Введение к работе
Актуальность темы. Проблема возникновения и распространения устойчивости к бета-лактамным антибиотикам у клинически значимых видов микроорганизмов имеет чрезвычайно важное значение, поскольку бета-лактамы являются наиболее часто используемыми препаратами для лечения бактериальных инфекций (Rolinson, 1998). У грамотрицательных микроорганизмов известно несколько механизмов резистентности к бета-лактамным антибиотикам, однако основным из них является продукция бета-лактамаз - ферментов, катализирующих реакцию гидролиза бета-лактамного кольца, в результате чего антибиотик теряет свою антибактериальную активность (Livermore, 1995).
В настоящее время внимание исследователей привлечено к изучению трех основных групп бета-лактамаз, относящихся к молекулярному классу А - ТЕМ, SHV и СТХ-М (Bradford, 2001; Pitout, 2008). Благодаря плазмидной локализации генов распространение этих групп ферментов среди возбудителей инфекционных заболеваний человека приняло угрожающий характер. Ферменты групп ТЕМ и SHV являются производными классических пенициллиназ ТЕМ-1 и SHV-1 и отличаются от них наличием от одной до нескольких единичных аминокислотных мутаций, что является результатом однонуклеотидного полиморфизма (ОНП) кодирующих их генов (Woodford, 2007). Известно, что некоторые мутации могут изменять субстратную специфичность или приводить к возникновению устойчивости к ингибиторам. Большинство субтипов ТЕМ и SHV бета-лактамаз являются бета-лактамазами расширенного спектра (БЛРС), способными расщеплять не только антибиотики пенициллинового ряда и ранние цефалоспорины, но и антибиотики, принадлежащие к цефалоспоринам III и IV поколений. Характерную для БЛРС активность проявляют также все ферменты СТХ-М типа. В отличие от ТЕМ и SHV бета-лактамаз они имеют низкую степень гомологии внутри группы, поэтому их дополнительно разделяют на 4 подгруппы, внутри которых ферменты отличаются наличием точечных аминокислотных мутаций (Bonnet, 1999; Bonnet, 2004).
Многообразие бета-лактамаз молекулярного класса А, а также их широкое распространение диктуют необходимость разработки методов точной и быстрой идентификации ферментов данного класса. Рутинная оценка чувствительности к антибиотикам, проводимая в бактериологических лабораториях, не является достаточно эффективной для обнаружения БЛРС вследствие вариабельности их фенотипического проявления. Кроме того, существующие методы исследования бета-лактамаз, основанные на определении их физико-химических свойств и субстратного спектра, не обладают достаточной разрешающей способностью для дифференциации многочисленных ферментов этой
группы. В связи с этим актуальной задачей является разработка молекулярно-генетических методов типирования бета-лактамаз. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) является сейчас наиболее распространенной для выявления генов БЛРС, однако положительный результат ПЦР-амплификации генов, как правило, не является достаточным для определения субтипа фермента и предполагает дальнейшее исследование генов с целью выявления возможных мутаций, определяющих расширенный спектр активности (Эйделыптейн, 2001).
Перспективным методом определения множества мутаций как с точки зрения времени получения результата анализа, так и его информативности является метод гибридизационного анализа на ДНК-микрочипах (Grimm, 2004; Ensor, 2007; Cohen Stuart, 2010). ДНК-микрочип представляет собой небольшую по площади поверхность носителя с размещенными на ней в виде матрицы ячейками, в каждой из которых иммобилизованы олигонуклеотидные зонды. В настоящее время наиболее распространенными являются ДНК-микрочипы на стеклянных пластинах с флуоресцентной детекцией (Sassolas, 2008). Их основными преимуществами являются высокая чувствительность и простота проведения анализа. Однако данная технология имеет существенные ограничения при мультипараметрическом определении ОНП генов, так как не всегда удается достичь высокой специфичности идентификации однонуклеотидных замен, в том числе, из-за влияния флуоресцентной метки на образование совершенных ДНК-дуплексов. С этой точки зрения использование в качестве метки молекул небольшого размера, например биотина, является перспективным для одновременного определения множества точечных мутаций в генах. Для выявления биотина в дуплексах ДНК возможно использование конъюгата стрептавидин-фермент с последующей колориметрической детекцией фермента. Колориметрические микрочипы могут быть достойной альтернативой флуоресцентным микрочипам, так как регистрация аналитических сигналов в этом случае может проводиться на недорогих оптических сканерах или даже визуально.
Цели и задачи исследования. Целью данной работы являлась разработка колориметрических ДНК-микрочипов для генотипирования бета-лактамаз молекулярного класса А на основе определения однонуклеотидного полиморфизма кодирующих их генов. Для достижения поставленной цели требовалось решить следующие задачи:
оптимизировать метод гибридизационного анализа биотинилированной ДНК на микрочипах с колориметрической детекцией;
изучить специфичность выявления ОНП генов на ДНК-микрочипах с колориметрической детекцией;
разработать методы амплификации полноразмерных генов ТЕМ, SHV и СТХ-М бета-лактамаз с одновременным включением биотина в качестве
метки;
разработать колориметрические ДНК-микрочипы для генотипирования ТЕМ, SHV и СТХ-М бета-лактамаз на основе выявления однонуклеотидно-го полиморфизма кодирующих их генов;
разработать интегрированный ДНК-микрочип для одновременной диагностики бета-лактамаз расширенного спектра и ингибитор-резистентных бета-лактамаз ТЕМ, SHV и СТХ-М типов.
Научная новизна. В ходе данной работы разработан метод колориметрической детекции на основе пероксидазы хрена для ДНК-микрочипов высокой плотности на стекле и мембранных носителях, сравнимый по чувствительности с флуоресцентной детекцией на основе красителя СуЗ.
Показано, что специфичность выявления ОНП генов методом гибридиза-ционного анализа на ДНК-микрочипах с использованием биотина в качестве метки выше, чем для метода гибридизационного анализа с использованием флуоресцентной метки СуЗ.
Разработана методика совместной амплификации полноразмерных генов бета-лактамаз ТЕМ, SHV и СТХ-М типов в процессе мультиплексной ПЦР с одновременным включением метки. Показана более высокая эффективность включения биотина в качестве метки в амплифицируемый ген в сравнении с флуоресцентным красителем СуЗ.
На основе выявленных в работе закономерностей поведения олигонукле-отидов различной структуры в гибридизационном анализе на ДНК-микрочипах сформулированы рекомендации по молекулярному дизайну зондов для определения ОНП генов. Использование разработанного подхода позволило улучшить дифференциацию между совершенными и несовершенными ДНК-дуплексами, образованными молекулами исследуемой ДНК и олигонуклеотидными зондами на поверхности микрочипа.
Практическая значимость работы. Полученные в ходе работы результаты позволили разработать следующие типы колориметрических ДНК-микрочипов:
ДНК-микрочипы высокой плотности, изготовленные на поверхности микроскопных стекол, для генотипирования ТЕМ, SHV и СТХ-М бета-лактамаз на основе определения всех позиций ОНП генов, приводящих к известным аминокислотным заменам;
интегрированный ДНК-микрочип средней плотности, изготовленный на поверхности мембранных носителей, для одновременной диагностики БЛРС и ингибитор-резистентных бета-лактамаз ТЕМ, SHV и СТХ-М типов на основе идентификации типа генов и ключевых мутаций в них.
Применение метода гибридизационного анализа на ДНК-микрочипах с колориметрической детекцией позволяет повысить специфичность определения
ОНП генов, а также значительно снизить себестоимость анализа. Эти преимущества открывают новые возможности для применения тест-систем на основе ДНК-микрочипов в клинической диагностике и для проведения широкомасштабных эпидемиологических исследований.
Апробация работы. Основные результаты работы представлены на Международных конференциях «Биокатализ. Фундаментальные основы и применение» (Санкт-Петербург, 2007; Архангельск, 2009); IV и V Московских международных конгрессах "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (Москва, 2007; Москва, 2009); X и XII международных конгрессах по антимикробной терапии MAKMAX/ESCMID (Москва, 2008; Москва, 2009); Всероссийской школе-семинаре для студентов, аспирантов и молодых ученых «Нанобио-технология: проблемы и перспективы» (Белгород, 2008); 8th International Meeting on Microbial Epidemiological Markers (Закопане, Польша, 2008); 21st IUBMB and the 12th FAOBMB International Congress of Biochemistry and Molecular Biology (Шанхай, Китай, 2009); II и III международных форумах «Руснанофорум 2009» и «Руснанофорум 2010» (Москва, 2009; Москва, 2010); III научно-практической конференции «Перспективы развития инноваций в биологии» (Москва, 2009); 20th Anniversary World Congress on Biosensors (Глазго, Великобритания, 2010); Всероссийской научно-практической конференции «Молекулярная диагностика-2010» (Москва, 2010); Первой международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине» (Москва, 2010).
Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 14 работ, в том числе 4 статьи в международных и отечественных журналах, 10 тезисов докладов международных и российских конференций.
Объём и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы (главы 1-4), экспериментальной части (глава 5), описывающей материалы и методы исследования, результатов и их обсуждения (главы 6-10), выводов, списка цитируемой литературы и приложения. Работа изложена на 188 страницах, содержит 19 таблиц и 59 рисунков. Список литературы включает 212 ссылок.
Используемые сокращения. БЛРС - бета-лактамазы расширенного спектра, ДС - декстран сульфат натрия, ИРТ - ингибитор-резистентный тип, ОНП - однонуклеотидный полиморфизм, ПХ - пероксидаза хрена, ПЦР - по-лимеразная цепная реакция, ТМБ - 3,3',5,5'-тетраметилбензидин, ЩФ - щелочная фосфатаза.
