Введение к работе
Актуальность проблемы
Интенсивное развитие методов анализа, основанных на использовании различных флуоресцентных меток, сделало их одними из важнейших экспериментальных методов во многих научных дисциплинах. В частности, их применение в биотехнологии и медицине привело к появлению и развитию методов, облегчающих изучение живых клеток и клеточных структур, фундаментальных клеточных процессов и методов регистрации биоспецифических взаимодействий, находящих применение в медицинской диагностике и разнообразных биологических анализах.
В последние годы интенсивно разрабатываются подходы к визуализации процессов на уровне клеток, тканей и целых организмов, основанные на введении специализированных флуоресцентных меток. Одними из наиболее перспективных меток нового поколения являются флуоресцентные полупроводниковые нанокристаллы (НК), состоящие из элементов групп II-VI, III-V и имеющие структуру ядро/оболочка.
Полупроводниковым НК присущи два основных достоинства, отличающие их от органических флуорофоров: 1) широкий диапазон узких полос флуоресценции, положение которых зависит от диаметра НК и является управляемым параметром при возможности возбуждения излучением с одной длиной волны; при этом длина волны возбуждения может варьироваться для получения максимального отношения сигнал/шум с учетом конкретного изучаемого объекта; 2) высокая фотостабильность НК, в 100-4000 раз превышающая фотостабильность лучших органических флуорофоров. Такие свойства делают НК перспективными флуоресцентными биомаркерами в анализах, основанных на биоспецифическом взаимодействии «лиганд-рецептор» в разнообразных in vitro и in vivo биоаналитических системах, в которых использование традиционных органических флуорофоров ограничено недостаточной фотостабильностью и невозможностью одновременной регистрации в многопараметрических (многоцветных) системах. Кроме того, такие НК весьма перспективны для создания новых флуоресцентных сенсоров, действие которых основано на использовании эффекта резонансной передачи энергии (FRET-эффект). Химический анализ многокомпонентных смесей, в частности, детектирование наличия в смеси определенных ионов металлов, биологических соединений и т.д., и анализ ряда физических параметров, таких как рН, электрохимический потенциал, температура в наномасштабных областях также является потенциальной областью применения данных сенсоров.
НК состава CdSe/ZnS с диаметром 2-6 нм, используемые в данной работе, являются альтернативой органическим флуоресцентным меткам, традиционно применяемым в биотехнологии и медицине благодаря высокой яркости, возможности регистрировать флуоресценцию по всему оптическому диапазону и доступности. Оболочка из широкозонного полупроводника ZnS предохраняет флуоресцирующее ядро от влияния окружения и позволяет получить НК с квантовым выходом до 70%.
Одной из основных проблем использования таких флуоресцентных НК является трудность получения биосовместимых, легко конъюгируемых с биологическими молекулами флуоресцентных комплексов на их основе, что ограничивает их применение в медицине и биотехнологии в качестве эффективных флуоресцентных биомаркеров и сенсоров. Для решения указанной проблемы в настоящей работе разработан ряд способов модификации и функционализации поверхности НК, а также иммобилизации НК в полимерные матрицы для создания высокоэффективных и специфичных флуоресцентных биомаркеров и продемонстрированы примеры их использования в таких видах биоанализа, как реакция латексной агглютинации (РЛА), проточная цитофлуориметрия, для визуализации клеток и клеточных рецепторов.
Цели и задачи работы. Цель работы заключалась в разработке серии специфичных, биосовместимых, флуоресцентных аналитических реагентов, содержащих флуоресцентные полупроводниковые НК для биотехнологии и их тестировании в биоаналитических методах.
В рамках данной работы были поставлены следующие задачи:
Исследование свойств НК в конденсированных средах.
Создание модифицирующих слоев на поверхности НК из синтетических и природных полимеров двумя способами:
1) модификацией поверхности НК бифункциональными тиолсодержащими молекулами путем замещения три-н-октилфосфиноксида (ТОФО), стабилизирующего НК в процессе синтеза, с последующим формированием изолирующего слоя из молекул биополимеров (полипептидов, полисахаридов и т.д.);
2) формированием полимерного слоя вокруг НК посредством гидрофобных взаимодействий c амфифильными полимерами без удаления молекул ТОФО с поверхности НК.
Разработка методов включения полупроводниковых НК в полимерную матрицу из синтетических (гомо- и сополимеры акролеина) и природных (наночастицы на основе этилцеллюлозы) полимеров;
Получение флуоресцентных реагентов и демонстрация возможностей их использования путем тестирования в биоаналитических методах.
Разработка методики получения пленок гидрофилизированных НК с двумя различными максимумами флуоресценции на поверхности оптических стекол - прототипов FRET-зондов для сканирующей ближнепольной оптической микроспектроскопии.
Научная новизна и практическая ценность работы
Исследованы свойства и поведение гидрофобных НК в конденсированных средах на примере пленок с различной концентрацией НК. Экспериментально установлены оптимальные и предельные концентрации НК в конденсированных средах, при которых не происходит падения квантового выхода и красного сдвига флуоресценции.
Разработаны способы получения флуоресцентных наноразмерных частиц в диапазоне диаметров 5-80 нм, коллоидно устойчивых в водных средах, содержащих функциональные группы путем модификации НК синтетическими и природными полимерами.
Разработаны методы получения флуоресцентных полимерных микросфер, содержащих полупроводниковые НК для различных вариантов биоанализа, которые характеризуются:
однотипной полимерной матрицей на основе гомо- и сополимеров акролеина с поверхностными функциональными группами;
широким диапазоном размеров частиц (100-500 нм) и узким распределением частиц по размерам;
коллоидной и химической стабильностью в широком диапазоне рН и физиологических жидкостях;
возможностью введения НК с различными длинами волн испускаемой флуоресценции, а также смесей НК для осуществления многоцветного оптического кодирования полимерных дисперсий;
фотостабильностью и высоким квантовым выходом;
возможностью возбуждения различных длин волн испускаемой флуоресценции одним монохроматическим источником;
единообразным протоколом иммобилизации белковых молекул на поверхности полученных полимерных флуоресцентных миикросфер.
Показана возможность введения НК в дисперсии частиц на основе полимеров природного происхождения на примере наночастиц из этилцеллюлозы.
Разработаны методики получения биоаналитических реагентов путем иммобилизации различных биологических объектов на частицы водных дисперсий НК, а также на полимерные микросферы, наполненные НК.
Продемонстрированы примеры использования данных флуоресцентных биореагентов в таких видах анализа, как РЛА, проточная цитофлуориметрия, для иммунофлуоресцентного мечения и визуализации клеток и клеточных рецепторов.
Разработана методика получения пленок гидрофилизированных НК с двумя различными максимумами флуоресценции на поверхности оптических стекол - прототипов FRET-зондов, обладающих воспроизводимыми флуоресцентными свойствами и высокой трибологической устойчивостью.
Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на страницах и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы, включающего ссылок. Диссертация содержит рисунков и таблицы.
Апробация работы. Основные материалы диссертации были доложены на международной конференции «Лазерная физика и оптические технологии» (Гродно, Белоруссия, 2006), Международной конференции по нанобиотехнологии NACBO (Урбино, Италия, 2006), Российской школе-конференции молодых ученых «Биосовместимые наноструктурные материалы и покрытия медицинского назначения» (Белгород, 2006), III Международной конференции по коллоидной химии и физико-химической механике (Москва, 2008 ), 5 московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2009).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано четыре статьи в рецензируемых журналах.
