Содержание к диссертации
Введение
1. Литературный обзор.
I. Полихлорированные фенолы 11
1. Общая характеристика полихлорированных фенолов 11
1.1 Физико-химические свойства 11
1.2 Токсичность 13
1.3. Источники поступления 17
2. Методы деградации полихлорированных фенолов
2.1. Фотохимические методы 24
2.1.1. Прямой фотолиз 24
2.1.2. Сенсибилизированный фотолиз 27
2.1.3. Каталитический фотолиз 28
2.1.4. Новые окислительные технологии 30
2.2. Биологические методы 32
II. Деградация полихлорированных фенолов иммобилизованными клетками 37
1. Общие сведения о цеолитах 37
2. Адсорбционные методы иммобилизации микробных клеток. Взаимодействие минералов с микроорганизмами 42
3. Применение иммобилизованных клеток для очистки сточных вод... 45
2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Объекты исследований 50
2.2. Методы исследований 51
2.1.1. Микробиологические методы 51
2.2.1.1. Определение численности клеток 51
2.2.1.2. Размеры клеток 53
2.2.1.3. Методика приготовления питательных сред для культивирования микроорганизмов 53
2.2.1.4. Изучение морфологии бактерий 53
2.2.1.5. Окраска жгутиков по Леффлеру 55
2.2.1.6. Метод раздавленной капли 55
2.2.1.7. Протеолитические свойства микроорганизмов 55
2.2.1.8. Определение сероводорода 56
2.2.1.9. Определение аммиака 56
2.2.1.10. Определение индола 57
2.2.1.11. Определение редуцирующей способности 57
2.2.1.12. Определение сахаролитической способности 57
2.2.1.13. Определение каталазы 58
2.2.1.14. Определение антагонистической активности 58
2.2.1.15. Обнаружение капсулы и определение ее природы 60
2.2.2. Физико-химические методы анализа 62
2.2.2.1. Спектрофотометрическое определение полихлорфенолов
3. АДСОРБЦИОННАЯ ИММОБИЛИЗАЦИЯ КЛЕТОК BACILLUS CEREUS НА ПРИРОДНЫХ ЦЕОЛИТАХ
3.1. Исследование влияния природных цеолитов на морфолого-культуральные и физиолого-биохимические характеристики Bacillus cereus 64
3.2. Исследование влияния 2,4-ДХФ на морфолого-культуральные характеристики культуры Bacillus cereus 68
3.3. Определение токсичности природных цеолитов и 2,4-ДХФ 73
3.4. Характеристики сорбции Bacillus cereus природными цеолитами 82
4. Биодеградация 2,4-дхф иммобилизованными и суспендированными клетками bacillus cereus 89
5. Идентификация интермедиатов методом хромато-масс-спектрометрии 99
6. Биотехнологическая схема очистки сточных вод с использованием микроорганизма-деструктора полихлорированных фенолов 106
ВЫВОДЫ 108
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 109
- Токсичность
- Определение численности клеток
- Исследование влияния природных цеолитов на морфолого-культуральные и физиолого-биохимические характеристики Bacillus cereus
Введение к работе
Признание озера Байкал, как участка мирового природного наследия, накладывает на мировое сообщество и, в первую очередь, на Россию обязательства по сохранению озера для будущих поколений людей. Среди органических акваэкотоксикантов особую опасность для экосистемы озера представляют полихлорированные фенолы. Согласно разработанному «Перечню вредных веществ, вредных для экосистемы озера Байкал», полихлорированные фенолы относятся к категории «особо опасных» веществ, содержание которых в воде озера Байкал и его притоков недопустимо [1]. В действительности же, на Байкальском целлюлозно-бумажном комбинате (БЦБК) полихлорфенолы образуются при хлорной отбелке целлюлозы и обнаруживаются в воде озера Байкал, в зоне сброса очищенных сточных вод [2]. Присутствие полихлорфенолов в бассейне реки Селенги, главного притока озера, обусловлено локальными антропогенными и природными источниками [3]. Особенностью этих соединений является высокая токсичность для акваэкосистем, способность к биоаккумуляции, относительная устойчивость к разложению в окружающей среде. Поэтому, актуальной является проблема их принудительной деградации, с целью защиты окружающей среды.
Биологический метод, основанный на применении активных микроорганизмов-деструкторов, в большинстве случаев является наиболее экономически обоснованной альтернативой химическим и физико-химическим методам. Причем, эффективность биологической обработки повышается при иммобилизации клеток микроорганизмов, что широко используется в практике при очистке промышленных стоков [4].
Весьма перспективным является применение метода адсорбционной иммобилизации на неорганическом носителе - природных цеолитах, обладающих биологической активностью, кислотоустойчивостью и уникальным сочетанием адсорбционных, катионообменных и
каталитических свойств. Природные цеолиты также обладают способностью интенсифицировать клеточные процессы, но механизмы их цитотоксического и активирующего действия остаются неясными [5].
В связи с этим, несомненный интерес представляет исследование воздействия цеолитов на микробные клетки и возможности их использования в качестве носителя для иммобилизации микроорганизмов-деструкторов с целью интенсификации биологической очистки сточных вод, содержащих полихлорфенолы. Ранее, из ила пруда-аэратора БЦБК была выделена и идентифицирована как Bacillus cereus новая культура, обладающая наибольшим деструктивным потенциалом по отношению к 2,4-дихлорфенолу [6].
Поэтому, обоснованной и актуальной представляется проблема обезвреживания токсичных полихлорфенолов с применением новых микроорганизмов-деструкторов, иммобилизованных на природных цеолитах.
Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематическим планом научно-исследовательских работ Байкальского института природопользования СО РАН по научному направлению подпрограммы СО РАН 17.7. «Защита атмосферы, природных вод и почв» и являлась частью проекта «Разработка физико-химических основ новых высокоэффективных технологий обезвреживания стойких органических загрязнителей природных и сточных вод».
Цель работы. Исследование процесса иммобилизации на природных цеолитах культуры Bacillus cereus (далее B.cereus) и разработка биотехнологического способа обезвреживания полихлорированных фенолов с использованием иммобилизованных и суспендированных клеток.
Основные задачи: исследовать влияние природных цеолитов Холинского месторождения Республики Бурятия на морфолого-культуральные и физиолого-биохимические характеристики В. cereus;
определить характеристики сорбции клеток В. cereus природными цеолитами Холинского месторождения;
исследовать процесс иммобилизации клеток В. cereus на природных цеолитах, получить иммобилизованные клетки В. cereus;
изучить кинетику биодеградации 2,4-ДХФ иммобилизованными на природных цеолитах и суспендированными клетками В. cereus;
идентифицировать продукты биодеградации 2,4-ДХФ и оценить их токсичность;
разработать биотехнологическую схему очистки сточных вод с использованием иммобилизованных клеток В. cereus.
Научная новизна работы. В работе показана возможность использования природных цеолитов Холинского месторождения (Республика Бурятия) в качестве матрицы для иммобилизации микроорганизмов В. cereus. Исследован механизм сорбции клеток В. cereus на природных цеолитах Холинского месторождения. Продемонстрирована способность иммобилизованных на природных цеолитах клеток В. cereus разлагать 2,4-ДХФ в статических условиях. Методом хромато-масс-спектрометрии идентифицированы основные продукты биодеградации 2,4-ДХФ данным микроорганизмом и установлена их нетоксичность. Выявлена перспективность применения иммобилизованных клеток культуры В. cereus для эффективной утилизации полихлорированных фенолов.
Практическая значимость. Получены иммобилизованные клетки микроорганизма-деструктора полихлорфенолов В. cereus с использованием природных цеолитов Холинского месторождения (Республика Бурятия), определены оптимальные условия их иммобилизации. Показано, что после иммобилизации клетки сохраняют деструктивную активность по отношению к 2,4-ДХФ.
Проведены укрупненные производственные испытания разработанной
технологии очистки сточных вод от полихлорфенолов (ЗАО
«Кондитерпром», г. Улан-Удэ (Акт испытаний №1 от 17.07.2007г.)).
Результаты исследований включены в отчеты Байкальского института природопользования СО РАН по проекту 17.7 приоритетного направления СО РАН «Разработка физико-химических основ новых высокоэффективных технологий обезвреживания стойких органических загрязнителей природных и сточных вод», экспедиционным грантам СО РАН, гранту федеральной целевой программы "Интеграция науки и высшего образования России на 2002-2006 годы" (2004 г.) «Комбинированное фотолитическое и биологическое окисление хлорированных фенолов с применением ультрафиолетовых эксиламп емкостного разряда», гранту Правительства Республики Бурятия для молодых ученых на выполнение НИР по теме «Инновационная технология обезвреживания промышленных стоков, содержащих хлорфенолы» (2005 г.), гранту ФЦНТП РИ-19.0/001/014 «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники» на 2002-2006 годы «Разработка инновационной окислительной технологии деградации фенольных пестицидов иммобилизованными микроорганизмами» (2006 г.).
Апробация работы. Результаты работы представлялись на международных и региональных конференциях и симпозиумах: «Проблемы устойчивого развития региона» (г. Улан-Удэ, 2004), «Научные основы сохранения водосборных бассейнов: междисциплинарные подходы к управлению природными ресурсами» (г. Улан-Удэ - Улан-Батор, 2004), «Кожа и мех в XXI веке: технология, качество, экология, образование» (г. Улан-Удэ, 2006), «Трансграничные аспекты использования природно-ресурсного потенциала бассейна реки Селенги в новой социально-экономической и геополитической ситуации» (г. Улан-Удэ, 2006), «Участие молодых ученых, инженеров и педагогов в разработке и реализации инновационных технологий» (г. Москва, 2006), Всероссийская конференция молодых ученых «Экология в современном мире: взгляд научной молодежи» (Улан-Удэ, 2007), IV школа-семинар молодых ученых России «Проблемы устойчивого развития региона» (Улан-Удэ, 2007).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ. Структура и объем диссертации.
Диссертационная работа состоит из введения, четырех глав, выводов и списка использованных источников (135 наименований). Работа изложена на 123 страницах машинописного текста, иллюстрирована 28 рисунками и 10 таблицами.
Токсичность
ХФ превышают фенол по токсичности и устойчивости к биодеструкции и обладают следующими эффектами воздействия на здоровье человека и окружающую среду: эмбриональная токсичность (в том числе тератогенность), мутагенность, канцерогенность, биоаккумуляция [8]. Токсичность фенолов повышается с увеличением числа атомов хлора в молекуле, поэтому, среди хлорфенолов наиболее токсичным является пентахлорфенол (Таблица 2). Пентахлорфенол и 2,4,6-трихлорфенол обладают выраженными канцерогенными и мутагенными свойствами, могут вызывать хромосомные изменения, и обуславливают возникновение лейкемии, злокачественной лимфомы и саркомы мягких тканей у человека, а также так называемого «хлоракногенного фактора» [9]. Хлорфенолы обладают кумулятивными свойствами и способны образовывать комплексные соединения с гемоглобином крови [10]. К клиническим симптомам относятся: астения, мышечная слабость, боли в конечностях и
суставах, бессонница, светочувствительность, тошнота, диарея. В число объективных признаков входят нарушение деятельности печени, желчных путей, периферическая невропатия, повышенное содержание триглицеридов в крови, ослабление иммунной системы [8]. При конденсации двух молекул хлорфенолов происходит образование более опасных токсикантов -полихлорированных дибензо-и-диоксинов и дибензофуранов [11].
По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) ХФ входят в список приоритетных загрязнителей питьевой воды [12]. Согласно рекомендациям ВОЗ по безвредной для человека концентрации химических веществ, общее содержание хлорфенолов в питьевой воде должно поддерживаться ниже 1.0 мкг/л. В РФ в воде водных объектов хозяйственно-питьевого и культурно-бытового водопользования, а также водных объектов, имеющих рыбохозяйственное значение, нормируются 2-ХФ, 2,4-ДХФ, 2,4,6-ТХФ (4 класс опасности) и ПХФ (2 класс опасности) [13, 14]. Согласно разработанному «Перечню вредных веществ, вредных для экосистемы озера Байкал», ХФ относятся к категории «особо опасных» веществ, содержание которых в воде озера Байкал и его притоков недопустимо [1]. По данным Госкомсанэпидемнадзора РФ в питьевой воде нормируются 2-ХФ, 2,4-ДХФ, 2,4,6-ТХФ и ПХФ (Таблица 3).Значения ПДК хлорфенолов в природной воде, принятые ЕРА USA (Environmental Protection Agency), следующие: ПДК монохлорфенола составляет 25.0 мкг/л, дихлорфенола - 15.0 мкг/л, трихлорфенола - 2.5 (3.0), тетрахлорфенола - 1.0 мкг/л, пентахлорфенола - 3.5 (4.0) мкг/л [16]. В Руководстве по контролю качества воды (Канада) установлены следующие ПДК хлорфенолов в природных водах (пресных, морских и приустьевых): ПДК монохлорфенолов и дихлорфенолов в воде для рыбохозяйственных целей (отлова рыбы, ракообразных, моллюсков) составляют 0.1 и 0.2 мкг/л соответственно [17]. Здесь же представлены ПДК хлорфенолов в природных водах в зависимости от величин рН, при которых они безопасны для водной биоты (Таблица 4).
Определение численности клеток
Численность клеток определяли методом серийных разведений. Разведения проводили в стерильной водопроводной воде. Готовили определенный объем данного раствора и стерилизовали при 1 атм. в паровом стерилизаторе марки ВК-75-01. В ходе одного опыта пользовались постоянным коэффициентом разведения, т.к. в этом случае уменьшается вероятность ошибки. Делали третьи и пятые разведения. Для этого брали пробирку с 10 см стерильного раствора и переносили стерильной пипеткой 1 см3 исследуемого материала в другую пробирку. Суспензию этого разведения тщательно перемешивали с помощью новой стерильной пипетки, вбирая в пипетку и выпуская из нее полученную смесь несколько раз. Это обеспечивает перемешивание суспензии и уменьшает адсорбцию клеток на стенках пипетки. Затем этой же пипеткой брали 1 см3 полученного разведения и переносили его во 2-ую пробирку. Таким образом, готовили и последующие разведения. Степень разведения определяли предполагаемым количеством микроорганизмов в образце и соответственно, число разведений тем больше, чем больше микроорганизмов в исходном субстрате.
Для приготовления каждого разведения обязательно использовали отдельную пипетку. Пренебрежение этим правилом могло привести к получению ошибочного результата. Ошибка связана с адсорбцией микроорганизмов на стенках пипетки, в результате чего не все клетки удаляются из пипетки при приготовлении соответствующего разведения. Часть клеток, оставшаяся на стенках пипетки, может затем попасть в одно из последующих разведений, что и явится причиной получения завышенного результата.
Посев микроорганизмов на агаризованные среды в чашки Петри. В стерильные чашки Петри наливали расплавленную на кипящей водяной бане агаризованную среду, по 20-30 см3 в каждую. Чашки оставляли на
горизонтальной поверхности, пока не остынет агар-агар. Когда используют элективные среды или выделяют и учитывают микроорганизмы, требующие повышенной влажности, посев проводят сразу же или вскоре после застывания агар-агара.
Посев делали из определенных разведений в зависимости от предполагаемого количества микроорганизмов в исследуемом субстрате. Стерильной пипеткой наносили определенный объем (обычно 0,05; 0,1 или 0,2 см) соответствующего разведения, предварительно тщательно перемешанного, на поверхность агаровой пластинки в чашки Петри. Этот объем распределяли по поверхности среды стерильным шпателем. Затем этим же шпателем проводили по всей поверхности во второй чашке, куда вносили посевной материале. При выявлении микроорганизмов, количество которых в субстрате относительно не велико, посевной материал распределяли по поверхности среды только в одной чашке.
Из каждого исследуемого разведения делали, таким образом, 2-3 параллельных высева. Для параллельных высевов из одного разведения можно пользоваться одной пипеткой и одним шпателем. Для посевов из разных разведений используют другую стерильную пипетку и другой шпатель. Чашки с засеянными средами помещали в термостат, отрегулированный на определенную температуру, благоприятную для развития выявляемых микроорганизмов.
Подсчет выросших колоний проводили через определенное время после посева, которое завит от скорости роста выявляемых микроорганизмов на используемой в опыте среде и данной температуре.
Количество колоний, выросших при высеве из определенного разведения, подсчитывали на двух - трех чашках Петри. Результаты параллельных высевов суммировали и определяли среднее число колоний, выросших при высеве из одного разведения. Колонии считали, как правило, не открывая чашки. Для удобства отмечали просчитанную колонию точкой на наружной стороне дна чашки, пользуясь стеклографом или чернилами по стеклу. При большом количестве колоний дно чашки делили на секторы, подсчитывали количество колоний в каждом секторе и результаты суммировали [98].
Исследование влияния природных цеолитов на морфолого-культуральные и физиолого-биохимические характеристики Bacillus cereus
Для исследования процессов биодеградации полихлорированных фенолов объектами исследования являлись культуры микроорганизмов-деструкторов, выделенные из ила пруда-аэратора Байкальского целлюлозно-бумажного комбината (БЦБК).
При культивировании ила пруда-аэратора в жидкой питательной среде, содержащей хлорфенолы, в результате последовательных пересевов [104] были получены накопительные культуры.
Из полученных накопительных культур были отобраны одиннадцать активных культур, способных расти в минеральной среде с одним из хлорфенолов в качестве единственных источников углерода и энергии [105]. Селекционированные культуры пересевали методом серийных разведений на скошенные плотные среды и использовали для изучения морфологических свойств по стандартным методикам.
Установлено, что способность выделенных культур утилизировать хлорфенолы увеличивается в ряду 2-ХФ 4-ХФ 2,4-ДХФ. Следовательно, наиболее эффективные бактерии-деструкторы 2,4-ДХФ [105].
Для дальнейшего исследования отобрали культуру бактерий-деструкторов 2,4-ДХФ, идентифицированную как Bacillus cereus на основе секвенирования последовательности 16S рДНК, а также морфолого-культуральных и физиологических характеристик [6].
Исследование влияния природных цеолитов Холинского месторождения (Республика Бурятия) на морфолого - культуральные характеристики клеток Bacillus cereus проводили, используя стандартные методики [98,101].
Морфологические и культуральные характеристики клеток культур Bacillus cereus изучались микроскопированием живых и фиксированных клеток при помощи фазово-контрастного микроскопа PZO SK19 Биолам Р-16. Снимки микрофотографий бактериальных клеток, полученных при помощи микроскопа Motic В1 Series System Microscopes, показаны на рисунке 9.
Клетки исходных бактерий представляли собой грамположительные палочки размером 2-5 мкм, образующие длинные и короткие цепочки. Края колоний округлые, концы гладкие. Цвет колоний желтоватый, профиль выпуклый, структура колоний однородная, поверхность гладкая, консистенция - мазеобразная.
Используя стандартную методику - метод раздавленной капли, была определена подвижность и характер движения используемых микроорганизмов. Микроскопирование показало, что клетки В xereus подвижны за счет перетрихиальных жгутиков, движения активные, цепочки движутся вперед.
