Содержание к диссертации
Введение
Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ . 3
1.1. Влияние засоления почв на растения 10
1.2. Действие соли на точку роста растения 11
1.3 Сравнение действия хлоридного и сульфатного засоления на рост растений 12
1.4. Механизмы солеустойчивости у растений 15
1.5. Биохимические основы солеустойчивости 17
1.6. Солеуотойчивость у пшеницы
1.7. Регистрация флуоресценции хлорофилла, как тест на устойчивость к стрессам 26
1.8. Культура клеток и клеточная селекция на солеуотойчивость 28
1.9. Особенности культуры тканей и морфогенеза у мягких и твёрдых пшениц 35
Глава II. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
II.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
II. 1.1. Характеристика исходных сортов 40
II 1.2. Получение и поддержание культуры клеток пшеницы 42
11.1.2.1. Экспланты и среды 42
11.1.2.2. Определение интенсивности роста каллуса пшеницы 44
11.1.3. Условия регенерации растений и адаптация регенерантов в почве 44
11.1.4. Определение энергии прорастания семян 45
П.1.5. Анализ растений - ренерантов с помощью мето да замедленной флуоресценции 46
ІІ.2. РЕЗУЛЬТАТУ И ОБСУЖДЕНИЕ
11.2.1. Генотипические особенности формирования каллусной ткани у твердых и мягких пшениц 48
11.2.2. Влияние засоления на индукцию каллуса у твердой и мягкой пшеницы 57
11.2.3. Влияние генотипа на морфогенныи потенциал культивируемых тканей двух видов пшеницы 64
11.2.4. Влияние солевого стресса на пролиферацию каллуса у сортов твердой и мягкой пшеницы 72
11.2.5. Влияние солевого и осмотического стрессов на рост каллусных клеток пшеницы 77
11.2.6. Влияние света на рост каллусных тканей пшеницы в нормальных и стрессовых условиях 78
11.2.7. Клеточная селекция на устойчивость к засолению 82
11.2.8. Анализ растений-регенерантов 88
II.2.8.1. Оценка солеустоичивости сортов по энергии прорастания семян 90
11.2.8.2. Тестирование растений-регенерантов с помощью индукции каллуса в стрессовых условиях 97
11.2.8.3. Тестирование растении-регенерантов с помощью регистрации замедленной флуоресценции 102
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 107
ВЫВОДЫ
Глава III. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 112
- Влияние засоления почв на растения
- Характеристика исходных сортов
- Генотипические особенности формирования каллусной ткани у твердых и мягких пшениц
Введение к работе
Изменяющийся климат планеты, вызванный влиянием жизнедеятельности человека, ставит перед селекционерами задачи создания новых форм культурных растений, устойчивых к экстремальным факторам окружающей среды (засухе, засолению почв, низким температурам). Кроме того, возрастающие потребности в пище и потери земли из-за засоления вследствие орошения требуют создания высокопродуктивных и устойчивых форм культурных растений.
В последние годы активно развиваются исследования в области солеустоичивости во многих странах мира: США, Канаде, Англии, Индии, Мексике, Австралии, Саудовской Аравии, Сирии. Проводится отбор солеустойчивых образцов из мировой коллекции семян. Проводятся работы по локализации генов солеустоичивости на хромосомах, для чего создаются межвидовые гибриды и замещенные линии. Целью этих работ является повышение продуктивности растений для получения пищи, сырья и энергии в аридных и полуаридных зонах земледелия.
Использование устойчивых к засолению генотипов позволит вовлечь в сельскохозяйственную практику новые земли и снизить потери урожая от неблагоприятных климатических условий.
Пшеница - одна из важнейших зерновых культур в мире. На её долю приходится почти одна четверть из мирового пищевого продукта. В основном, культурные сорта пшеницы (особенно твердой) не обладают устойчивостью к засолению. Поэтому, изучение механизмов и повышение солеустоичивости пшеницы имеет не только теоретическое, но и практическое значение.
Одним иг путей для решения подобных задач может быть расширение арсенала методов повышения генетического разнообразия за счет применения культивируемых клеток растений. В настоящее время методами клеточной селекции уже созданы новые солеустойчивые формы люцерны, риса, томатов и других растений. Повышение устойчивости растений пшеницы к абиотическим стрессам позволит сократить потери урожая от воздействия неблагоприятных факторов окружающей среды.
Солеустойчивость у гексаплоидной пшеницы Triticum aestivum (геном АА ВВ DD) контролируется множеством генов, проявляющихся, как на клеточном уровне, так и на уровне целого растения. В работах Gorham с соавторами (1987) показано, что за контроль целого организма над транспортом ионов натрия в надземную часть побега у гексаплоидных пшениц отвечают гены расположенные в длинном плече хромосомы 4D. Тет-раплоидные пшеницы (Triticum durum L.), обладающие геномом ААВВ, лишены организменного механизма противостояния солевому стрессу вследствие отсутствия D генома. В этом случае на передний план выходят клеточные механизмы устойчивости. Поэтому изучение влияния солевого стресса на рост клеток твердых и мягких пшениц и селекция устойчивых к засолению клеточных линий с последующей регенерацией измененных растений приобретает не только теоретическое но практическое значение.
Методы культуры клеток для гексаплоидной пшеницы достаточно хорошо разработаны и уже применяются для создания исходных форм для селекции. Тетраплоидные пшеницы, до последнего времени были трудной культурой в биотехнологии. Исследователям удавалось получать каллусную ткань, которая через
- 7 -три-четыре месяца культивирования теряла способность к морфогенезу. Поэтому, создание системы для длительного культивирования клеток тетраплоидных пшениц и включения их в биотехнологический процесс является особенно актуальным.
Целью данной работы было создание новых форм твердой пшеницы и изучение особенностей ответа на солевой стресс на клеточном уровне у твердых и мягких пшениц.
Для достижения поставленных целей было необходимо:
разработать систему, позволяющую культивировать клетки твердых сортов пшеницы длительное время без потери ими способности к морфогенезу;
оценить вклад физиологического состояния исходного растения в поцесс формирования каллуснои ткани;
провести сравнительное изучение влияния солевого и осмотического стресса на формирование каллуснои ткани и рост уже сформированного каллуса у твердых и мягких сортов пшени-
отселектировать устойчивые к засолению клеточные линии и получить из них растения регенеранти;
провести лабораторную оценку растений-регенерантов.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Засоление почв является основной проблемой сельского хозяйства, лимитирующей рост и продуктивность растений во всем мире. 950 млн.га.используемых почв являются засоленными (Massaoud,1974) и 77 млн.га орашаются соленой водой (Epstein, 1980).
Все растения по их чуствительности к воздействию солей принято делить на две группы: галофиты и гликофиты. Галофиты - солелюбивы и устойчивы к высоким концентрациям солей. Гликофиты - солечуствительны. Большинство хоэяйственноважных растений - гликофиты. Таким образом получение растений и сортов, устойчивых к засоленности почв, является актуальной проблемой современного сельского хозяйства.
Было предложено несколько путей преодоления этой проблемы.
Во-первых, поиск уже существующих генетических солеус-тойчивых форм среди культивируемых и диких растений. Так например, злаки более чуствительны к засолению, чем подсолнечник и сахарная свекла (Bernstein, 1965). Значительные различия по отношению к засолению почв существуют внутри группы злаков: ячмень более устойчив, чем пшеницы (Bernstein, 1965, Maas and Hoffman, 1976 ) и гексаплоидные пшеницы более устойчивы, чем тетраплоидные (Ranа, 1986). Важные генотипические отличия были замечены у ячменя ( Ayers et al., 1952, Epstein and Norlyn, 1977), у мягкой пшеницы ( Asana and Kale, 1965 , Qureshi et al., 1980), у твердой гале-
- 9 -ницы ( Wenzien and Winslow, 1984) и у тритикале (Norlyn and Epstein, 1984). Такая внутривидовая вариабельность позволяет отбирать солеустойчивые генотипы и в дальнейшем использовать их в селекционной работе.
Во-вторых, получение резистентных к соли сортов из культуры клеток методами клеточной селекции. Широкий спектр видов был введен в культуру с целью селекции на солеустойчи-вость. Такие как табак (Benzel et al., 1985, Heyser and Nabors, 1981, Nabors et al., 1980, Pua and Thorpe, 1986 ), овес (Nabors, 1980), сорго (Bhaskaran et al., 1983, Bhaskaran et al., 1985), капуста ( Pua et al., 1986 ) люцерна (Smith and McComb, 1983), цитрусовые (Ben-Hayyim et al., 1985), сахарная свекла (Pua and Thorpe, 1986 ) и томаты (Rosen and Tal, 1981).
В-третьих, получение солеустойчивых линий методами генной инженерии . Введение чужеродных генов, определяющих устойчивость к соли, методами генетической трнсформации является наиболее эффективным способом получения солеустойчивых линий. Однако существует ряд проблем по изоляции генов, определяющих солеустойчивость. Но следует отметить, что для ряда растений, таких как рис и табак, методами генной инженерии уже получены солеустойчивые линии (Prakash and Padayatti, 1989, Keyetal., 1981, Kosugeetal., 1986, Rudlier et al., 1984).
На настоящий момент механизм солеустойчивости у растений остается неясным. Устойчивость может возникать как на клеточном уровне, так и быть связана с изменениями на физиологическом и анатомическом уровне целого растения.
1.1. Влияние засоления почв на растения.
Согласно Bernstain (1965) можно дать следующую классификацию воздействию соли на растение:
токсический (или ионный) стресс( вызывается поступлением в растение больших количеств ионов Na + или CI- )
осмотический стресс (который является результатом увеличения внешнего осмотического потенциала )
метаболический стресс (связанный в основном с замещением ионов К+ (Са++ и Mg++ ) на ионы Na+ .
Существуют три механизма адаптации растения к солевому стрессу (Levitt, 1980) .
- "запрещение": растение не допускает проникновения
стессового фактора в ткани.
толерантность : растение "позволяет" стрессовому фактору проникнуть в клетку, но при этом уменьшает его воздействие
устойчивость: стрессовый фактор проникает в клетку, вызывая воздействие, но растение более или менее предотвращает появление физических и химических изменений
Эффект солевого стресса зависит от целого комплекса факторов: от генотипа, от онтогенетической стадии, температуры, влажности, химического состава соли, уровня засоления, плодородия почв и условий выращивания.
1.2. Действие соли на точку роста растения.
Различные ткани растения по-разному реагируют на солевой стресс.
В работах Munns et al.( 1982) на ячмене и Taliesnik-Gartel et al (1983) на томатах было показано, что первопричина замедления роста наземных частей растения в условиях засоления NaCl находится в растущих тканях, а не во взрослых фотосинтезирующих тканях. При этом может наблюдаться прямое или косвенное ингибирование солями процессов клеточного деления и (или) роста делящихся клеток (Kulieva et al., 1975, Mansand and Nieman, 1978, Munns et al., 1983, Nieman, 1975, Setter, 1980). Так например было показано, что засоление оказывает влияние на митотическую активность (Akbar et al., 1987). Засоление (0.5% NaCl ) не влияло на митотический инднкс в корешках солеустойчивого сорта риса, в то время как у несолеустойчивого сорта митотическая активность значительно уменьшалась.
Соль может влиять на рост опосредованно, путем уменьшения притока в район роста метаболитов, воды и факторов роста ( Mass and Nieman, 1978, Munns et al., 1983 ). Количество продуктов фотосинтеза, поставляемых в район роста, уменьшается за счет как ингибирования фотосинтеза из-за закрытия устьиц ( Shoe and Gale , 1983),так и из-за прямого воздействия соли на фотосинтетический аппарат. Кроме того ингибиру-ется транспорт продуктов фотосинтеза по флоэме (Maas and Nieman, 1978 ).
Водный дефицит в районе роста может произойти в результате недостаточной осморегуляции или увеличения устойчивости
- 12 -к току воды ( Munns and Greenway, 1983, Ownbey and Mahal1, 1983 ) .У ячменя ингибирование роста вероятнее всего связано о водным дефицитом, а не с непосредственным влиянием ионов на метаболизм (Munns et al., 1982). Как было показано при сравнении солечуствительных и солеустойчивых сортов томатов наибольшее ингибирование роста стеблевых апексов происходило в результате неблагоприятного водного балланса, а не токсического действия ионов (Talainsnik- Gartel, 1983),
Maas и Nieman (1978) предположили, что ионы соли могут опосредовано разрушать клетки зоны роста путем блокирования синтеза необходимых веществ. Соль также изменяет клеточный и ядерный объем, индуцирует эндополиплоидию (Kulieva et al., 1975, Strogonov, 1970 ), ингибирует синтез нуклеиновых кислот и изменяет белковый синтез С Catarieno, 1970, Setter et al., 1982, Strogonov et al., 1970, Terenov, 1973 ). Однако в настоящее время еще следует определить, с чем связаны наблюдаемые изменения цитологической ультраструктуры и метаболизма . Связаны ли они с разрушениями клетки, вызванными воздействием соли или изменения в цитологии являются результатом адаптационных процессов.
1.3 Сравнение действия хлоридного и сульфатного засоления на рост растений.
Существующая литература по сравнению токсического воздействия хлоридных и сульфатных ионов на растение трудно поддается какой-либо систематизации и выявлению общих закономерностей, так как наблюдается большая вариабельность в устойчивости различных растений к сульфатному и хлоридному
- 13 -засолению. Более того реакция растения на засоление в значительной степени зависит от того, с каким катионом, натриевым, калиевым, кальциевым или магниевым, соеденены анионы С1~ и S04~2. (Eaton, 1942). Strogonov (1962) предположил, что "С1~" и" S04~m типы засоления отличаются по их эффекту на рост, развитие и водный балланс у растений.
Как было уже упомянуто выше токсичное влияние проявляется в разрушении плазмалеммы в результате проникновения в клетку хлорид- и сульфат анионов. Однако следует отметить, что растения отличаются по степени токсичного воздействия, оказываемого С1~ и S04-2 ионами. Так например,для сои и нута было показано, что проникновение ионов хлора вызывает большее разрушение мембраны, чем ионов сульфата (Leopold and Willing, 1984; Sharmaetal., 1990).
Однако для видов семейства Brassicaceae эквимолярные концентрации сульфат ионов были более токсичны, чем хлорид ионы (Paek et al., 1988). Для объяснения эффекта большего ингибирования сульфатами по сравнению с хлоридами авторами было предложено несколько гипотез.
Как было показано на примере пекинской капусты и фасоли ионы сульфата в значительно меньшей степени аккумулируются растением, чем хлорид ионы( Meiri et al., 1971).Таким образом в случае сульфатов концентрация ионов в тканевой жидкости будет меньше и, следовательно, увеличивается потеря воды и ингибируется прирост сырой массы. Другой причиной может являться то, что сульфат ионы могут вызывать дезбаллансиров-ку потенциала на мембране. Кроме того токсичное влияние сульфатов может быть результатом востановления сульфат ионов и их последующий метаболизм ( Reuveny and Filner, 1977).
Следует также отметить, что в случае сульфатного засоления наблюдались ионоспецифичные клеточные нарушения, такие как изменение балланса НА^/НАДФ* (цит по Paek et al.,1988) .
Сходные данные по более токсичному влиянию сульфата были получены на сорго (Weimberg et al., 1984) и пшенице (Bilsky, 1988). Причем для пшеницы была выявлена сортоспеци-фичность по чувствительности к сульфатному и хлоридному засолению (Bilsky, 1988).
Необходимо также подчеркнуть, что помимо непосредственного влияния хлорид- или сульфат иона на растение играет важную роль с каким катионом связаны эти анионы. В целом можно сказать, что моновалентные катионы оказывают больший токсический эффект, чем бивалентные.
Хотя разница между моновалентными катионами невелика, но наибольшее токсичное влияние вызывает засоление NH4CI и в меньшей степени хлориды Na и К. Среди бивалентных катионов М&СІ2 оказывают слабое влияние на мембрану, в то время как CaClg не вызывал никаких изменений (Leopold and Willing, 1984).
В основном для получения солеустойчивых линий в качестве стрессового фактора используют NaCl. Но было проведено несколько экспериментов по влиянию разных типов солей на рост каллуса. Было показано, что отселектированные клеточные линии люцерны устойчивые к NaCl,оказались чуствительными к засолению NagS04 , KCl, K2SO4 и к синтетической морской воде. В тоже время NaCl-устойчивая линия риса могла рости также и на среде с NaSC-4 , K2SO4 , KCl (Stavarek and Rains, 1983). Культура клеток цитруса, устойчивая к NaCl занимала несколько промежуточное положение: она была чуствительна к
- 15 -KC1, но устойчива к Na2S04 , K2SO4 , MgS04 (Kochba et al., 1982).
1.4. Механизмы солеустойчивости у растений.
Для описания механизмов солеустойчивости небходимо определить некоторые проблемы, связанные с семантическими различиями и ввести ряд определений (предположений). Во-первых, механизмы солеустойчивости на настоящий момент неизвестны, потому что собственно внешние признаки толерантности растения к соли не вскрывают полной качественной характеристики этого процесса, а лишь отражают внешние корреляции между размерами, процентом гибели и внешней засоленностью.
Во-вторых, термин "солевой стресс" трудно интерпретировать при описании механизма этого процесса, так как этот термин отражает взаимодействие растения с окружающей средой, которая только опосредованно связана с изменениями на уровне клеточного и организменного метаболизма.
В третьих, неправомочна сама классификация растении на "includers" и " excluders" , так как даже самые солечустви-тельные растения аккумулируют соль, в тех случаях, когда это возможно.
Таким образом в обзоре основное внимание будет обращено на собственно солевой метаболизм, как на часть специализированной проблемы физиологии макроэлементов.
При описании механизма солеустойчивости наиболее важным фактором является разделение осмотической и метаболитной роли ионов, вызывающих солевой стресс. В клетках листового ме-зофила подавляющая часть неорганических ионов сосредоточена
в вакуолях и отделена от цитоплазмы, чьи метаболические функции могут быть разрушены при попадании в нее ионов в средней (100мм") концентрации (Yeo, 1981, Flowers et al., 1977, WynJones et al., 1979 ) . Осмотический потенциал в цитоплазме баллансируется органическими веществами, такими как глицинбетаин, пролин и другие.(Pollard and WynJones, 1979 ).
Способность галофитов к регулированию транспорта ионов и росту в условиях высокого засоления является их отличительной чертой. И солеустойчивость у галофитов проявляется не на клеточном уровне, а на уровне целого растения.
Галофиты транспортируют большое количество (< ЗООмМ) ионов (Flowers et al., 1977 ), и для рода Beta было показано, что чем более солеустойчив сорт, тем больше он транспортирует ионов Na+ и 01" (Marschner et al., 1981).
Ионы Na+ и С1~ аккумулируются в клетке для осуществления осмотического потенциала и тургора. Такое накопление ионов может быть объяснено либо метаболитичеокой толерантностью, либо компартментизацией внутри клетки. В том случае, если ионы Na+ не включаются в клетку, то осмотический потенциал поддерживаться за счет ионов К+ в качестве катионов. Однако это не дает приимущества клетке, так как высокие концентрации К+ также являются ингибиторами роста, как и Na+.
У многих галофитов при выращивании их in vitro в присутствии NaCl в концентрациях равных содержанию соли в целом растении на 50% ингибируется активность клеточных ферментов (Yeo, 1983).
- 17 -1.5. Биохимические основы солеустойчивости.
Одним иг наиболее приемлимых объяснений ингибирования роста в условиях солевого стресса является " переключение энергии с процесса роста на процессы сохранения нативного состояния клетки (Nіeman ans Maas, 1978). Последние включают в себя регуляцию ионной концентрации в различных органах и внутри клетки, синтез органических веществ для осморегуляции и защиты макромолекул,а также для поддержания мембранных структур .
Yeo (1981, 1983) предположил, что энергетически более выгодным является осморегуляция по типу таковой у галофитов, то есть аккумуляция и компартметиэация ионов в вакуолях и накапление органических веществ в цитоплазме, чем осморегуляция только за счет органических веществ.
Осморегуцяция направлена на поддержание постоянства тургорного потенциала в клетке. Ранее считалось, что при солевом стрессе для роста клеток достаточным условием являлось сохранение постоянного тургорного потенциала. Однако Termaat и др. ( 1985 ) в опытах на пшенице и ячмене показали, что в условиях засоления для роста клеток наземных частей растения помимо механизмов, поддерживающих постоянное тургорное давление, необходимы еще и дополнительные факторы, поступающие от корней.
Было показано, что при условиях солевого стресса в цитоплазме резко увеличивается концентрация ряда метаболитов. К ним относятся редукционные сахара (Handa et al., 1983, Heyser and Nabors, 1981 ), органические кислоты (Handa et al., 1983), пролин и глицинбетаин ( Daines and Gould, 1985,
- 18 -Dix and Pearce, 1981, Handa et al., 1983, Watad et al.,1983).
Органические вещества, которые накапливаются при солевом стрессе в цитоплазме, выполняют роль осмотиков и поддерживают конформацию макромолекул в изменяющихся ионных условиях (Borowitzak, 1981, Wyn Jones and Gorham, 1980, Wyn Jones and Pollard, 1983).
Как было упомянуто выше в условиях солевого стресса происходит накопление в клетках пролина, особенно у соле-чуствитедьных сортов (Dix and Реагсе, 1981, Lu et al., 1989).Накопление пролина в цитоплазме может происходить либо в результате солевого стресса ( как побочный метаболит), либо при ответной реакции клетки на засоление, и тогда пролин выступает как осморегулятор для защиты клетки. В тоже время были получены несколько противоречивые данные: с одной стороны было показано, что накопление пролина не зависит от устойчивости к солевому и водному стрессу (Hanson et al., 1979), с другой - что накопление пролина в цитоплазме пря-мопропорционально солечуствительности сорта (Tal etal., 1979). Кроме того в пользу влияния пролина на клетки говорит и тот факт, что при добавлении пролина к культуре клеток, растущих на среде с солью, увеличивается рост и адаптация клеток.Это было показано для ряда видов растений (На- segawa et al.,1984, Katz and Tal, 1980, Pandey and Qanapathy, 1985, Rosen and Tal,1981, Kavikishor, 1990).
Помимо пролина увеличение роста культуры клеток в условиях солевого стресса наблюдается при добавлении в среду глицинбетаина и холина (Kavikishor, 1990).
Интересно отметить еще и тот факт, что синтез и аккуму-
- 19 -ляция глицинбетаина и пролина в растениях могут значительно варьировать как у видов, так и у сортов. Таким образом уровень накопления пролина и глицинбетаина может служить своеобразным индикатором солеустойчивости растения. Это особенно показательно для злаков (El Mekkaoui, 1990).
Кроме исследования влияния пролина и других низкомолекулярных соединений, проводились эксперименты по изучению изменения спектра и уровня синтеза белков в условиях солево-го стресса. Исседования спекра синтезируемых белков у культуры клеток табака и кукурузы показали, что при засолении он изменяется как количественно, так и качественно. Было выяснено, что практически во всех случаях адаптация к солевому и водному стрессу связана с синтезом белка, размером 26 кДа, названного осмотином (Ericson and Alfinto, 1984, Singh et al., 1985, King et al., 1986, Singh et al., 1989). Культивируемые клетки табака, растущие на среде с высоким содержанием NaCl и полиэтиленгликоля (ПЭГ) , синтезируют кроме того несколько новых полипептидов. В присутствии и NaCl, и ПЭГ наблюдается увеличение уровня синтеза полипептидов размером 43- и 62 кДа, которые не синтезировались в неадаптированных клетках. Однако их количество в клетке незначительно.
Во время адаптации растения к солевому стрессу в соле-чуствителькых клетках начинается активный синтез и накопление белка осмотина, что является как бы сигналом того, что клетка начала процессы адаптации к стрессу (Singh et al., 1985). В целом в солеустойчивых клетках синтез осмотина в 15 раз выше, чем у несолеустойчивых. При этом синтез осмотина у резистентных клеток происходит в течение всего цикла выращивания, в то время как у неадаптированных лишь во время сере-
-годины латфазы.
Интересным представляется также и тот факт, что синтез осмотина является универсальным ответом многих видов растений при солевом стрессе (Singh et al., 1989, Ramogopal, 1987).
Кроме того было показано, что аккумуляция осмотина, по всей видимости, является тканеспецифичной и больше накапливается в корнях, чем в наземных органах (King et al., 1980). Роль зтого белка, вероятно, связана с уменьшением водного потенциала в целом растении. В настоящее время проводятся дальнейшие исследования зтого белка: выделены мРНК и сДНК.
На настоящий момент данных о изменении ферментативной активности клеток в условиях солевого стресса немного. Однако показано, что при засолении у толерантных клеток риса по сравнению с нормальными наблюдается увеличение активности пероксидаз, катехлокоидаз и глутамин дегидрогеназ и уменьшение активности кислых фосфотаз (Subhashini and Reddy, 1990). На пшенице также было показано увеличение экзопептидазной активности у солеустойчивых сортов (Galiba et al., 1990).
Помимо измениения экспрессии генов и спектра белков при солевом стрессе, было показано, что в стрессовых условиях также изменяется горморальный балланс и влияние некоторых гормонов на клетку в период адаптации к соли.
В начале 70-х годов проводили исследования цитокинина, как возможного фактора, влияющего на рост растения в условиях засоленности (Ben-Zioni et al., 1967, Itai et al., 1968). Было показано, что при солевом стрессе уменьшается транспорт цитокининов из корней в побеги и в случае введения гормона экзогенно происходит уменьшение внешних признаков солевого
- 21 -стресса. Однако дальнейшие исследования по влиянию цитокини-на не подтвердили ранее полученных данных ( Ben-Zioni et al., 1974, Kirkham et al., 1974).
Извесно, что абсцизовая кислота подавляет рост клеток. Однако было также показано, что абсцизовая кислота влияет на адаптацию солечуствительных клеток к солевому стрессу. Абсцизовая кислота в концентрации 0.1 ммоль увеличивала рост неадаптированных клеток в условиях засоленности NaCl, NagS04 , KCl, K2SO4 - Однако у уже адаптированных клеток такой эффект увеличения роста наблюдался только в том случае, когда клетки пересаживались на среду с еще более высокой концентрацией соли. В случае же культивирования адаптированных клеток на среде без соли наблюдалось ингибирование роста. Кроме того следует отметить, что абсцизовая кислота не оказывала стимулирующего эффекта на рост неадаптированных клеток в том случае, когда водный стресс вызывается неионными факторами, такими как ПЭГ, сорбитол, маннитол и др. (La Rosa et al., 1985, Kavikishor, 1990).
В случае гибберелловой кислоты было показано, что предпосевная обработка семян увеличивает скорость их прорастания в условиях засоления (Parasher and Varma,1988).
1.6. Солеустойчивость у пшеницы.
Цитогенетические и биохимические исследования, проведенные Sears и Feldman (1981) выявили возможные пути эволюции гексаплоидных пшениц.
Явление солеустойчивости у пшениц связано с их геноти-пическими различиями, так как уже было упомянуто ранее, гек-
- 22 -саплоидные пшеницы более устойчивы к засолению, чем тетрап-лоидные (Rana, 1986).
Кроме того изучались различия в толерантности к условиям засоления как у самих гексаплоидных пшениц, так и у их исходных родительских форм .
Было показано, что диплоидные пшеницы Triticum шопососсшп (АА) более чуствительны к засолению, чем Aegilops searsii, являющийся донором В-генома, и тетрашюидная пшеница Triticum dicoccoides (ААВВ) более устойчива к соли.
Aegilops squarrosa, донор D-генома в геноме мягких пшениц, значительно более солеустойчив и вероятно поэтому Triticum aestivum является самым солеустойчивым видом из всех пшениц (цит. по Wyn Jones et al., 1984). Более поздними исследованиями было показано, что гены солеустойчивости как раз локализуются на хромосомах D-генома (Akbar et al., 1986, Azhar and McNeilly, 1988). Этим объясняется такая высокая солеустойчивость по сравнению с другими пшеницами, несодер-жащими в составе своего генотипа D- геном ( Gorham et al., 1987, Shah et al., 1987).
Кроме того следует отметить, что солеустойчивосить мягких пшениц значительно больше, чем у родительского вида Aegilops squarrosa. Это связано, по всей видимости, с тем, что, как было показано на синтетических генотипах, солеустойчивость D-генома возростает прямопропорционально плоид-ности пшениц (Munns et al., 1991).
Помимо представителей рода Aegilops, существуют более далекие родственники пшениц, виды рода Thinopyrum (Thinopyrum bessarabicum, Agropyron elongatum), которые характеризуются еще большей толерантностью к соли. Thinopyrum
- 23 -bessarabicum является дишюидом (2п-14) и его геном обозначается " J ". Были получены амфиплоиды пшеница / Th. bessarabicum (2n-56, AABBDDJJ), которые были значительно более устойчивыми к соли, чем родительская пшеница, и выдерживали засоление в 50 ммоль NaCl (Forster and Miller, 1985, Forster et al., 1987).
Помимо генотипа реакция пшеницы на соль зависит от химического состава солей. Некоторые сорта Triticum aestivum по-разному реагируют на хлоридное и сульфатное засоление почв.(Bilsky, 1988). В целом при эквимолярных концентрациях Na+, более токсичным для ганениц является S0-- ионы, чем ионы С1- ( Bilsky, 1988).
Концентрация соли более 120 ммоль является летальной для нормального роста и жизнедеятельности растения. Под действием солевого стресса у пшениц увеличиваются соотношение корневой и наземной систем, плотность устьиц, изменяется масса листьев. Кроме того уменьшается высота растения, процент массы сухого вещества, кустистость, количество зерен в колосе, количество колосков в колосе (Kemal-ur-Rahim, 1988, Eshan, 1986).
В случае солеустойчивых сортов пшеницы наоборот, наблюдается увеличение плошади листьев и повышенный рост корней по сравнению с нормой (Gupta and Srivastava, 1989).
Необходимо подчеркнуть, что устойчивость к соли на уровне прорастания семян не коррелирует с толерантностью целого растения. Для подтверждения этого было просканировано 18 различных сортов Triticum aestivum при условиях засоления 12 ммоль/см и 16 ммоль/см (Ojha and Bhargawa, 1988, Mass and Poss, 1989). Однако наблюдается зависимость между степенью
солеустойчивости растения и температурой окружающей среды. Hampson and Simson (1990) исследовали влияние температуры на прорастание семян пшеницы и рост побегов в условиях засоления. При отсутствии засоления не наблюдается изменение темпов прорастания семян при отклонении температуры от нормы ( 18 С- 22 С ). В условиях солевого стресса (-0.3 МРа) при выращивании семян ниже 10 С и выше 30 С проростание семян замедлялось или полностью прекращалось, в то время как в контроле при нормальной темпреатуре и аналогичном засолении не было зафиксировано изменений скорости прорастания семян. Такое влияние температуры на прорастание семян и рост побегов в условиях солевого стресса можно объяснить изменением проницаемости мембраны при действии температуры .
Солеустойчивость растений зависит от возраста и стадии развития. Засоленность среды (осмотический потенциал * -0.65 МРа) не полностью ингибировала , но значительно ( на 4 дня) затормаживала прорастание семян. Кроме того были проведены опыты по определению влияния солевого стресса на фазы развития растения. Было показано, что уменьшение урожайности вдвое происходило в том случае, когда растение находилось на стадии вегетации при условиях засоления s = -0.7 МРа, а в стадии репродудукции и созревания урожайность уменьшалась вдвое лишь в условиях двукратного засоления ( s = -1.55 МРа). Вышеигложенные данные были получены для сорта Probred ( Triticum aestivum). Аналогичные результаты были представлены и для сорта Aldura (Triticum turgidum ) (Mass and Poss, 1989 ).
Для пшениц наблюдалась строгая корреляция между содержанием ионов Na+ в листьях и урожайностью (Joshi et al.,
- 25 -1979). Аккумулирование ионов также зависит от генотипа. С присутствием D генома у пшениц связывают не только солеус-тойчивость, но и способность блокировать траспорт ионов Na+ к листьям С Gorham et al., 1987, Shah et al., 1987). Так были описаны сорта ( e.g. Aldura ), способные аккумулировать ионы Na+, и сорта неспособные аккумулировать эти ионы. Такая же зависимость от сорта растения была показана при аккумуляции ионов CI" ( Mass and Poss, 1989, Sharma, 1989). Для K+ было показано, что кроме того адоорбция ионов зависит еще и от той стадии развития, в которой находилось растение при условиях засоления: при вегетативной стадии, адсорбция К+ ингибировадась в большей степени, чем в стадии репродукции (Mass and Poss, 1989). При этом солеустойчивые сорта характеризовались небольшим содержанием ионов Na+ и С1~ и способностью к аккумуляции ионов К+ (Sharma, 1989).
Как известно, в целом у растений механизмы солеустойчи-вости связаны с повышенным клеточным синтезом органических соединений пролина и глицинбетаина. У пшениц также наиболее солеустойчивые сорта (e.g. Kharchia - 65) характеризуются высоким содержанием пролина и хлорофилла (Srivastava et al., 1988, Gupta and Srivastava, 1989). In vitro Galiba с сотр. (1990) было показано , что у солеустойчивых сортов пшеницы толерантность к соли связана с накоплением большого количества свободных аминокислот и полиаминов, низким содержанием белков и повышенной экзопептидазной активностью.
- 26 -1.7. Регистрация флуоресценции хлорофилла, как тест на устойчивость к стрессам.
Явление флуоресценции (ФЛ) хлорофилла было обнаружено Д.Брюстером в 1834 году. Первые спектральные изменения ФЛ листьев выполнены Стоксом в 1852 г. Однако вследствие слабой чувствительности фотопластинок в красной и ближней инфракрасной областях факт ФЛ хлорофилла подвергали сомнению вплоть изобретения флуоресцентного микроскопа в начале нынешнего века. В 30-е годы начато ситематическое исследование ФЛ в связи с установлением её зависимости от скорости фотосинтеза. Г.Каутский наблюдал визуально, что изменение ФЛ, возникающее после начала освещения растения, предварительно находящегося в темноте, связаны с известным ранее явлением задержки фотосинтеза в индукционный период, когда фотосинтетический аппарат приспосабливается к работе в условиях освещения. Флуоресценция - это один из путей рассеяния энергии, захваченной пигментом во время облучения. Поглотив квант света, молекула пигмента хлорофилла переходит из основного знергитического состояния (самый нижний энергитический уровень) в возбужденное , характеризующееся более высокой знер-гией. В возбужденном состоянии молекула существует 10 с. и за это время может растратить энергию несколькими путями.
Передает энергию возбуждения соседней молекуле пигмента. Такой процесс имеет место при передаче энергии от дополнительных пигментов (каратиноиды, ксантофиллы, хлорофилл Ь, фикобилины) к хлорофиллу а или от фокусирующей антенны в реакционном центре (РЦ).
Переходит в основное состояние, излучив энергию в
- 7 -виде кванта света - флуоресценции. Основным флуоресцирующим пигментом фотосинтетического аппарата (ФСА) является хлорофилл а.
Теряет энергию в виде тепла (безызлучательный переход).
Возбужденная молекула пигмента может передать энергию другой молекуле - акцептору (А). Образуется так называемый комплекс с разделенным зарядом. Этот процесс - первый этап консервации энергии возбужденной молекулой хлорофилла в электронтранспортной цепи. Процесс разделения заряда в фотосинтетическом аппарате совершают только особые формы хлорофилла, находящиеся в реакционном центре.
В настоящее время известно, что клеточные мембраны (и в частности мембраны хлоропластов) служат основным местом воздействия абиотического стресса на растение (Levitt,1980). Действие засоления на биологические мембраны может быть относительно таковым:
прямое действие ионов ( абсорбция ионов Na);
непрямое осмотическое действие соли: сильное снижение водного потенциала, индуцированное засолением приводит к дегидратации клеток и к увеличению концентрации растворенных компоненотов, что приводит к изменению клеточных мембран.
Так как сигнал флуоресценции напрямую связан с активностью мембран тилакоидов и флуоресценция может быть легко измерена, изменение кривой флуоресценции может служить хорошим индикатором изменения мембран хлоропластов в ответ на солевой стресс (Krause and Weis,1984; Schreiber and Bilger, 1985). Ингибирование флуоресценции осмотическим стрессом было изучено на многих видах растений (Keck and Воуег.1984;
- 28 -Govindjee et al,1981; Hetherington et al.,1982;Vertucci et al.,1985) включая пшеницу (Havaux and Lannoye,1985; Pastore et al.,1989). Кроме того, с помощью регистрации флуоресценции оценивали устойчивость к засухе у твердой и мягкой пшеницы (Havaux et al. 1988).
Smillie и Nott в 1982 году анализировали изменение сигнала флуоресценции под влиянием солевого стресса у сахарной свеклы (толерантной к засолению), бобов ( чувствительный вид) и подсолнечника ( промежуточный). При выращивании растений в сосудах и поливе раствором, содержащим 100 мМ NaCl они обнаружили, что интенсивность свечения снижалась как у чувствительных видов , так и у промежеточно толерантных видов. При этом у сахарной свеклы повышалась.Кроме того, снижение интенсивности свечения было обнаружено при изучении влияния засоления на виноград ( Dowton and Millhouse,1983). В работах El Mekkaoui et al. 1989 и Monneveux 1990 показано, что изменение интенсивности флуоресценции у сортов твердой пшеницы коррелирует и полевой устойчивость к засолению этих сортов. Кроме того, ими показано, что при тестировании на солеустойчивость правомерно использование как проростков, так и срезанных листьев,которые перед регистрацией флуоресценции инкубировали в 100 мМ растворе NaCl.
1.8. Культура клеток и клеточная селекция на солеустойчивость.
Культура клеток растений является важнейшим методом как в селекции сортов, так и в исследовании основных физиологических механизмов. Методы клеточной селекции дают возмож-
- 29 -ность скрининга больших популяций клеток в короткое время под четким контролем селективных условий культивирования. Относительная дедифференцированность клеток в культуре резко понижает трудности связанные с наличием определенных онтогенетических стадий.
Генетическая вариабельность, наблюдаемая в культуре клеток, называется самоклональной вариабельностью. В основе самоклональной вариабельности клеточной культуры лежит существующая спонтанная или природная мутабильность, а также влияние среды культивирования ( 2,4 Д, ИУК ). Кроме того для повышения уровня мутагенеза могут быть использованы химические мутагены.(Larkin and Scowcroft 1983,De Paepe 1982, Dhillon 1983)
В клеточной селекции для того, чтобы мутантные клетки, обладающие заданным фенотипом, стали доминировать в клеточной популяции, необходимо довольно длительное время культивирования (10- 12 поколений). При этом у клеток может теряться способность к морфогенезу. Сохранение морфогенного потенциала каллуса в процессе клеточной селекции является основной задачей при получении устойчивого регенеранта. Помимо этого важной остается проблема наследуемости необходимого признака и его экспрессии. Кроме того растение-регенерант помимо приобретенного хозяйственно-полезного признака должно обладать всеми характеристиками исходного донорного сорта.
Обоснованием использования культуры тканей для повышения солеустойчивости данного растения является существование общих механизмов, действующих как в культуре клеток, так и на уровне целого растения.
По типу взаимодействия "клетка-целый организмирастения
- зо -можно поделить на две группы.
К первой группе относятся те растения, у которых не наблюдается корреляции между механизмами солеустоичивости in vitro и in vivo (Atriplex undulata, Salicornia herbacia, Salicornia austrai) (Strogonov, 1973; Smith and McComb, 1981). В этих случаях воздействие засоления на культивируемые клетки имеет мало общего с солеустойчивостыо на уровне целого растения. У этих видов существует комплексный механизм солеустоичивости на уровне систем органов, который разрушается в процессе дедифференциации в культуре клеток.
Вторую группу составляют те растения, у которых существует связь между механизмами солеустоичивости на клеточном уровне и уровне целого организма ( дикие виды томатов, рожь,фасоль,свекла,ячмень,люцерна)(Tal et al.1978,1980; Orton 1980; Smith and McComb 1981). При этом наблюдаются общие клеточные механизмы толерантности, не зависящие от уровня клеточной организации, включающие в себя ионные насосы» изменение проницаемости мембраны и регуляции синтеза органических веществ.Эти признаки и используются при селекции клеточных линий на устойчивость к солевому стрессу.
В настоящее время существует немало работ по получению солеустоичивых линий методами клеточной селекции. В качестве селектирующего агента обычно используют NaCl. Впервые соле-устойчивая линия, способная расти на 1% NaCl была получена у Nicotiana silvestris ( Zenk, 1974 ). Необходимо отметить, что при получении солеустоичивых растений существуют два критических момента: 1) регененация растений из солеустойчи-вой культуры клеток 2) сохранение резистентности растений в последующих поколениях.
Впервые лишь в 1980 году был получен регенерант из культуры клеток Nicitiana tabacum, устойчивый к высоким концентрациям хлорида натрия с полигенным наследованием этого признака (Nabors et al. 1980). К настоящему времени получены растения регенеранты из устойчивых клеточных линий риса, наследующие признак устойчивости (Kim et al.1988, Subhashini,Reddy 1990,Narayanan,Sree Ragasamy 1989).
Другие примеры выделения клеточных линий,устойчивых к различным концентрациям хлорида натрия представлены в таблице.
Культура % примечание источник
селективного фактора
Огуга sativa
Oryza sativa
Medicago
sativa Medicago 1% NaCl
sativa
1-2% NaCl получены соле-устойчивые ре-гененанты
1% NaCl соле-и морозо
устойчивые линии клеток
1% NaCl каллус
регенерант
Kim et al.,1988, Subhashini,Reddy 1990; Narayanan, Sree Rangasamy 1989.
Dekeyser et al., 1987,
Croughan et al., 1978.
Winicov,1990. Мезенцев,1982.
Nicotiana 0,5% NaCl tabacum
NagS04
Lycopersicon NaCl esculenturn
Citrus NaCl
sinensis Citrus
aurantium
суспензия, регенерант уст. регенерант
уст. регенерант регенерант
каллус, суспензии
каллус, суспензия уст. per,
регенерант
регенерант
регенерант
Мазин, 1989.
Nabors et al.,
1975, 1980.
Kononowicz et al.,
1990.
Watad et al.,
1983.
Pua and Thorpe
1986.
Dix and Street,
1975;Zenk,1974
Ошмарина 1982
Dix and Street,
1975.
Tyagi et al.,
1981.
McHughen and
Swartz, 1984;
Mchughen and
Rowlands, 1988.
Rahman and Haul,
1989;
Garcia-Reina
et al. Д988
Kochba etal.,
1982;Ben-Hayyim
and kohba.1982;
Ben-Hayyim and
Goffer,1989.
В процессу проведения клеточной селекции и последующего получения солеустойчивых регенерантов существует ряд трудностей. Во-первых, полученные резистентные каллусы при пассировании в течении некоторого времени на неселективной среде и последующей повторной пересадкой на среду с селективным агентом могут вести себя двояко: 1) устойчивость каллусов может теряться (в том случае, когда клетки лишь физиологически адаптировались (Chandler et al,1989,Hasegawa et al.!980,Handa et al.1982); 2) солеустойчивость каллусов сохраняется, когда были отобраны истинно генетически резистентные формы табака, люцерны, цитрусов, риса, томатов,льна (Zenk 1974,Dix and Street 1975,Croughan et al.l978,Nabors et al,1980,Wataad et al. 1983, Kohba et al. 1982,Ben-Hayyim and Goffer 1989,Subhashni and Reddy 1989,1990;Ben-Hayyim and Zelcev 1990, Mc Hughen and Rowland 1988).
Наиболее подробный анализ солевыносливых линий табака проведен группой Р.Брессана (Bressan et al.,1985; Hasegawa et al.,1986). Ими показано, что при селекции к умеренным концентрациям хлорида натрия (0,17М) обнаруживается исключительно феномен обратимой адаптации. В то же время селекция к высоким концентрациям (0,43М) позволяет получать клеточные линии, характеризующиеся как нестабильной, так и
- 34 -стабильной толерантностью. Причиной нестабильной обратимой адаптации клеток к NaCl, очевидно, является физиологическая адаптация, обусловленная изменением экспрессии генов.
Вторая трудность в получении солеустойчивых регенеран-тов связана с последующей регенерацией растений из истинно резистентных каллусов. В этом случае также,полученные регенеранти могут либо сохранять, либо не сохранять признак со-леустойчивости. Солеустойчивость при регенерации из толерантной клеточной линии может теряться в том случае, когда механизмы устойчивости на клеточном уровне не обеспечивают устойчивости целого растения.
Следует еще отметить одну интересную закономерность. Солевыносливость растений удается также повысить в результате селекции к одному фактору засоления - осмотическому стрессу. Например, клетки томата, адаптированные к водному стрессу, индуцированному полиэтиленгликолем, обладали повышенной устойчивостью к NaCl (Bressan et al., 1981). Повышенная толерантность к соли обнаружена у клеточных линий моркови, отобранных на среде, содержащей в качестве неути-лизируемого осмотика в высокой концентрации (99 - 870 мМ) маннитол (Harms, Oertly, 1985). Из этих результатов следует, что адаптация клеток к осмотическому срессу применима для отбора солевыносливых вариантов, а исследования подобного рода представляют интерес для изучения стрессовых эффектов различных компонентов засоления как во взаимодействии, так и независимо друг от друга.
Хотя в большинстве случаев для селекции in vitro солевыносливых растений используется прямая селекция с применением каллусных и суспензионных культур, по-видимому, с не-
- 35 -меньшим успехом может быть использована культура изолированных протопластов. Так же, как показали предварительные результаты (Tonnelli et al.,1986), получение солевыносливых форм растений возможно через сомаклональную изменчивость селекцию на устойчивость к аналогам аминокислот и химический мутагенез (Widholm,1987; Дридзе,1990).
Основываясь на представленных данных , можно заключить, что привлечение методов клеточной инженерии в селекцию пшеницы для получения исходных форм, обладающих признаками устойчивости к засолению или водному стрессу, может быть весьма перспективным.
1.9. Особенности культуры тканей и морфогенеза у мягких и твёрдых пшениц.
Как уже отмечалось, культура клеток гексаплоидной пшеницы достаточно хорошо разработана. Из многих сортов получают каллусные ткани с высоким морфогенным потенциалом, который сохраняется после длительного культивирования. Получено большое количество сомаклональных вариантов, среди которых встречаются такие, которые по своим хозяйственно-важным признакам превосходят исходный сорт ( Larkin 1983, Heyser 1985, Rajyalakshmi 1988, Hunsinger 1987, Nabors 1987, Carver B.F.& Johnson 1989, Еаттатхотам 1991 ). Моносомныи анализ эффективности культуры тканей пшеницы показал, что хромосомы группы 2 играют главную роль в детерминации высокой эффективности культуры тканей. Кроме того, идентифицированы гены модификаторы, которые локализуются на хромосомах 7В (повышает perенерационную способность),6А, ЗВ, 5В, 5D, 6D (снижают
- 36 -регенерационную способность). Предполагают, что длинное плечо хромосомы 2D несет главный ген (или гены) ответственный га реализацию признака способности к развитию в культуре in vitro (TCR-ген), а на хромосомах 2 А (длинное плечо) и 2В (короткое плечо) локализованы малые TCR-гены, влияющие на рост и регенерацию каллусных клеток пшеницы (Kaleikau et al 1989а, Kaleikau et al. 19896).
Замещение 4B хромосомы в геноме Чайниз Спринг на гомологичные хромосомы из других сортов значительно увеличило морфогенез и регенерацию побегов ив каллусов. Причем проявляется сортоспецифичность эффективности гомологичных хромосом по способности к индукции и пролиферации каллуса (Higgins 1987, Mathias and Fukui 1986).
В культуре тканей твёрдых пшениц методы культивирования клеток и дальнейшая регенерация разработаны недостаточно и успехи в методах длительного культивирования с сохранением морфогенного потенциала практически отсуствуют.
Впервые получена регенерация из твёрдых пшениц при применении в качестве экспланта мевокотиля (Bennici 1978, 1979; D'Amato 1980, Lupi 1981), основания листа (Greco 1984), зрелых зародышей (Еареп 1982). По мнению автора (Lupi 1981) регенерация происходит главным образом, через соматический эмбриогенез. Частота регенерации варьировала в зависимости от генетипа и типа кадлусной ткани. Количество регенерантов полученных из одного мезокотиля составляло 1 и реже 2 растения. При культивировании зрелых зародышей (Еареп 1982) растения - регенеранты были получены только из первичного каллуса и регенерация шла через образование почек в количестве 10 - 12 растений на каждую каллусную линию.
Изучена динамика формирования каллуса и органогенез у сорта твёрдой пшеницы из незрелых зародышей ( полевые растения ) на различных стадиях развития зародышей (от 9 до 21 дней после опыления - Bennici 1988). Индуцированный камус не обладал высокой пролиферативнои спасобностью не смотря на испытанные различные концентрации регуляторов роста. Через 4 месяца каллус полностью терял способность к морфогенезу.
В работе Tanzarella 1988 предпринята попытка клопального размножения нескольких сортов твердой пшеницы. Экспланта-ми служили незрелые зародыши. На среде, содержащей 5 мг/л 6-БАЛ в первые два месяца культивирования было получено от 1 до 7 дополнительных побегов в зависимости от генотипа. Дальнейшее культивирование приводило к гибели или образованию аномальных побегов.
Быстрая потеря морфогенного каллуса и способности к регенерации у твёрдых сортов пшеницы объясняется высокой нестабильностью кариотипа культивируемых клеток ( Еареп 1982). Подавляющие большинство perенерантов полученных из мезокоти-ля твёрдых пшениц были химерными: состояли из эуплоидных (чаще диплоидных, реже тетраплойдных) и анеуплоидных ( чаще гиподиплоидных реже гипердиплоидных) клеток (Lupi 1981). Такое состаяние сохранялось в течение развития растений до стадии формирования соцветий. Элиминация эуплоидных клеток совершилась до начала процесса мейоза, так как цитологические исследования, проведенные на гаметах, показали , что они имеют нормальный диплоидный набор хромосом ( 14 бивалентов ) без нарушений.,
Были использованы ряд видов пшеницы - Т. monococcum (АА), Т. longissimum (SLSL ), Т. speltoides ( SS ), Т.
- 38 -tauschii ( DD), Т. turgidum С AA BB ), T. timopheevii ( AA GG ), T. aestlvum ( AA BB DD ) в изучении индукции и дифе-ренциации каллуса иг незрелых осей соцветия, семян, и зародышей. Каллусогенев и поддержание ткани длительное время (до 20 месяцев) шло с некоторыми успехами при использовании незрелых осей соцветия для тетраплоидных пшениц. Наблюдали ри-зогенез в процессе культивирования ткани от 6 до 10 месяцев
Данные по регенерации в этом случае не приводятся, (Gosch-Wackerle - 1979)
Цитологические исследования, проведённые на каллусных клетках твёрдых пшениц ( Бабаева 1993 ) показали падение ми-тотического индекса в процессе культивирования. Так, у мор-фогенного каллуса твёрдых пшениц в процессе культивирования на третий день митотический индекс составил 3,3-5,4 . К шестому дню он падал до 2,1% и сохранялся на этом уровне в течение 30 дней. К 90 дню культивирования митотический индекс снижался до 0,3 , что указывает на падение интенсивности пролиферации каллуса и тем самым на потерю морфогенной способности.
Успешный каллусогенез и регенерация получены из незрелых зародьшей сортов пшениц Т. turgidum L. var durum после 90 дней культивирования ( Hagemann 1988).
В работах Шаяметова ( 1988) на культуре незрелых зародышей яровых твёрдых пшениц наблюдали высокую спасобнооть к индукции каллуса. Так у сортов Безенчукская 139, Светлана, Cocorit - 71, Харьковская 46 индукция каллуса достигала 96%. Но частота индукции морфогенного каллуса у сорта Безенчукская 139 составила только 12%, а у других сортов твёрдой пшеницы это было до 27%. Основное количество регенерантов полу-
- 39 -чили только из первичного каллуса (у Безенчукская 139 получены 22 регенерантов из 22 клеточных линий, которые в основном были стерильными). Дальнейшее культивирование каллусного материала приводило к резкому снижению частоты образования змбриогенных зон.
Таким образом, разработка системы, способствующей вовлечению сортов твердой пшеницы в биотехнологический процесс, на наш взгляд, чрезвычайно актуальна. Длительное культивирование в системе in vitro, клеточная селекция на солеустойчи-вость, регенерация растении из устойчивых клеточных линий -все это будет способствовать увеличению генетического разнообразия и созданию форм, обладающих хозяйственноценными признаками.
Основываясь на литературных данных, мы решили использовать метод фиксации замедленной флуоресценции для лабораторного тестирования на солеустойчивость растений-регенерантов, полученных после клеточной селекции, а также тех регенерантов, которые получены на промежуточных этапах биотехнологического процесса. Работа проводилась на кафедре биофизики МТУ на установке любезно предоставленной нам Маториным Д.Н. и Кренделевой Т.Е.
Влияние засоления почв на растения
Согласно Bernstain (1965) можно дать следующую классификацию воздействию соли на растение:
- токсический (или ионный) стресс( вызывается поступлением в растение больших количеств ионов Na + или CI- )
- осмотический стресс (который является результатом увеличения внешнего осмотического потенциала )
- метаболический стресс (связанный в основном с замещением ионов К+ (Са++ и Mg++ ) на ионы Na+ .
Существуют три механизма адаптации растения к солевому стрессу (Levitt, 1980) .
- "запрещение": растение не допускает проникновения стессового фактора в ткани.
- толерантность : растение "позволяет" стрессовому фактору проникнуть в клетку, но при этом уменьшает его воздействие
- устойчивость: стрессовый фактор проникает в клетку, вызывая воздействие, но растение более или менее предотвращает появление физических и химических изменений
Эффект солевого стресса зависит от целого комплекса факторов: от генотипа, от онтогенетической стадии, температуры, влажности, химического состава соли, уровня засоления, плодородия почв и условий выращивания.
Действие соли на точку роста растения.
Различные ткани растения по-разному реагируют на солевой стресс.
В работах Munns et al.( 1982) на ячмене и Taliesnik-Gartel et al (1983) на томатах было показано, что первопричина замедления роста наземных частей растения в условиях засоления NaCl находится в растущих тканях, а не во взрослых фотосинтезирующих тканях. При этом может наблюдаться прямое или косвенное ингибирование солями процессов клеточного деления и (или) роста делящихся клеток (Kulieva et al., 1975, Mansand and Nieman, 1978, Munns et al., 1983, Nieman, 1975, Setter, 1980). Так например было показано, что засоление оказывает влияние на митотическую активность (Akbar et al., 1987). Засоление (0.5% NaCl ) не влияло на митотический инднкс в корешках солеустойчивого сорта риса, в то время как у несолеустойчивого сорта митотическая активность значительно уменьшалась.
Соль может влиять на рост опосредованно, путем уменьшения притока в район роста метаболитов, воды и факторов роста ( Mass and Nieman, 1978, Munns et al., 1983 ). Количество продуктов фотосинтеза, поставляемых в район роста, уменьшается за счет как ингибирования фотосинтеза из-за закрытия устьиц ( Shoe and Gale , 1983),так и из-за прямого воздействия соли на фотосинтетический аппарат. Кроме того ингибиру-ется транспорт продуктов фотосинтеза по флоэме (Maas and Nieman, 1978 ).
class2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ class2
Характеристика исходных сортов
Выведен в Куйбышевском НИИСХ методом однократного- индивидуального отбора из гибридной популяции ( Гордеиформе 10 х Леукурум Б-40) х Харковская 46) Районирован с 1982г. Авторы: В.Д. Артамонов, А.И. Карпова.
Ботаническая характеристика: разновидность гордеиформе, колос остистый красный, чешуи неопушенные, верна белые.
Колос призматический, средней плотности (на 10см. длины стержня 25-S8 колосков). Ости зазубренные, почти в два раза длиннее колоса, параллельны колосу или слаборасходящи-еся. Колосковые чешуи овальноланцетовидной формы. Зубец колосковой чешуи короткий (до 2 мм.). Цветковые чешуи плотоно охватывают зерно и предохраняют его от осыпания. Зерно стекловидное белое овальное с мелкой бороздкой, средней крупности и крупное. Масса 1000 зерен 36-45г.
Стебель, листья, форма куста: соломина высокая (113-131см.) прочная, лист зеленый с очень слабым опушением, куст прямостоячий.
Хозяйственно ценные признаки: сорт среднеспелый, устойчив к полеганию и засухе. Пыльной головней поражается в средней степени, бурой ржавчиной-слабо. Макаронные качества отличные. Сорт урожайный. На Шортондинском-сортоучастке Целиноградской обл. в 1978г получено 46.5 ц/га. В Казахстане районирован в Кокчетавской, Павлодарской и Целиноградской областях.
Сорт яровой твердой пшеницы селекции КазНИИЗХ им. Бараева, передан на ГСИ в 1990 году, выведен методом гибридизации от скрещивания:гибрид 491 х Алмаз; разновидность леу-курум, относится к среднеспелому типу созревания. Устойчивость к бурой и стеблевой ржавчинам (искусственное заражение) средняя и находится на уровне стандарта Безен-чукская 139.
Поражаемость пыльной головней в три раза меньше стандарта (6,1% и 5,3%)
В естественных условиях ржавчиной и головней практически не поражается.
По повреждаемости скрытоетебельными вредителями на провакационном фоне на уровне стандарта. Крупнозерный, масса 1000 зерен 42,1 г., стекловидность 80%, натура зерна 785 г/л. Зерно белое, средней крупности, овально-удлиненной формы.
Сорт отличается ускоренным темпом развития от всходов до кущения и замедленным ростом от кущения до колошения. Вегетационный период 82 дня.
Сорт яровой мягкой пшеницы Ишимская 90 выведен в КазНИИЗХ им. А.И. Бараева методом массового отбора из гибридной популяции F ( Пиротрикс 28 х Саратовская 48 ) х Саратовская 29. Передан на ГСИ в 1990 году.
Генотипические особенности формирования каллусной ткани у твердых и мягких пшениц
Солеустойчивость у гексаплоидной пшеницы Triticum aestivum (геном AABBDD) контролируется множеством генов, проявляющихся, как на клеточном уровне, так и на уровне целого растения.В работах Gorham с соавторами(1986,1987,1990) показано, что ва контроль целого организма над транспортом ионов натрия в надземную часть побега у гексаплоидных пшениц отвечают гены расположенные в длинном плече хромосомы 4 D. Тетраплоидные пшеницы (Triticum durum L.), обладающие геномом ААВВ, лишены организменного механизма противостояния солевому стрессу вследствие отсутствия D генома. В этом случае на передний план выходят клеточные механизмы устойчивости.
Как уже отмечалось, работа по культуре клеток твердых пшениц сопряжена о определенными тудностями. Многие исследователи отмечают, что не удается культивировать каллусную ткань, полученную иэ незрелых зародышей дотаточно долго без потери ею способности к морфогенезу.Поэтому, в своей работе мы особое внимание уделили первым этапам обрагования и культивирования каллуса и проанализировали влияние генетических и физиологических факторов на процесс формирования каллусной ткани.
Под влиянием 2,4 Д ткани незрелого зародыша начинают неорганизованно делиться, образуя каллусную ткань. Чаще всего каллусная ткань бывает неоднородной и состоит из рыхлых, водянистых участков и более плотных, структурированных тканей с выраженными меристематическими очагами. При сравнении морфологии каллуса твердой и мягкой пшеницы мы обнаружили, что морфогенные каллусные ткани твердых сортов пшеницы более плотные имеют более насыщенный желтый цвет. (Фото 1 и 2) Результаты оценки морфогенного потенциала в конце нулевого пассажа представлены в таблице 2.
