Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Использование кальций-регулируемых фотопротеинов в качестве репортеров в диагностики in vitro 12
1.1. Использование Са -регулируемых фотопротеинов в иммуноферментном анализе 14
1.2. Использование Са -регулируемых фотопротеинов в гибридизационном анализе 22
1.3. Одновременный анализ двух мишеней 29
ГЛАВА 2. Материалы и методы 36
2.1. Оборудование 36
2.2. Материалы и реактивы 36
2.3. Культивирование трансформированных клеток Е. coli, выделение и очистка белков 38
2.4. Определение концентрации белков, биолюминесцентной активности и спектральные измерения 40
2.5. Химическая модификация белков и олигонуклеотидов 41
ГЛАВА 3. Одновременный иммуноферментный анализ двух антигенов с использованием «цветных» мутантных форм обелина в качестве меток 43
3.1. Основные физико-химические свойства мутантных форм обелина W92F;H22E и Y138F 43
3.2. Одновременный твердофазный иммуноанализ двух антигенов 53
ГЛАВА 4. Последовательный иммуноферментный анализ двух антигенов с использованием фотопротеина обелина в паре с целентеразин-зависимой люциферазой Metridia longa 58
4.1. Основные физико-химические свойства люциферазы Metridia longa 58
4.2. Использование люциферазы MLuc39 в твердофазном микроанализе 66
ГЛАВА 5. Гибридизационный био люминесцентный анализ с использованием фотопротеина обелина 72
5.1. Гибридизационный анализ с использованием в качестве метки коньюгата стрепт/авидина с обелином или щелочной фосфатазой 73
5.2. Гибридизационный анализ с использованием в качестве метки коньюгата олигонуклеотидного зонда с обелином или его мутантными вариантами Y138F и W92F;H22E 80
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 88
ВЫВОДЫ 91
ЛИТЕРАТУРА 93
- Использование Са -регулируемых фотопротеинов в иммуноферментном анализе
- Культивирование трансформированных клеток Е. coli, выделение и очистка белков
- Основные физико-химические свойства мутантных форм обелина W92F;H22E и Y138F
Введение к работе
Важнейшей задачей современной биотехнологии является поиск новых высокоэффективных аналитических инструментов способных отвечать нуждам медицинской диагностики, микробиологии, геномики, экологии и т.д. Ключевыми элементами аналитических систем являются системы регистрации специфических взаимодействий аффинных комплексов. Основными требованиями, предъявляемыми к этим системам, являются их надежность, стабильность, простота мечения и регистрации, а также способность обеспечить выявление сверхмалых количеств биомолекул-мишеней. Этим требованиям в полной мере удовлетворяют подходы, использующие биолюминесцентные метки.
Са - регулируемые фотопротеины кишечнополостных представляют собой устойчивый фермент-субстратный комплекс, состоящий из белковой части - апопротеина (одноцепочечный полипептид, ~20 кДа) и субстрата 2-гидропероксицелентеразина. В аминокислотной последовательности белка находятся 3 кальций-связывающих сайта. Присоединение ионов Са практически мгновенно вызывает реакцию внутримолекулярного окислительного декарбоксилирования субстрата с образованием целентерамида, СО2 и испусканием кванта света в голубой области. Благодаря этому свойству фотопротеины успешно используются для
"5-і-
мониторинга внутриклеточного Са более 40 лет. Клонирование кДНК генов ряда фотопротеинов и получение высокоактивных рекомбинантных белков в практически неограниченном количестве открыло новые возможности их применения, в частности, в качестве репортеров в гибридизационном и иммунном анализах.
В лаборатории фотобиологии СО РАН ведутся многолетние исследования биолюминесцентной системы Са2+-регулируемого
фотопротеина обелина гидроидного полипа Obelia longissima: выделен и изучен природный белок, клонирована его кДНК, получен штамм-суперпродуцент и разработана эффективная технология получения рекомбинантного обелина, установлена его пространственная структура и предложен механизм биолюминесцентной реакции. На основе этих данных сайт-направленным мутагенезом были сконструированы ряд мутантов обелина, обладающих уникальными свойствами, в том числе и новыми спектральными характеристиками излучения. Таким образом, появилась возможность использования мутантных форм обелина в качестве меток для одновременного определения нескольких аналитов и регистрацией сигналов на разных длинах волн.
Одной из задач клинической иммунодиагностики является определение не только количества, но и баланса между содержанием двух антигенов (соотношения ЛГ и ФСГ, тироидных гормонов - трийодтиронина, тироксина, а также их свободных и связанных форм; анализ ряда гормонов и белков-переносчиков, в норме присутствующих в кровяном русле и т.д.). Одновременный анализ содержания нескольких антигенов позволит избежать ошибок из-за разнесенных во времени процедур определения, а также существенным образом сократит временные и материальные затраты на такую диагностику, что особенно важно при проведении широкомасштабных исследований.
Другим видом молекулярной диагностики является метод, основанный на определении определенных нуклеотидных последовательностей с помощью ДНК-гибридизации. В литературе имеются данные о перспективности использования фотопротеина акворина в качестве репортерного белка в таком анализе. Исследований по применению рекомбинантного обелина для этих целей не проводилось.
Целью представленной работы являлось разработка вариантов биолюминесцентного иммуноанализа, позволяющих проводить определение двух антигенов в одном образце, а также вариантов ДНК-гибридизационного анализа с применением фотопротеина обелина в качестве репортера.
Выполнение данного исследования требовало решения следующих экспериментальных задач:
Получить высокоочищенные препараты мутантных форм обелина OL W92F;H22E и OL Y138F, имеющих разные спектральные характеристики биолюминесценции, исследовать их основные свойства и с помощью химических модификаций синтезировать активные коныогаты с иммуноглобулинами к двум разным антигенам.
Разработать вариант одновременного биолюминесцентного иммуноанализа двух антигенов в одном образце с использованием полученных коньюгатов в качестве меток.
Получить высокоочищенный препарат рекомбинантной мономерной люциферазы Metridia longa изучить ее основные свойства и синтезировать коныогаты люциферазы, пригодные для использования в качестве биолюминесцентной метки в иммуноферментном анализе.
Разработать вариант биолюминесцентного иммуноанализа двух антигенов в одном образце с использованием в качестве репортеров фотопротеина обелина и люциферазы Metridia longa.
Синтезировать коныогаты обелина с авидином или стрептавидином и исследовать их эффективность в качестве меток в твердофазном гибридизационном анализе.
Разработать способ получения коньюгатов обелина и его мутантных форм с олигонуклеотидами. Продемонстрировать
пригодность полученных коньюгатов в качестве метки в гибридизационном анализе продуктов ПЦР. При решении поставленных задач были получены новые результаты, которые выносятся на защиту:
Разработан вариант одновременного иммуноанализа двух антигенов в одном образце с использованием «цветных» мутантных форм обелина в качестве репортерных белков и регистрацией сигналов на разных длинах волн.
Разработан метод иммуноанализа двух антигенов в одном образце с использованием двух разных биолюминесцентных репортеров - фотопротеина обелина и целентеразин-зависимой люциферазы Metridia longa с последовательным запуском биолюминесцентных реакций.
Показана перспективность использования фотопротеина обелина как репортера в гибридизационном анализе в различных форматах.
Все результаты данной работы получены впервые и могут быть использованы для создания отечественных высокоэффективных и чувствительных биолюминесцентных диагностикумов для определения биологически важных соединений и инфекционных агентов.
Работа выполнена при поддержке грантов: РФФИ 06-04-08076-офи, INTAS № 06-1000014-6163 (2007-2008 гг.) и лаврентьевского конкурса молодежных проектов № 83 (2006-2007 гг.).
Результаты диссертационной работы докладывались на Конференциях молодых ученых КНЦ СО РАН (Красноярск, 2006, 2007), Международных симпозиумах по Биолюминесценции и Хемилюминесценции (Иокогама, Япония, 2004; Сан-Диего, США, 2006; Пекин, Китай, 2008), международной конференции по инструментальным методам анализа (Патры, Греция, 2007), международной конференции молодых ученых по молекулярной биологи и
генетике, посвященной 120-му юбилею М.И. Вавилова (Киев, Украина, 2007), международной конференции молодых ученых «Биотехнология будущего» (Санкт-Петербург, 2006), международном семинаре молодых ученых «Нуклеиновые кислоты как мишени и инструменты» (Новосибирск, 2006).
По результатам исследования опубликовано 3 статьи в рецензируемых журналах и 2 статьи в сборниках материалов международных конференций.
Использование Са -регулируемых фотопротеинов в иммуноферментном анализе
Иммуноферментный анализ (ИФА), основанный на строгой специфичности и высоком сродстве (Kd = 10 12 - 10"14 М) взаимодействия антиген-антитело, а также на высокой активности фермента-метки, продукт реакции которого обладает «визуальным признаком» (окраска, флюоресценция или хемилюминесценция), был предложен как альтернатива радиоизотопному иммуноанализу. Метод ИФА находит широкое применение в области иммуногистохимии, иммунологии, медицины, ветеринарии и научных исследованиях. В настоящее время метод ИФА используется для определения широкого класса веществ: гормонов, онкомаркеров, лекарственных препаратов в крови больного (так называемый, мониторинг лекарственных препаратов), наркотиков, бактерий, вирусов и антител против них. Методами ИФА возможно определение иммуноглобулинов (видовая принадлежность, субклассы, специфичность), а также идентификация лимфоцитов (субпопуляций).
Выбор маркера является одним из важных этапов в проведение анализа. Известно более 2000 разных ферментов, однако только некоторые находят применение в ИФА. Это объясняется высокими требованиями, предъявляемыми к свойствам ферментов: стабильность, доступность, высокая чувствительность регистрации, высокая специфичность к субстрату, низкий уровень фонового шума и т.п. В настоящее время широко используется пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза и p-D-галактозидаза Escherichia coll Основными недостатками этих меток считают недостаточно широкий линейный диапазон зависимости сигнал-концентрация, высокий уровень фонового сигнала и недостаточно высокую чувствительность. К настоящему времени накоплен определенный опыт по использованию биолюминесцентных меток в иммуноанализе. Так, например, имеются данные по использованию для этих целей люциферазы из светляков [Hauber R. et al., 1989], бактериальной люциферазы [Jablonski Е., 1985], а также Са -регулируемых фотопротеинов - акворина и обелина.
В работе [Frank L.A. et al, 2004] на примере иммуноанализа тиреотропного гормона (ТТГ) в стандартных, контрольных сыворотках и сыворотках пациентов показано, что по чувствительности биолюминесцентный иммуноанализ с использованием фотопротеина обелина в качестве метки не уступает радиоиммуноанализу.
Джексон с соавторами [Jackson R.J. et al., 1996] провели прямые сравнения акворина и пероксидазы хрена в иммуноанализе антител на холерный токсин в слюне и фекалиях зараженных мышей. Было показано, что чувствительность биолюминесцентной метки выше пероксидазной на 2-4 порядка.
Мирасоли с соавторами [Mirasoli М. et al., 2002] использовали в качестве метки фотопротеин акворин для иммуноанализа кортизола в образцах слюны. Показано, что биолюминесцентный иммуноанализ обладает высокой чувствительностью и позволяет определить 3 нмоль/л кортизола в слюне, что значительно ниже его физиологического уровня (10-25 нмоль/л).
Высокая чувствительность фотопротеиновой метки позволяет проводить иммуноанализ без предварительной обработки образца. Так, например, большой фоновый сигнал при колориметрическом и флуоресцентном определении 6-кето-простагландина Fla затрудняет его анализ непосредственно в плазме крови, поэтому требуется его экстракция, что делает процесс анализа трудоемким и долгим. Использование в качестве метки фотопротеина акворина позволяет измерять до 1 пг/мл 6-кето-простагландина Fla в плазме крови без предварительной обработки [Desai U.A. et al, 2002].
Культивирование трансформированных клеток Е. coli, выделение и очистка белков
Штаммы-продуценты Е. coli, экспрессирующие апообелин и его мутантные варианты, акворин и люциферазу Metridia longa (изоформа MLuc39) были получены старшим научным сотрудником лаборатории фотобиологии ИБФ СО РАН Марковой СВ.
Трансформированные клетки Е. coli BL21-CodonPlus (DE3)-RIPL (Stratagene, США) культивировали в LB среде, содержащей ампициллин (200 мг/л), при 37 С до плотности OD59OHM = 0,6 - 0,8. Индукцию синтеза белка проводили добавлением ИПТГ (100 мг/л), затем культивировали еще в течение 3-х часов. Клетки осаждали центрифугированием (5000 g, 20 мин). Полученную биомассу использовали для выделения белков.
Получение рекомбинантных фотопротеинов проводили по способу, разработанному в лаборатории фотобиологии ИБФ СО РАН для рекомбинантного апообелина дикого типа [Illarionov В.A. et al., 2000] с небольшими модификациями, описанными в [Markova S.V. et al., 2002]. На последней стадии активированные целентеразином фотопротеины выделяли хроматографией на колонке Mono Q (GE Healthcare), уравновешенной 20 мМ Трис-HCl, рН 7,0, 5 мМ ЭДТА. Элюцию веществ с колонки проводили линейным градиентом концентрации NaCl от 0 до 0,35 М в том же буфере. Скорость элюции составляла 1 мл/мин.
Выделение и очистка целентеразин-зависимой рекомбинантной люцнферазы Metridia longa MLuc39. Клеточную пасту суспендировали в пятикратном объеме буфера 20 мМ Трис-HCl, рН 7,0 и разрушали озвучиванием 6-кратно по 20 сек при охлаждении льдом при помощи ультразвукового дезинтегратора UD-20 (Techpan, Польша). Полученную смесь центрифугировали (8000 g, 5 мин.), осадок телец-включений промывали, ресуспендируя последовательно в том же буфере, содержащем 0,15 М NaCl, затем 0,5% Tween 20 (трижды) и вновь буфером без добавок. После каждой промывки проводили центрифугирование (8000 g, 5 мин.). Полученный в результате осадок ресуспендировали в 6 М гуанидин-HCl и центрифугировали. Рефолдинг люцнферазы проводили 100-кратным разбавлением полученного экстракта буфером, содержащим 20 мМ Трис-НО рН 8,8, 5 мМ цистеина, 0,5 мМ цистина, 1 мМ ЭДТА, инкубировали в течение ночи при 4 С и диализовали против буфера, содержащего 20 мМ Трис-HCl рН 8,8, 1 мМ ЭДТА, 0,2 М NaCl (в течение ночи при 4 С). Образец концентрировали ультрацентрифугированием в пробирках Aminocon Ultra 15 (Millipore, США) и хроматографировали на колонке Superose 12 (GE Healthcare), уравновешенной 0,1 М NaHCC . Для работы использовали фракцию с молекулярной массой 21 к Да.
Рекомбинантный целентеразин-связывающий белок Renilla muelleri выделяли, как описано в работе [Titushin M.S. et al., 2008].
Авидин из белка куриных яиц выделяли по методу, описанному в работе [Франк Л.А. и др., 1992]
Чистоту белковых препаратов при выделении контролировали электрофорезом в 12,5% полиакриламидном геле (ПААГ), содержащим 0,1% ДСН по методу Лэммли [Laemmli U.K., 1970].
Концентрацию белков определяли спектрофотометрически с помошыо набора DC Protein Assay (Bio-Rad). В качестве калибровочного белка использовали бычий сывороточный альбумин.
Биолюминесцентный сигнал измеряли с помощью кюветного люминометра (модель БЛМ 8802, СКБ «Наука», Красноярск), калиброванного по радиоактивному стандарту Гастингса-Вебера [Hastings J.W., 1963]. Одна люминесцентная единица соответствует 107 фотонов в секунду. Сигнал регистрировали с помощью самописца (модель 2210) фирмы LKB (Швеция).
Измерения биолюминесценции фотопротеинов проводили в 0,1 М Трис-HCl рН 8,8 буфере, содержащем 10 мМ ЭДТА. Реакцию инициировали добавлением 0,1 М СаС12 в 0,1 М Трис-HCl рН 8,8. Кальций-независимая люминесценция была измерена в белковых образцах (0,5 - 2,0 мг/мл, в растворе 20 мМ Трис-HCl рН 7,0, 5 мМ ЭДТА, 0,2 М NaCl), помещенных в кювету люминометра.
Измерения биолюминесценции люциферазы MLuc39 проводили в SM-буфере (50 мМ Трис-HCl рН 7,5, 0,1 М NaCl, 10 мМ MgS04, 0,01 % желатина), реакцию инициировали добавлением 5 мкл 10 мкМ раствора целентеразина в метаноле. Концентрацию целентеразина определяли по его поглощению при длине волны 434 нм, используя коэффициент экстинкции 8900 см"1 М"1 [Hon К. et al., 1977]. Приведенные значения представляют собой среднее, как минимум, от трех измерений. Статистическую обработку результатов проводили стандартными методами [Зайцев, 1984].
Основные физико-химические свойства мутантных форм обелина W92F;H22E и Y138F
Зависимость величины сигнала от количества белка линейна во всем исследуемом диапазоне, перекрывающем 6 порядков. Предел обнаружения, определяемый как количество белка, при котором величина сигнала в два раза превосходит сигнал от буфера, составляет 1,4, 4,2 и 12 аттомоль для обелинов WT, Y138F и W92F;H22E, соответственно.
Одной из важных характеристик белков-маркеров является их стабильность при хранении. Нами было обнаружено, что потери биолюминесцентной активности мутантных форм обелина W92F;H22E и Y138F при хранении в растворе (20 мМ Трис-HCl рН 7,0, 5 мМ ЭДТА) в течение месяца в камере бытового холодильника (4-6 С) составляют 30-40%.
Был проведен поиск оптимальных условий получения белков в лиофильно-высушеном виде. Известно, что процедура лиофилизации часто приводит к потере специфической активности белка, поскольку предполагает замораживание белкового раствора и удаление молекул воды, образующих сеть водородных связей внутри и на поверхности белковой глобулы. При этом возможно разрушение структуры белка и, как следствие, падение его активности. Условия лиофилизации, позволяющие максимально сохранить биологическую активность полученного белка, подбирают эмпирически. Часто при лиофильном высушивании к раствору белка добавляют нейтральные белки (например, бычий сывороточный альбумин), углеводы или синтетические полимеры и т.п. Поэтому было исследовано влияние бычьего сывороточного альбумина (БСА) на сохранение биолюминесцентной активности мутантных белков при многократном замораживании-оттаивании. Обелины W92F;H22E и Y138F замораживали в ТЕ буфере (20 мМ Трис-HCl рН 7,0, 5 мМ ЭДТА), а также в ТЕ буфере, содержащем 1% БСА. Биолюминесцентную активность белков определяли до и после замороживания. Оказалось, что трехкратное замораживание и оттаивание обелинов Y138F и W92F;H22E приводит к падению биолюминесцентной активности на 71% и 96%, соответственно. Добавление 1% БСА позволило полностью сохранить первоначальную активность белков.
Ранее в нашей лаборатории было показано, что при лиофилизации обелина WT добавление 10% трегалозы позволяет сохранить 100% его активности. В наших экспериментах образцы мутантных белков лиофилизировали из растворов в ТЕ буфере, а также в ТЕ буфере с добавлением различных концентрацией трегалозы - 3%, 10%, 15% и 20%. Полученные лиофильно высушенные образцы растворяли в исходном объеме дистиллированной воды. Биолюминесцентную активность белков измеряли до и после лиофилизации.
