Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 9
1.1 Высшие базидиомицеты - продуценты протеолитических ферментов и других ценных биологически активных соединений 9
1.2 Основные технологические стадии производства сыра 17
1.3 Молокосвертывающие ферменты в сыроделии 21
1.3.1 Свойства молокосвертывающих ферментов и механизм их действия 21
1.3.2 Основные продуценты молокосвертывающих ферментов и коммерческие препараты на их основе 29
1.3.3 Биосинтез молокосвертывающих ферментов различными продуцентами 39
1.4 Методы выделения и очистки ферментных препаратов 44
1.5 Кинетика ферментативных реакций 53
ГЛАВА 2 Материалы и методы исследования 57
2.1 Объекты исследования 57
2.2 Условия культивирования объектов исследования 61
2.3 Изучение динамики роста культур базидиальных грибов 63
2.4 Определение молокосвертывающей и протеолитической активности 66
2.5 Концентрирование и фракционная очистка ферментных препаратов 71
2.6 Определение молекулярной массы исследуемых ферментов 76
2.7 Изучение кинетических констант и состава активного центра
исследуемых ферментов 79
ГЛАВА 3 Результаты и обсуждение 83
3.1 Сравнительная характеристика различных видов базидиомицетов по уровню молокосвертывающей активности в динамике глубинного культивирования з
3.2 Культурально-морфологические признаки базидиомицетов, отобранных в качестве продуцентов молокосвертывающих ферментов 86
3.2.1 Культурально-морфологические признаки вида Coprinus lagopides 87
3.2.2 Культурально-морфологические признаки вида Cerrena sp 88
3.3 Характеристика молокосвертывающей активности культуры Coprinus lagopides в динамике роста на разичных питательных средах 89
3.4 Характеристика молокосвертывающей активности культуры Cerrena sp. в динамике роста на различных вариантах питательных сред 93
3.5 Сравнительный анализ молокосвертывающей и протеолитической активности у видов Coprinus lagopides и Cerrena sp 100
3.6 Анализ различных схем выделения молокосвертывающего препарата из культурального фильтрата Coprinus lagopides 107
3.7 Разработка метода получения молокосвертывающего препарата из культурального фильтрата Cerrena sp 114
3.8 Физико-химическая характеристика молокосвертывающих ферментов базидиамицетов Coprinus lagopides и Cerrena sp. (молекулярная масса, кинетические константы, состав активного центра) 119
3.9 Сравнительный анализ полученных грибных ферментов с отраслевым препаратом животного происхождения по основным показателям, принятым в сыроделии 143
Заключение 146
Выводы 154
Список литературы
- Молокосвертывающие ферменты в сыроделии
- Изучение динамики роста культур базидиальных грибов
- Культурально-морфологические признаки базидиомицетов, отобранных в качестве продуцентов молокосвертывающих ферментов
- Сравнительный анализ молокосвертывающей и протеолитической активности у видов Coprinus lagopides и Cerrena sp
Введение к работе
Актуальность темы. Процесс получения сырно-творожных продуктов из молока был знаком человеку более восьми тысяч лет назад. Но только в XX веке были завершены детальные исследования на молекулярном уровне, позволившие прояснить сложный механизм сычужного свертывания молока. И, тем не менее, процесс ферментативного створаживания молока продолжает оставаться одним из сложных и тонких технологических процессов современного пищевого производства. Связано это с тем, что технология створаживания молока, например, в сыроделии, включает в себя несколько тесно взаимозависимых факторов физической, химической и биологической природы, существенно влияющих на качество и выход целевого продукта. При этом биологическая компонента процесса является наиболее важной, т.к. качество исходного молочного сырья и биологические особенности разных продуцентов часто сильно варьируют и амплитуда этих изменений не всегда может быть своевременно выявлена и учтена производителями. Ключевым моментом любого сырного производства является выбор молокосвертывающего фермента (МСФ), именно этим фактором определяются вкусовые качества готового продукта. При выборе соответствующих препаратов протеиназ определяющим аргументом является соотношение уровней молокосвёртывающей активности (МСА) и общей протеолитической активности (ПА).
Тысячелетиями в сыроделии для свертывания молока использовали сычужный фермент, образующийся в одном из отделов желудка молодняка жвачных животных. Однако, в последние десятилетия во многих странах мира возник острый дефицит животного сырья, который, естественно, повлёк за собой и дефицит сычужных ферментов. Сложившаяся ситуация привела к тому, что в сыроделии стали применять препараты-заменители относительно близкие к сычужному ферменту по действию на молочный субстрат, например, комплексы пепсинов с другими протеазами, продуцируемыми микроорганизмами. Замена дорогостоящего сычужного фермента (по-прежнему являющегося общепризнанным стандартом) бактериальными или грибными протеиназами узкого протеолитического действия, продолжает оставаться важной задачей современной биотехнологии, поскольку способствует решению актуальной и экономически важной проблемы, существующей в сыродельной отрасли.
Цель и задачи исследования. Целью работы являлось выделение, характеристика свойств и оценка перспективы использования штаммов высших базидиомицетов в технологии створаживания молока
Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:
-провести отбор продуцентов с выраженным биосинтезом протеиназ молокосвёртывающего действия среди культур 11 видов базидиомицетов, выращенных в глубинных условиях;
-подобрать для выявленных культур оптимальные условия роста и биосинтеза молокосвёртывающих ферментов в условиях глубинного культивирования;
-провести анализ культуральной жидкости продуцентов на содержание ферментов молокосвертывающего действия и оценить в них соотношение уровней специфической молокосвёртывающей активности и общей протеолитической активности;
-подобрать условия и методы концентрирования, а также выделения и очистки ферментных молокосвёртывающих препаратов из культуральной жидкости продуцентов;
-оценить молекулярную массу полученных ферментов (методом гель-фильтрации);
-определить кинетические параметры выделенных ферментов;
-сравнить характеристики «базидиальных» молокосвёртывающих препаратов с аналогичными стандартными препаратами животного происхождения.
Научная новизна работы. Представленная работа является первым исследованием протеиназ молокосвёртывающего действия из культур базидиальных грибов, характерных для лесной зоны Северо-западного региона России и хранящихся в Коллекции кафедры микробиологического синтеза Технологического института. Из 24 видов макромицетов, представленных в коллекции, в динамике глубинного роста изучено 11 видов базидиомицетов, из них для шести видов грибов биосинтез молокосвёртывающих ферментов изучен впервые.
Впервые показано, что соотношение в среде основных источников питания (C:N) регулирует не только уровень молокосвёртывающей активности культур, но и оказывает значительное влияние на весь спектр субстратной специфичности протеиназ, синтезируемых продуцентами.
Впервые установлено, что зависимость синтеза молокосвёртывающих ферментов с узкой или широкой субстратной специфичностью (МСА и ПА) и их соотношение, регулируется в глубинных условиях не только соотношением источников углерода и азота, но и существенно зависит от природных трофических особенностей, характерных для данного вида макромицета.
Практическая значимость работы. В условиях глубинного культивирования проведён выбор высших базидиальных грибов – продуцентов протеиназ молокосвёртывающего действия.
Подобраны составы питательных сред и условия культивирования отобранных видов базидиомицетов.
Разработаны методы выделения и очистки молокосвёртывающих препаратов из культурального фильтрата (КФ) продуцентов.
Разработанные способы получения молокосвертывающих препаратов из культур базидиальных грибов позволяют получать ферментные препараты с высоким уровнем молокосвёртывающей активности на фоне низкого уровня общей протеолитической активности.
Проведена сравнительная характеристика ферментативных и физико-химических свойств полученных из базидиомицетов молокосвёртывающих препаратов и коммерческого сычужного препарата, используемого в практике сыроделия. Показано, что по уровню и специфичности молокосвёртывающей активности препараты из культур базидиомицетов сопоставимы с образцами сычужного препарата животного происхождения.
Предлагаемые в качестве продуцентов молокосвертывающих ферментов культуры высших базидиальных грибов, в отличие от культур микромицетов, в ходе биотехнологического процесса не имеют стадии спороношения, что исключает опасность соответствующих профзаболеваний персонала (кандидозы, микозы, аллергические реакции и т.п.) и способствует экологической чистоте рабочих помещений.
Реализация результатов. Материалы диссертации реализованы в учебном процессе кафедры технологии микробиологического синтеза Санкт-Петербургского Государственного Технологического Института ( Технического Университета): при выполнении научно исследовательских работ по следующим темам «Биологически активные вещества высших грибов, получаемые при их глубинном культивировании» и «Биомедицинский и пищевой потенциал высших базидиомицетов».
Апробация работы. Результаты исследований были доложены: на 2-ом Центральном европейском пищевом конгрессе (Будапешт,2004), 8-ой Пущинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2004), “BIOCAT-2004”(Hamburg, 2004), III-ем Международным Конгрессе “Биотехнология - состояние и перспективы развития» (Москва, 2005), Всероссийском конкурсе инновационных проектов «Живые системы» (Киров, 2005), 3-ем Центральном европейском пищевом конгрессе (Болгария, 2006), XI Международном конгрессе по микробиологии (Болгария, 2006), 5-ом Международном конгрессе по пищевой биотехнологии (Греция, 2007), 13-ом международном симпозиуме по биотехнологии (Китай, 2008), 14-ом международном конгрессе по пищевой науке и технологии (Китай, 2008).
Положение, выносимое на защиту.
Культуры базидиальных микромицетов – продуцентов протеиназ молокосвертывающего действия, депонированные в Коллекции кафедры микробиологического синтеза Санкт-Петербургского Государственного Технологического Института.
Схема выделения и очистки ферментативных препаратов, обладающих молокосвертывающей активностью.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 22 работы.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, аналитического обзора, двух глав по результатам экспериментальной работы и их обсуждению, выводов, списка использованных литературных источников, включающих 117 наименований. Работа изложена на 167 страницах машинописного текста, включает 37 рисунков и 40 таблиц.
Молокосвертывающие ферменты в сыроделии
На основании анализа отечественных и зарубежных публикаций 70-х - 90-х годов прошлого столетия, когда имел место пик активного изучения ПА в культурах базидиальных грибов, показано, что основные материалы этих исследований касались оценки уровня желатиназной активности (ЖА), казеиназной (КА) и молокосвертывающей (МСА). Инициаторами изучения протеолитических ферментов высших грибов были японские авторы, затем эти работы были широко развернуты в нашей стране (Ленинград, БИН АН СССР) и продолжены в ЧССР, Польше и других европейских странах [10,20,35,38-41,60,90-92,104-106].
Традиционным субстратом для определения активности протеиназ базидиомицетов (как, впрочем, и других организмов) долгие годы использовали казеин. Следует отметить, что казенны являются гетерогенной группой фосфопротеидов молока и, в зависимости от фирмы-изготовителя, сильно разнятся по составу. Наиболее очищенные препараты содержат генетические варианты а-, р-, у- и к-казеинов, часто контаминированные альбуминами и глобулинами.Таким образом, при оценке ПА секретируемых протеиназ в ферментативной реакции участвуют две гетерогенные системы -культуральный фильтрат и белковый субстрат (это справедливо и для указанной выше ЖА).
Механизм гидролиза белков казеина детально изучен для таких коммерческих ферментов, как химозин, трипсино- и плазминоподобные ферменты [81]. Очищенные препараты протеиназ из базидиомицетов начали изучаться только в самые последние десятилетия прошлого столетия. Изученные в прошедшие 70-80-е годы различные группы базидиомицетов по уровню казеиназной (синоним общей протеолитической) активности свидетельствуют о наличии в группе афиллофоровых грибов до 30% видов, обладающих высокой неспецифической ПА, в группе агариковых (пластинчатых) грибов такие культуры составляли 14%. В пор. Aphyllophorales активными штаммами выделяется сем. Polyporaceae (п/сем. Trametoideae), в пор. Agaricales - сем. Tricholomataceae и сем. Coprinaceae. Аналогичным образом эти же таксономические группы выделяются и при исследовании МСА [20]. По-прежнему культуры афиллофоровых грибов содержат значительно большее количество активных штаммов, по сравнению с агариковыми (48 и 17% соответственно).
При использовании в качестве белкового субстрата молока также приходится учитывать его сложный состав за счёт наличия кроме казаинов ещё целого ряда других белков - лактальбуминов, иммуноглобулинов и мн.др. Однако, в основе коагуляции молока лежит вполне определенный механизм - дестабилизация белковых мицелл. Именно молекулы к-казеина, играющие стабилизирующую роль, и являются объектами первоочередной атаки известными сычужными ферментами. Таким образом, МСА является как бы частным случаем КА. Соотношение МСА/КА в культуральных фильтратах базидиомицетов является важной характеристикой, определяющей целесообразность дальнейшего исследования этих грибов в качестве молокосвертывающих ферментов. По данным японских [85,86] и чешских авторов [104,105], высоким соотношением МСА/КА отличались культуры видов Fomitopsis pinicola, Coriolus consors, Irpex lacteus, Phellinns chrysoloma, Pleurotus cornncopiae и др. Однако, при дальнейшем изучении протеиназ, входящих в состав КФ этих культур, перспективной для практического использования оказалась лишь культура Irpex lacteus[93], протеиназы которой детально были исследованы по субстратной специфичности [94-99]. Данные по активности внутриклеточных протеаз базидиомицетов весьма ограничены [20]. По-видимому, объясняется это тем, что основные исследования ПА грибов связаны с решением определенных прикладных задач. Выделение ферментных препаратов из КФ является значительно более простой технологической задачей, чем выделение их из клеточных культур.
Представленные выше исследования касались характера биосинтеза культурами базидиомицетов внутри- и внеклеточных протеиназ, активность которых оценивалась по степени гидролиза казеина в нейтральных условиях. О наличии ПА в пределах кислых или щелочных значениях рН имеется ограниченное число собщений [10,85,86,104-106]. По данным М. Каваи [88,89], распределение кислых и нейтральных протеаз в культурах афиллофоровых и агариковых грибов различно. Так, из 32 штаммов, изученных в пор. Aphyllophorales, 19 культур обладали высоким уровнем КА при рН 3.0 и 15 культур имели высокую К А при рН 6.0, т. е. наблюдалось приблизительно равномерное распределение кислых и нейтральных протеаз. В пор. Agaricales ни один вид из 36 исследованных культур не проявил высокой КА при рН 3.0, а при рН, близком к нейтральному (6.0), активными оказалось 14 видов культур (аналогично афиллофоровым). Тем не менее, о высокой КА при низких значениях рН имеются сообщения у таких агариковых грибов, как Coprinus comatus и Lepista nuda [10,104,105].
В природе древесина, разрушенная грибами - возбудителями коррозионной и особенно деструктивной гнили, имеет низкие значения рН. В условиях искусственной культуры эти свойства дереворазрушающих грибов проявляются в характере закислення питательной среды. У грибов бурой гнили значения рН среды лежат в пределах рН 2-4, у грибов белой гнили при рН в среднем 4-6.
Изучение динамики роста культур базидиальных грибов
Процесс диализа, применительно к очистке ферментных растворов, тоже имеет ряд недостатков. Во-первых, при диализе возможна «потеря» фермента в результате вымывания ионов металлов, входящих или в состав активного центра, или стабилизирующих фермент соединений, или фрагментов самого фермента, например, простетической группы. Во вторых, при диализе против обычной водопроводной воды активность фермента может снизиться за счёт попадания из воды ионов металлов — ингибиторов фермента. Кроме того, в процессе диализа одновременно с очисткой ферментных белков происходит их сильное разбавление под действием сил прямого осмоса. Объем отдиализованного раствора увеличивается примерно на 20-25%, а если учесть, что происходит активное удаление балластных веществ, то в результате диализа получают достаточно разбавленные ферментные растворы. Поэтому в наши дни этот метод очистки ферментных растворов от низкомолекулярных веществ используется в основном в лабораторных условиях. Этот метод иногда применяют в лабораторных исследованиях и при получении высокоочищенных ферментных препаратов [5,17].
Осаждение органическими растворителями. Подавляющее большинство ферментов является водорастворимыми белковыми полимерами. Ферменты, предназначенные для выделения и очистки, могут быть представлены в виде различных растворов - экстракты из поверхностных культур микроорганизмов, фильтраты из гомогенатов растительных и животных тканей, лизаты микроорганизмов, фильтраты культурной жидкости и многие другие варианты. Исходные растворы ферментов представляют собой сложную систему, в состав которой, помимо ферментных белков, входит большое количество растворимых в воде соединений и веществ коллоидной природы. Выделение ферментов из этой сложной смеси представляет определенные трудности, т.к. такая комплексная система чувствительна к внешним воздействиям, поэтому выведение ферментных белков в осадок требует строгого соблюдения определённых условий, при которых начинается агрегирование именно белковых молекул [17].
Растворимость белка в различных растворителях во многом определяется распределением гидрофобных и гидрофильных остатков на поверхности белковой молекулы . Известно, что гидрофобные группы белка стремятся сконцентрироваться внутри молекулы, однако, определённая их часть находится на поверхности молекулы. Так как основным растворителем белков является вода, то изменяя её свойства (температуру, ионную силу, рН, добавление нейтральных солей, водорастворимых органических веществ или других инертных соединений), можно создать определенное окружение белковой молекулы, влияющее на ее гидратный или сольватный слой и тем самым вызвать агрегацию белковых молекул и выпадение их в осадок. В промышленных масштабах пользуются в основном осаждением белков водными растворами солей и/или органическими растворителями. По мере увеличения концентрации растворителя в воде снижается способность воды к сольватации заряженных гидрофильных молекул фермента. Агрегирование белков происходит под действием электростатических и Ван-дер-Ваальсовых сил, возникающих между отдельными белковыми молекулами. Гидрофобное взаимодействие, вероятно, имеет меньшее значение в результате влияния органических растворителей на неполярные участки белковой глобулы.
Процессы агрегирования белков и формирование осадков зависят от условий осаждения, природы осадителя и многих других факторов [21].
При осаждении ферментов всегда учитывают тепловыделение, возникающее при разбавлении водой спиртового агента. Температура водно-спиртовой смеси повышается на 5-10С, поэтому, чтобы избежать инактивации ферментов, спиртовое осаждение ведут при минусовой температуре (при -18-20С) предварительно охлажденным этанолом. Для большинства ферментов, получаемых в промышленных условиях, оптимальная температура осаждения равна 3-5С. Для достижения этой температуры раствор фермента предварительно охлаждают до 1-3С, а растворитель до минус 8-12С, длительность контакта с растворителем сокращают до минимума.
Гель-проникающая хроматография. В препаративной энзимологии для выделения нестабильных ферментов часто применяют мягкие условия, при которых фермент в течение всей процедуры фракционирования находится в растворимом состоянии. Таким наиболее распространённым приёмом стал метод гель-фильтрации, простой и доступный в лабораторных и промышленных условиях.
Как правило, гель-проникающая хроматография (ГПХ) используется или для разделения смеси соединений в соответствии с размером и формой их молекул и/или для ориентировочной оценки молекулярной массы соединений.
Гель - это химически инертная, полимерная матрица, гранулы которой имеют сферическую форму, определённый размер пор и насыщены жидкостью. Соединения, находящиеся в анализируемой смеси, в зависимости от молекулярной массы и других свойств или проникают внуть пор геля или остаются на их поверхности, двигаясь вместе с потоком растворителя. В результате, крупные молекулы первыми покидают полимерную матрицу, затем молекулы средних размеров, лишь частично проникшие в поры, низкомолекулярные соединения обладают более низкой подвижностью и элюируются медленнее всего, таким образом компоненты анализируемой смеси выходят из колонки в порядке, соответствующем убыванию их молекулярной массы.
Культурально-морфологические признаки базидиомицетов, отобранных в качестве продуцентов молокосвертывающих ферментов
Макро- и микроскопические признаки вегетативного мицелия. Культура продуцента хранится в стеклянных пробирках на косяках сусло-агара (содержание Сахаров 4 по Баллингу, агар 20%) в рефрижераторе при температуре 4-6С ± 2С. Воздушный мицелий культуры вначале роста белого цвета, затем серовато-коричневатый, обратная сторона колоний гладкая, реверзум не окрашен.
Гифальная система продуцента мономитическая. В культуре гифы двух типов - недифференцированные генеративные 3-8 мкм в диаметре, длинноклеточные, с регулярными небольшими пряжками, гиалиновые, а также дифференцировавшиеся из них мешковидные гифы, идентичные таковым поверхности кутикулы плодового тела.
Характерным признаком культуры является обильное образование склероциев (плотно упакованных генеративных гиф) буроватого цвета, волокновидных, иногда содержащих вздутые запасающие клетки (10-20 мкм в диаметре) морфологически также подобные клеткам кутикулы.
Макро- и микроскопические признаки плодовых тел, полученных in vitro. Шляпки раскрытых плодовых тел 10-20 мм в диаметре, вначале эллипсоидальные, конические, затем распростертые, часто расщепленные по краю, беловатые, затем серые с винным оттенком. В центре шляпки кремово-желтоватые, сначала покрыты многочисленными беловато-сероватыми чешуйками, затем голые, слегка ребристые. Кутикула состоит из радиально ориентированных пузыревидных цилиндрических клеток 10-20 мкм в диаметре. Пластинки плодовых тел от сероватых до буро-черных. Ножки 15-75x4 мм, цилинрические, беловатые, у основания утолщенные, войлочные. Споры темно-бурые, 6-9x5-7 мкм, лимоновидные, гладкие, толстостенные с центральной усеченной порой прорастания, в массе фиолетово-черные.
В глубинных условиях культура продуцента развивается, как и большинство культур базидиальных макромицетов, в виде пушистых пеллет (шариков), средний диаметр пеллет Coprinus lagopides 5-7 мм. Изменения цвета культуральной жидкости в процессе ферментации не происходит.
Макроскопические признаки. На сусло-агаре (содержание Сахаров 4 по Баллингу, агар 20%) культура образует мицелий белого цвета, густой, пушистый, ватообразный, равномерный. Изменений цвета реверзума не происходит. При росте на чашках Петри на границе колонии формируется зона редкого мицелия (около 5 мм), край роста воздушный. Чашки Петри (диаметром 90 мм) зарастает полностью на 8-е сутки роста. В глубинных условиях образует главным образом мелкие, пушистые пеллеты диаметром 3-5 мм (3-4 сутки культивирования). Наряду с мелкими образуются и более крупные пеллеты с полым центром. Во время роста культуры происходит некоторое осветление культуральной жидкости.
Микроскопические признаки. В глубинной культуре гифальная система характеризуется двумя типами гиф: тонкостенными генеративными, шириной 1.5-2.0 мкм, с пряжками, и толстостенными, шириной 2.0-3.0 мкм. Молодые гифы имеют ярко выраженную грануляцию в цитоплазме. Пряжки слабо изогнуты, имеют размеры в среднем 5х5мкм , иногда деформированы в виде шишки или прорастают в новую гифу, встречаются часто. В динамике роста морфология мицелия меняется незначительно - гифы становятся более широкими (2-4 мкм), с частыми и разнообразными вакуолями в цитоплазме, встречаются анастомозы. Нередко мицелий распадается на палочковидные артроконидий. Хламидоспоры отсутствуют. В поверхностной культуре встречаются слабоизогнутые пальцевидные пряжки. Такая форма пряжек, а также образование палочковидных артроконидий могут служить отличительным морфологическим признаком культуры Cerrena sp.
Характеристика молокосвертывающей активности культуры Coprinus lagopides в динамике роста на разичных питательных средах
Динамику роста культуры агарикового макромицета Coprinus lagopides изучали, начиная с четвертых суток глубинного культивирования на полусинтетической и натуральной средах. Определяли прирост биомассы, потребление Сахаров и уровень молокосвертывающей активности. Пробы на содержание глюкозы и на определение ферментативной активности отбирали из культуральной жидкости, предварительно отфильтрованной через бумажный и асбестовый фильтры. Биомассу мицелия высушивали при температуре 50С в воздушном термостате и фиксировали установившийся постоянный вес. Характеристика динамики роста культуры приведена в таблице 3.3.1 Таблица 3.3.1 - Динамика синтеза биомассы и потребления источника углерода при росте культуры Coprinus lagopides на различных вариантах питательных сред
Как видно из таблицы 3.3.1, культура Coprinus lagopides откликается максимальным биосинтезом мицелиальной массы (выше 9 г/л) на «богатый состав» источников питания в натуральной среде. На полусинтетической среде первого варианта (глюкоза-10, пептон-2.5) максимум биомассы был значительно ниже — 6.4 г/л. Однако, если, не изменяя соотношение источников «С» и «N», просто увеличить их абсолютные значения (глюкозу до 40 г/л, пептон до 10 г/л), то культура Coprinus lagopides за эти же сроки достигнет такого же максимума (8.9 г/л) как на натуральной среде, правда значительная часть углеводов при этом не будет израсходована, что делает процесс биотехнологически не целесообразным.
Как видно из рис.3.3.1, нарастание МСА в культуре исследуемого штамма на полусинтетической (глюкозо-пептонной) и натуральной (пивное сусло, соевая мука) средах носит симбатный характер, но при этом натуральная среда обеспечивает в 2 раза более высокий уровень МСА, чем глюкозо-пептонная среда. Следовательно, для получения фермента из культурального фильтата Coprinus lagopides целесообразнее использовать натуральную среду указанного состава, и, кроме того, в этом варианте накапливается и максимальный уровень биомассы.
С целью выяснения влияния на уровень ферментативной активности дополнительного внесения субстрата, в состав натуральной питательной среды добавляли один из основных компонентов субстрата молокосвертывающего фермента - казеин. Добавление казеина в разных концентрациях производили в динамике роста культуры с 5-х по 7-е сутки. Результаты такой добавки представлены в таблице 3.3.2. Таблица 3.3.2 - Влиние добавки субстратного компонента (казеина) на уровень ферментативной активности и синтез биомассы продуцента
Как видно из табл. 3.3.2, уровень молокосвертывающей активности (главный предмет нашего исследования) на протяжении всех 3-х суток культивирования был несравнимо ниже, чем в контроле, из чего можно заключить, что казеин, или какая-либо из его составляющих, репрессируют биосинтез молокосвертывающего фермента. Возможно, в этом случае мы наблюдаем пример катаболитной репрессии ферментного синтеза. Тем не менее, на фоне дополнительного источника азотного питания, естественно, возрастает синтез биомассы.
Сравнительный анализ молокосвертывающей и протеолитической активности у видов Coprinus lagopides и Cerrena sp
В настоящем разделе исследований проведен сравнительный анализ ферментативной активности и органолептичесих свойств препаратов молокосвёртывающего действия из культур высших базидиальных грибов (полученных по схеме № 4) и препарата аналогичного действия, полученного из животного сырья (отраслевой образец сычужного препарата, ВНИИ маслоделия и сыроделия, г.Углич).
Молокосвёртывающий препарат из Coprinus lagopides представлял собой лиофильно высушенный ультрафильтрат, полученный из КФ продуцента, выращенного на натуральной среде и очищенного по схеме № 4. В идентичных условиях и аналогичным образом получен молокосвёртывающий препарат из Cerrena sp., с той лишь разницей, что КФ этого продуцента был получен при выращивании культуры на полу синтетической среде (глюкозопептонная среда №5)
Испытания стандартного сычужного препарата проводили по ГОСТ-9225 — 84. По требованиям ГОСТ а 1 мг коммерческого препарата разводили в 100 мл дистиллированной воды, настаивали при комнатной температуре 15 минут и брали пробу на испытание.
В таблице 3.9.1 представлена характеристика молокосвёртывающей и общей протеолитической активности и их соотношение в препаратах, полученных из культур базидиомиетов и коммерческом сычужном препарате (ВНИИМСг.Углич).
Из таблицы видно, что удельная молокосвертывающая активность фермента, полученного из культуральной жидкости гриба Cerrena sp. составила 78.2 Е/мг. Для ферментного препарата из Coprinus lagopides удельная молокосвертывающая активность была 76.0 Е/мг. Для стандартного образца сычужного препарата - 72.8 Е/мг. При этом, соотношение молокосвертывающеи и протеолитическои активности у стандартного сычужного препарата было 910, у препаратов из базидиальных культур Coprinus lagopides и Cerrena sp. - 835 и 782 соответственно.
По технологическим требованиям, предъявляемым в сыроделии к молокосвёртывающим препаратам, предназначенным для получения высококачественных сыров, соотношение молокосвертывающеи и протеолитическои активности должно быть в пределах 1000. Для сыров не столь высокого качества или для широкого спектра других кисломолочных продуктов допускается использование ферментных препаратов с соотношением МСА к ПА в пределах 300.
Таким образом, полученные из культур высших базидиальных грибов Coprinus lagopides и Cerrena sp. молокосвертывающие ферментные препараты по уровню ферментативной активности (МСА, ПА, МСА/ПА) и органолептическои характеристике молочного сгустка не уступают коммерческому сычужному препарату, использованному в данной работе в качестве стандартного аналога.
При производстве любых сортов сыра ключевым моментом успешного решения технологического процесса является именно выбор молокосвертывающего фермента, так как практически этим фактом определяются и выход и вкусовые характеристики готового продукта. При этом важнейжей характеристикой выбираемого фермента является его специфичность и уровень общей протеолитической активности. Замена общепризнанного, дорогостоящего сычужного фермента животного происхождения бактериальными или грибными протеазами узкого специфического действия представляется экономически выгодной и перспективной задачей сыроделия.
Объектами нашего исследования служили культуры высших базидиальных грибов из основных наиболее крупных порядков класса Basidiomycetes— Aphyllophorales и Agaricales.
В данной работе мы исследовали культуры семи видов афиллофоровых грибов и четыре вида агариковых. Все штаммы этих видов были выделены в чистую культуру из плодовых тел, собранных преимущественно в пригородной лесной зоне Санкт-Петербурга, и хранятся в коллекции культур базидиомицетов кафедры микробиологического синтеза технологического института.
Практически все виды афиллофоровых грибов являются нетоксичными, в том числе и объекты нашего исследования: Trametes suaveolens (L.:Fr.) Fr., Trametes ochracea (Pers.)Gilb.et Ryvarden, Fomes fomentarius (L.:Fr.) Fr., Ganoderma lucidum (Leyss.: Fr.) P.Karst, Cerrena sp. , Bjerkandera adusta (Fr.) Karst., Grifola frondosa (Dicks.: Fr.) Gray.
