболизма, имеющие широкое применение в качестве лекарственных препаратов. Известно лишь несколько примеров относительно активной продукции культивируемыми клетками растений веществ первичного метаболизма. Рядом авторов предпринимались попытки выделения пероксидаз из культивируемых корней хрена (Yamada et al., 1987), табака (Shinshi et al., 1987) и редьки (Moreno et al., 1989), а также из культуральных сред после выращивания суспензий клеток картофеля, арахиса и вигны (Moreno et al., 1990). Сообщалось о получении каллусной культуры, а также культуры трансформированных корней хрена (Хадеева и др., 1993). В культивируемых in vitro корнях содержалось столько же фермента, сколько и в обычном корне - 180 мкг/г сырого веса, каллусные клетки хрена содержали пероксидазу в количестве 300 мкг/г сырого веса.
С помощью спонтанного и индуцированного мутагенеза и селективных систем Карано вой и соавт. были получены клеточные линии люцерны с повышенной активностью перок-сидазы. Лучшие клоны по содержанию пероксидазы в 2,3 раза превосходили исходные линии (Каранова и др., 1996).
Каллусная культура Rauwolfia serpentina Benth. продуцирует супероксиддисмутазу. Этот фермент является эффективным антиоксидантом и играет важную роль в лечении различных воспалительных процессов. Выход супероксиддисмутазы составил 180 мг/кг биомассы, что превышает в несколько раз количество фермента, получаемого из 1 л массы эритроцитов (50 мг), хотя и уступает по продуктивности биомассе рекомбинантного штамма дрожжей Saccharomyces cerevisiae Y 2134 (3,5 г/кг биомассы) (Дроздова, 1997). Метод выделения, предложенный Кирилловой и соавт. (2001), обеспечивает высокий выход фермента (до 80%).
Исследование ферментов первичного метаболизма в культурах растительных клеток проводятся не только с целью получения штаммов-продуцентов. Изучение основ регуляции и способов индукции этих веществ необходимо для определения их роли в процессах развития и защитных реакциях растительной клетки (табл. 1).
МАТЕРИАЛЫ
Культура ткани женьшеня. Корни женьшеня P. ginseng С.А. Меу. пятилетнего возраста получены из совхоза «Женьшень» (Ст. Варваровка, Приморский край). В работе использовали каллусные культуры P. ginseng, поддерживаемые в Коллекции клеточных культур БПИ ДВО РАН со времени получения их в 1988 году (Булгаков и др., 1991).
Клетки выращивали на агаризованной питательной среде W4cpa, содержащей микро-и макросоли по прописи Мурасиге и Скуга (Murashige and Skoog, 1962) с дополнительными компонентами (Bulgakov et al., 1998), либо в суспензионном варианте среды W4CPA- Среда содержит 0,4 мг/л 4-хлорофеноксиуксусной кислоты в качестве регулятора роста. Культуру инкубировали в темноте при 25 С, относительной влажности воздуха 70 % в течение 30 суток (Журавлев и др., 1991). Для выращивания на свету использовали фотопериод 16 ч- день, 8ч- ночь, с интенсивностью света 2500 лк.
Суспензионную культуру в колбах Эрленмейера объемом 250 мл, содержащих 50 мл среды W4CPA, выращивали в темноте, при температуре 25 С и относительной влажности воздуха 50-70 % (Bulgakov et al., 1998), на стационарном встряхивателе при скорости вращения качалки 80 об/мин и амплитуде 20-30 мм. Продолжительность выращивания суспензионных культур составляла 14 суток. Масса инокулюма составляла 90-100 мг для каллусов, 250-300 мг для суспензий.
Реактивы для приготовления сред, метиловый эфир жасмоновой кислоты, спермидин и этефон получены от фирмы "Sigma", ингибитор Н-7, салициловая кислота и препарат дрожжевой РНК- от ISN Pharmaceuticals. Целлюлоза DE-52 и сефадекс G-75 фирмы Pharmacia, Uppsala, Швеция.
Этефон и спермидин растворяли в дистиллированной воде и использовали сразу после приготовления. Метиловый эфир жасмоновой кислоты растворяли в ДМСО. Ингибитор Н-7 растворяли в небольшом количестве ДМСО (десятая часть общего количества раствора) и затем в дистиллированной воде. Салициловую кислоту добавляли в дистиллированную воду и доводили до рН 5,6 с помощью 5 %-ного раствора КОН. В контроле использовали эквивалентные количества растворителей. После фильтрации через мембранный фильтр (0,22 мкм) растворы испытуемых веществ вносили асептически в колбы с культурой клеток.
Экстракция рибонуклеаз. Каллусные клетки штамма R-1 гомогенизировали и экстрагировали РНКазы в 0,02 М трис-НО буфере рН 7, содержащем 0,9 % NaCl при 4С в течении 24 часов. Осадок центрифугировали, из супернатанта белковую фракцию осаждали сульфатом аммония (70 %) и диализовали.
Для дальнейшей очистки препарата использовали колоночную хроматографию. В качестве носителя использовали DEAE целлюлозу и сефадекс.
Хроматография па DEAE целлюлозе. Целлюлозу DE-52 уравновешивали 0,02 М трис-HCI буфером с 10 мМ NaCl. В этом же буфере наносили на колонку 10-кратно разведенную белковую фракцию экстракта клеток женьшеня, полученную после осаждения сульфатом аммония и диализа. Использовали колонку диаметром 16x250 мм. Элюцию проводили солевым градиентом 100-500 мМ NaCl в буфере трис-HCl со скоростью 30 мл/ч. Фракции собирали автоматически коллектором по 5 мл. РНКазная активность элюировалась при концентрации NaCl 250-320 мМ. Фракции с выраженной РНКазной активностью собирали и диали-зировали против 5 мМ трис-HCl буфера (рН 6,8) в течение 12 часов.
Выделение рибонуклеаз методом гель-хроматографии проводили на колонках с использованием сефадекса марки G-75. Для этого рибонуклеазы растворяли в десятикратном объеме воды, наносили на колонку с сефадексом, уравновешенную соответствующим буфером, и проводили элюцию. В собранных фракциях определяли оптическую плотность на СФ путем измерения поглощения ультрафиолета при 260 нм и 280 нм (рис. 9).
Материал, элюированный с колонки, разделялся на 2 фракции. В полученных фракциях измеряли рибонуклеазную активность. Фракции, содержащие рибонуклеазы, анализировали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. Пробы, содержащие рибонуклеазы, отбирали для дальнейшего разделения. Для подтверждения полноты очистки рибонуклеазной
фракции была проведена рехроматография суммы полученных проб на колонке с использованием DEAE целлюлозы. После концентрации на DEAE целлюлозе фракции, показавшие наибольшее поглощение ультрафиолета при измерении оптической плотности использовали для дальнейших исследований. На рис. 10 представлено распределение оптической плотности препаратов, полученных при рехроматографии на целлюлозе DE-52.
Определение рибонуклеазной активности. Рибонуклеазную активность определяли спектрофотометрическим методом по методу, описанному Абелем (Abel and Glund, 1986). В качестве субстрата использовали высокомолекулярную дрожжевую РНК фирмы ISN.
Для определения активности из экстракта клеток отбирали 50 pi, к ним добавляли 50 \xl буфера трис-НС1 (0,2 М, рН 6,2) и раствор РНК из дрожжей (2 мг в 1мл буфера трис-НС1 0,2 М рН 6,2). Реакционную смесь выдерживали при 37С в течение 15 мин. Останавливали реакцию холодным спиртовым раствором MgCl 0,5 М. Определение активности проводили на СФ-20 при длине волны 260 нм.
Удельную активность определяли как число единиц активности фермента, приходящихся на 1 мг белка в ферментативном препарате (Е/мг).
Для определения содержания белков Pgl и Pg2 в экстрактах каллусов женьшеня был использован метод твердофазного конкурентного иммуноферментного анализа.
Получение моноспецифических антисывороток к РНКазе женьшеня. Для получения специфических антисывороток проводили иммунизацию кроликов. В опыте использовали двух кроликов породы «Шиншилла». Для иммунизации брали РНКазу с удельной активностью 1200 ед/мг и 200 ед/мг. Фермент вводили в дозе 0,5 белка в 1 мл физраствора с равным объемом полного адъюванта Фрейнда. Каждому кролику делали 4 инъекции фермента через неделю (подкожно), через 40 дней после окончания иммунизации проводили реиммуниза-цию животных. Кролики были реиммунизированы трехкратно, с интервалом в 7 дней. Внутривенно вводили по 0,2 мл с увеличивающимися концентрациями белка (0,2, 0,5 и 1,0 мг/мл соответственно). Кровь собирали через 15 дней после последней иммунизации, сыворотку отделяли центрифугированием и хранили при температуре -4С.
Рибонуклеазная активность в культивируемых клетках растений
В ходе работы по поиску наиболее перспективных штаммов культивируемых растительных клеток, содержащих рибонуклеазы, было проанализировано 18 клеточных культур лекарственных растений, находящихся в коллекции лаборатории биотехнологии БПИ ДВО РАН. Рибонуклеазная активность обнаружена во всех исследованных культурах (табл. 5). Культура клеток Metaplexis japonica (Thunb.) Makino Семена Листья Стебли 174 113 95 Культура клеток Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino Цветки Корни 233 402 Высокая РНКазная активность была обнаружена в культивируемых клетках С. monniery, G. pentaphyllum и в некоторых каллусных культурах P. ginseng. Для исследования рибонуклеаз мы выбрали клеточную культуру женьшеня. Культура клеток P. ginseng, штамм R-1 (ВСКК-ВР 38) обладает высокой стабильностью и скоростью роста, адаптирована к культивированию в промышленных масштабах.
Растущая каллусная культура штамма R-1 представляет собой ткань рыхлой консистенции. Живые клетки в популяции в середине экспоненциальной фазы роста составляют 90-94 %. Ткань состоит на 86-94 % из клеток меристематического типа круглой и овальной формы размером в среднем 57x67 мкм, и из клеток паренхимного типа удлиненной формы размером в среднем 80-160 мкм. Кривая митотической активности имеет одновершинный характер с максимумом на 9-й день культивирования.
Суммарная белковая фракция из клеток R-1 была разделена в полиакриламидном геле и специфически окрашена для идентификации рибонуклеаз. При электрофоретическом разделении установлено, что большая составляющая РНКазной активности двигается на электро-фореграмме одним пятном и имеет молекулярную массу 16 кДа (рис. 3). Этой РНКазе было присвоено название Pg РНКаза. Позже оказалось, что Pg РНКаза представлена двумя изо-формами (Pgl и Pg2), очень близкими по массе.
По данным электрофореза в присутствии РНК около 90 % активности суммарной белковой фракции каллусных клеток женьшеня сосредоточено в полосе, соответствующей белкам Pgl и Pg2. Кроме этих белков, обладающих РНКазной активностью, в клетках женьшеня присутствует незначительное количество белков с низкой активностью молекулярной массой около 32 кДа.
Стабильность продукции рибонуклеаз в штамме R-1. Ростовой цикл культуры и динамика накопления рибонуклеаз
На рис. 4 и рис. 5 представлено изменение ростовых и продукционных характеристик каллусов за время 14-суточного периода культивирования в суспензионной среде и 35-суточного культивирования на агаровой среде соответственно. В течение пассажа наблюдали высокий уровень рибонуклеазной активности, с максимумом, приходящимся на конец лаг-фазы - начало экспоненциальной фазы роста культуры (7-е сутки для каллусов, 2-е сутки для суспензионной культуры). При «старении» каллусной культуры происходило снижение рибонуклеазной активности в культуре клеток. Рибонуклеазная активность обнаружена также в культуральной жидкости. Эти данные хорошо согласуются с имеющимися сведениями по активности других РНКаз в культурах растительных клеток (Sawai et al., 1978).
