Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 9
1.1. Углеводный обмен и его патология 10
1.2. Классификация ингибиторов ферментов углеводного обмена по происхождению 17
1.3. Продуценты ингибиторов а-глюкозидаз 22
1.4. Ингибитор а-глюкозидаз из актиномицетов группы актиноплан -акарбоза 27
1.5. Условия культивирования продуцентов ингибиторов а-глюкозидаз.. 31
1.6. Ингибитор а-глюкозидаз из Streptomyces sp. шт. 1328-Д 34
Глава II. Материалы и методы исследования 39
Глава III. Поиск продуцентов ингибиторов а-глюкозидаз среди актиномицетов 53
3.1. Выделение актиноплан из почвенных образцов селективными методами 53
3.2. Характеристика активного штамма 839 — продуцента ингибитора а-глюкозидаз 67
Глава IV. Посевной материал Streptomyces sp. и влияние его свойств на образование ингибитора а-глюкозидаз 76
4.1. Естественная изменчивость продуцента ингибитора а-глюкозидаз 76
4.2. Изучение условий выращивания посевного материала продуцента ингибитора а-глюкозидаз 85
4.2.1. Влияние источника углеродного питания в составе посевной среды на биосинтез ингибитора а-глюкозидаз 86
4.2.2. Оптимизация состава посевной питательной среды 87
4.2.3. Влияние возраста и количества посевного материала, передаваемого
t на стадию ферментации, на синтез ингибитора а-глюкозидаз 91
4.3. Стабилизация посевного материала продуцента ингибитораа-глюкозидаз 95
4.3.1. Влияние последовательных пересевов культуры Streptomyces sp. на ингибиторообразование 99
4.3.2. Изучение хранения посевного материала продуцента ингибитора
а-глюкозидаз при низких температурах 100
Глава V. Исследование условий биосинтеза ингибитора а-глюкозидаз 108
5.1. Влияние источников азотного питания на биосинтез ингибитора а-глюкозидаз 109
5.2. Влияние источников углеродного питания на биосинтез ингибитора а-глюкозидаз 112
5.3. Влияние минеральных компонентов на биосинтез ингибитора а-глюкозидаз 121
5.4. Изменение биохимических показателей культуральной жидкости в процессе развития продуцента ингибитора а-глюкозидаз 124
Выводы 137
Литература 139
Приложения 160
- Углеводный обмен и его патология
- Материалы и методы исследования
- Выделение актиноплан из почвенных образцов селективными методами
Введение к работе
Сахарный диабет стал одной из серьезнейших проблем нашего времени. По данным ВОЗ сахарным диабетом страдают около 120 млн. человек, а в 2025 году их число превысит 250 млн. человек. Основная задача при лечении инсулиннезависимого диабета - это нормализация углеводного обмена.
Углеводы поступают в организм человека в основном в виде крахмала и сахарозы. Под действием комплекса амилаз организма крахмал и сахароза гидролизуются до конечных продуктов - глюкозы и фруктозы. Нежелательные последствия потребления углеводов можно ослабить или избежать путем ограничения их потребления или путем замедления усвоения углеводов пищи при помощи ингибиторов а-глюкозидаз.
Ингибиторы а-глюкозидаз выделены из растительного сырья, а также могут быть получены путем химического синтеза. Однако особое внимание исследователей в качестве источников таких ингибиторов привлекают микроорганизмы. Обнаружены продуценты ингибиторов а-глюкозидаз среди бактерий, грибов, стрептомицетов, но чаще всего активные продуценты ингибиторов встречаются среди актиномицетов из группы актиноплан.
Эта группа актиномицетов еще недостаточно изучена в качестве «потенциальных» продуцентов различных БАВ в связи со сложностью их выделения из природных субстратов, замедленным циклом роста, особой требовательностью к условиям выращивания и крайней нестабильностью, хотя именно среди них обнаружен продуцент нового антидиабетического средства — ингибитор а-глюкозидаз акарбоза.
Проблема создания новых отечественных лекарственных препаратов на основе ингибиторов а-глюкозидаз, образуемых микроорганизмами, является актуальной. В связи с этим уделяется особое внимание разработке новых методических подходов для разностороннего изучения всех аспектов микробиологического синтеза веществ этого класса от селективного выделения микроорганизмов из почв до способа их культивирования и стабилизации биосинтетической активности, обратив особое внимание на актиномицеты из группы актиноплан.
Исследование выполнено в рамках Федеральной программы «Сахарный диабет» на 1997-2005 г.г.
Цель и задачи исследования.
Скрининг продуцентов ингибиторов а-глюкозидаз среди почвенных актиномицетов, особенно среди группы актиноплан, разработка способа стабилизации ингибиторной активности продуцента и условий его культивирования, способствующих максимальному синтезу целевого продукта.
В соответствии с целью исследования в работе были поставлены следующие задачи: выделить из почвенных образцов продуцент ингибитора а-глюкозидаз, используя селективные методы скрининга, характерные для актиномицетов группы актиноплан; провести первичную идентификацию выделенного актиномицета; изучить естественную изменчивость нового продуцента ингибитора а-глюкозидаз и отобрать активный штамм по признаку ингибиторообразования; стабилизировать ингибиторообразование у продуцента ингибитора а-глюкозидаз путем оптимизации условий выращивания и хранения посевного материала; исследовать условия культивирования продуцента ингибитора а-глюкозидаз, способствующие максимальному накоплению ингибитора в культуральной жидкости; выявить зависимость биосинтеза ингибитора а-глюкозидаз от компонентного состава и биохимических характеристик питательной среды в процессе культивирования продуцента.
6 Научная новизна исследования.
Выделен из почвенных образцов активный продуцент ингибитора а-глюкозидаз, который рекомендован для разработки технологии отечественного антидиабетического препарата, названного гипоглюкином.
Установлена таксономическая принадлежность культуры. По совокупности признаков она отнесена к роду Streptomyces и является новым продуцентом ингибитора а-глюкозидаз.
Предложено контролировать степень готовности вегетативного посевного материала для передачи на стадию ферментации по уровню его дегидрогеназной активности.
Установлено, что замораживание при -20С вегетативного мицелия с криопротектором сохраняет ингибиторную активность культуры в течение одного года.
Впервые детально исследовано влияние углеводов в составе питательной среды на синтез ингибитора а-глюкозидаз. Показано, что только растворимый крахмал положительно влияет на образование ингибитора. Установлено, что собственные амилазы продуцента являются а-амилазами и расщепляют крахмал питательной среды на декстрины, мальтоолигосахариды, мальтозу и следы глюкозы. Такие продукты расщепления крахмала являются оптимальными как для роста культуры, так и для синтеза ингибитора.
Практическая значимость работы.
Среди актиномицетов, изолированных из почв различными селективными методами, отобран штамм 839, устойчивый к действию протеаз и обладающий высокой ингибиторной активностью, равной 2000±100 ИЕ/мл, достаточной для выделения ингибитора.
Методом ступенчатого отбора выделен вариант К-20 продуцента ингибитора а-глюкозидаз, превышающий по уровню ингибиторной активности исходный шт.839 на 15%.
Оптимизирован состав посевной среды для выращивания продуцента с одновременной заменой в ее составе глюкозы на зеленую патоку.
Предложен метод стабилизации продуцента ингибитора а-глюкозидаз путем замораживания вегетативного мицелия при -20С с добавлением в качестве криопротектора 25% раствора сахарозы.
Определено, что оптимальным источником углеводного питания в составе ферментационной среды является растворимый крахмал. Показана возможность его замены на гидролизаты более дешевого нерастворимого крахмала со степенью гидролиза амилосубтилином на 25-30%.
Оптимизация компонентного состава посевной и ферментационной сред и условий культивирования, а также отбор активного варианта продуцента из естественного рассева, позволили увеличить синтез ингибитора а-глюкозидаз до 3200±200 ИЕ/мл (на 60%).
Лабораторный регламент на производство гипоглюкина дополнен технологической схемой стадии биосинтеза с использованием активного штамма К-20 на оптимизированных посевной и ферментационных средах, обеспечивающих проведение стандартных ферментации.
Основные положения, выносимые на защиту.
Новый продуцент ингибитора а-глюкозидаз Streptomyces species шт. 839.
Оптимизированные питательные среды для выращивания посевного материала и проведения процесса ферментации продуцента ингибитора а-глюкозидаз.
Сохранение ингибиторной активности продуцента с использованием криоконсервации при -20С вегетативного мицелия в 25% растворе сахарозы.
Технологическая схема приготовления партий посевного материала из замороженной культуры и стадии культивирования продуцента ингибитора а-глюкозидаз с использованием селекционированного штамма К-20 и оптимизированных сред.
Апробация работы.
Результаты исследований обсуждены на заседании кафедр биотехнологии и микробиологии СПХФА, доложены на П-м и Ш-м Международном конгрессе по биотехнологии «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2004, 2005 г.г.), на IX и X Российском научном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2002, 2004 г.г.), на научной конференции СПХФА «Подготовка кадров для фармацевтической промышленности» (Санкт-Петербург, 2005 г.).
Публикации.
По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ.
Объем и структура работы.
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на 159 страницах машинописного текста, содержит 30 таблиц, 22 рисунка (из них 5 фотографий). Библиография включает 233 источника.
Углеводный обмен и его патология
Углеводы занимают видное место в питании человека и животных. На долю углеводов в условиях умеренного климата приходится по калорийности около 60-70% пищевого рациона человека.
Организм человека не способен синтезировать углеводы из неорганических веществ и получает их с различными пищевыми продуктами, главным образом растительного происхождения.
В пищевом рационе большинства людей главными источниками энергии служат сахара и крахмалы. Углеводная пища — обычно самая дешевая пища, чем отчасти и определяется высокое содержание углеводов в рационе.
Большим содержанием крахмала отличаются зерна пшеницы, ржи, ячменя, овса, риса, кукурузы, а также клубни картофеля. Следовательно, основными источниками крахмала являются такие общеупотребляемые пищевые продукты как хлеб, крупы и картофель. Сахарозу, глюкозу и фруктозу организм человека получает с пищевым сахаром и фруктами.
Пищеварение всегда связано с расщеплением макромолекул на более простые компоненты путем гидролиза, катализируемого ферментами из группы гидролаз.
Переваривание углеводов начинается в тонком кишечнике. Кратковременное воздействие амилазы слюны на крахмал пищи существенной роли не играет, так как в просвете желудка кислая среда инактивирует этот фермент.
В тонком кишечнике крахмал под действием панкреатической а-амилазы гидролизуется с образованием декстринов, мальтоолигосахаридов и мальтозы. Затем при попадании в желудочно-кишечный тракт продукты неполного гидролиза крахмала и сахароза подвергаются действию внутрикишечных олиго- и дисахаридаз (кишечных а-глюкозидаз), которые гидролизуют их до конечных продуктов - глюкозы и фруктозы. Из пищеварительного тракта моносахара всасываются в кровяное русло.
После приема пищи значительная часть глюкозы, метаболизирующаяся в печени, превращается в гликоген (резервный полисахарид), который при первой необходимости служит готовым источником глюкозы. Однако общее содержание его в печени довольно ограничено (в среднем 70-100 г) и способно обеспечить потребности организма в глюкозе в течение не более 8-12 часов.
Таким образом, глюкоза и глюкоген, накопившийся в печени, окисляясь в тканях, в конечном итоге являются основными источниками энергии, необходимой организму для осуществления разнообразных функций.
Несмотря на постоянное потребление глюкозы тканями и периодическое поступление ее из кишечника (только после приема пищи), содержание глюкозы в крови в норме всегда удерживается на определенном уровне. В норме концентрация глюкозы в плазме крови в течение суток колеблется в относительно узких границах от 3,5 до 5,5 ммоль/л (60-70 мг/ЮОмл). Это обстоятельство имеет огромное физиологическое значение [2].
Функция печени в углеводном обмене регулируется сложным взаимодействием четырех гормонов — инсулина, адреналина, кортизона и гормона роста, вырабатываемых соответственно поджелудочной железой, мозговым веществом надпочечников, корой надпочечников и гипофизом.
Среди них наиболее существенное влияние на углеводный обмен оказывает гормон, секретируемый р-клетками поджелудочной железы -инсулин.
Считается, что инсулин способствует отложению сахара в печени и мышцах в форме гликогена и сбалансированному усвоению глюкозы в качестве энергетического материала тканями. Важным обстоятельством служит и то, что инсулин способствует (хотя лишь косвенным путем) превращению значительного количества всасываемых углеводов (обычно около 30%) в жиры, накапливающиеся в жировой ткани.
Материалы и методы исследования
Выделение актиномицетов проводили из образцов черноземных, дерновоподзолистых, песчаных почв, собранных в Молдавии, Грузии, Таджикистане, Казахстане, а также листового опада, собранного в Ленинградской области. Всего исследовано 22 почвенных образца.
Для выделения актиномицетов использовали следующие методы:
Метод посева почвенной суспензии на агаризованную среду - 1 г почвы суспендировали в физиологическом растворе 30 минут при 27±1С. Разведенную почвенную суспензию высевали на агаризованную среду Чапека с крахмалом. Чашки инкубировали 14 суток при 27±1С [105, 106].
Метод «приманка на природные субстраты» - 1 г почвы помещали в чашку Петри, заливали очищенной водой, на поверхность воды помещали приманки. В качестве приманок использовали волосы человека, листья дуба (Quercus ruber), панцирь криля (Pandulus species), кожу змеи (Vipera berus). Чашки инкубировали при 27±1С до появления воздушного мицелия на поверхности приманки [107].
Метод «влажная инкубация» - начавшую разлагаться растительную подстилку (прелая трава) помещали в чашку Петри, покрытую с внутренней стороны смоченной фильтровальной бумагой. Чашки заклеивали изолентой и инкубировали при 27±1С в течение месяца и более до появления воздушного мицелия на поверхности субстрата [108].
Метод «посев на хитиновый агар» - разведенную почвенную суспензию или смыв с растительных остатков высевали на агар, содержащий в качестве единственного источника углерода и азота 0,2% хитина. Посевы инкубировали при 27±1С 4-6 недель [109].
Метод «капилляр с аттрактантами» - 1 г почвы помещали в чашку Петри, заливали 25 мл очищенной воды. После часовой прединкубации в чашку на простерилизованную заранее подставку помещали 2 капилляра (1=50 мм, d=l мм), заполненные аттрактантом. В качестве аттрактанта использовали 0,01 М раствор хлорида калия в 0,01 М фосфатном буфере (рН 7,0), а также другие аттрактанты: 0,01М растворы сахарозы, мальтозы, аргинина и глутаминовой кислоты в том же растворителе. После часовой инкубации содержимое капилляра переносили на среду Чапека с крахмалом и равномерно распределяли по поверхности агара шпателем. Чашки инкубировали при 27±1С 2-3 недели [ПО].
Культуры актиномицетов, выделенные различными методами, пересевали на среду Чапека с крахмалом. Чистые культуры актиномицетов хранили на этой же среде.
Для проверки способности свежевыделенных культур образовывать ингибитор а-глюкозидаз их предварительно выращивали в колбах Эрленмейера объемом 750 мл, содержащих 100 мл жидкой питательной среды №187 (п.2.7).
Ингибиторную активность определяли в нативном растворе полуколичественным экспресс-методом диффузии в агар. У штаммов, проявивших ингибиторную активность на первом этапе скрининга, оценивали уровень активности спектрофотометрическим методом.
Выделение актиноплан из почвенных образцов селективными методами
Микроорганизмы являются богатым источником различных биологически активных веществ, в частности ингибиторов ферментов.
Как отмечалось в обзоре литературы, продуценты ингибиторов а-глюкозидаз распространены среди различных групп микроорганизмов. Описан штамм Cladosporium herbarum - продуцент ингибитора а-амилазы [51]. Есть сообщения об образовании ингибитора а-глюкозидаз культурами цианобактерий [135].
Однако, продуценты ингибиторов а-глюкозидаз наиболее часто встречаются среди актиномицетов, особенно среди представителей семейства Streptomycetaceae и Actinoplanaceae[48]. В 9-м определителе бактерий Берджи эти семейства переименованы в группы стрептомицетов и актиноплан [136]. Из актиномицетов выделен целый ряд ингибиторов пептидной, гликопептидной и олигосахаридной природы. Однако из-за узкого спектра действия и (или) чувствительности к действию протеаз они не нашли применения в медицине. Только для тендемистатина - белкового ингибитора, синтезируемого Streptomyces tendae [64], обсуждалась возможность его применения в клинике. Более широкие перспективы для практического применения имеет группа псевдоолигосахаридных ингибиторов, синтезируемых актинопланами. Немецкими учеными из культуральной жидкости Actinoplanes sp. выделен ингибитор, названный акарбозой (торговое название «глюкобай»), который успешно применяется в клинике в качестве высокоэффективного антидиабетического средства [74].
В связи с этим нами проведены исследования по выделению актиномицетов, преимущественно из группы актиноплан, селективными
методами, предложенными различными авторами для скрининга этих микроорганизмов.
Это методы «приманки на природные субстраты» [107, 137, 138], «влажной инкубации» [108], «посев на хитиновый агар» [109], «капилляры с аттрактантами»[110, 138, 139]. Для сравнения с ними был также использован традиционный метод посева почвенной суспензии на агаризованную среду Чапека с крахмалом [105, 106].
Из различных почвенных образцов традиционным высевом почвенной суспензии на агаризованную среду выделено 8079 штаммов актиномицетов (табл. 5). Как известно, при таком способе посева почвенной суспензии на поверхности агаризованной среды выделяется все разнообразие флоры почвенных актиномицетов — от обычно и часто встречающихся стрептомицетов до редких форм актиномицетов, относящихся к другим группам.
Все они были проанализированы на способность образовывать ингибитор а-глюкозидаз методом диффузии в крахмалосодержащий агар и среди них только 41 культура синтезировала это соединение.
После предварительного тестирования выделенных ингибиторов на устойчивость к действию протеаз отбраковано 37 культур. У 4 наиболее активных штаммов был определен уровень ингибиторной активности спектрофотометрическим методом, но из-за низкой активности они не представляли интереса для дальнейшего изучения.
Существенным недостатком традиционного метода выделения актиномицетов является невозможность преимущественного изолирования из почвенных образцов медленнорастущих форм актиномицетов, в частности — актиноплан, среди которых по литературным данным продуценты ингибиторов а-глюкозидаз встречаются наиболее часто [48]. Поэтому, следующим направлением скрининга продуцентов ингибиторов было выделение культур этой группы селективными методами.
Актинопланы широко распространены во всех типах почв [107, 140], в особенности в южных черноземных почвах, в речной и озерной воде [141], на
различных животных и растительных остатках [137]. Характерными морфологическими особенностями актиноплан является подвижность зооспор и их способность к хемотаксису [139, 142], а также способность расти на трудноусвояемых растительных и животных остатках. Несмотря на широкое распространение актиноплан, выделить их в чистую культуру обычными методами очень трудно из-за медленной скорости роста.
