Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1. Микробиологический синтез органических кислот 8
1.2. Янтарная кислота, её характеристика и применение 16
1.3. Продуценты янтарной кислоты и условия их культивирования
1.3.1. Дрожжи-продуценты янтарной кислоты 22
1.3.2. Грибы-продуценты янтарной кислоты 25
1.3.3. Бактерии-продуценты янтарной кислоты 27
1.4. Механизмы биосинтеза янтарной кислоты 32
1.5. " Этанол, как субстрат для получения янтарной кислоты 35
Глава 2. Материалы и методы исследования
2.1. Объекты исследования 40
2.2. Культивирование дрожжей
2.2.1. Состав и подготовка основной среды 40
2.2.2. Подготовка посевного материала 40
2.2.3. Методы культивирования дрожжей 41
2.3. Метод получения янтарной кислоты из культуралыюй жидкости дрожжей Y. lipolytica
2.3.1. Сепарирование биомассы и получение пермеата культуральнои жидкости 43
2.3.2. Обработка пермеата перекисью водорода 43
2.3.3. Выделение целевого продукта 43
2.4. Аналитические методы 44
2.4.1. Методы контроля роста дрожжей 44
2.4.2. Определение концентрации этанола и аммонийного азота 45
2.4.3. Определение концентрации органических кислот 45
2.4.4. Определение концентрации изолимонной, а-кеїоглутаровой и янтарной 46 кислот энзиматическим методом
2.4.5. Определение содержания липидов
2.5. Определение активности ферментов 49
2.6. Методы определения выживаемости клеток Y. lipolytica 51
2.7. Биохимическая характеристика препарата янтарной кислоты
Глава 3. Результаты и обсуждениЕ
3.1. Биосинтез янтарной кислоты у дрожжей С. catenulata и С. zeylanoides 52
3.1.1. Скрининг дрожжей и отбор штаммов-продуцентов янтарной кислоты на среде с этанолом 55
3.1.2. Оптимизация условий культивирования и состава питательной среды для дрожжей С. catenulata и С. zeylanoides 57
3.1.2.1. Влияние концентрации сульфата аммония на рост дрожжей С. catenulata 57
3.1.2.2. Влияние концентрации этанола на рост дрожжей С. catenulata и С. zeylanoides 58
3.1.2.3. Влияние концентрации цинка на рост дрожжей С. catenulata и С. zeylanoides и накопление янтарной кислоты 60
3.1.2.4. Влияние аэрации на рост дрожжей С. catenulata и накопление янтарной кислоты 3.1.3. Динамика роста С. catenulata и С. zeylanoides и экскреция метаболитов 62
3.1.4. Динамика накопления запасных веществ у дрожжей С. catenulata и С. zeylanoides 66
3.1.5. Участие глиоксилатного цикла в биосинтезе янтарной кислоты из этанола 67
3.2. Метод получения янтарной кислоты с использованием дрожжей Y, lipolytica 72
3.2.1. Отбор продуцента и условия биосинтеза а-кстоглутаровой кислоты дрожжами 73
3.2.2. Реакция декарбоксилирования а-кетоглутаровой кислоты до янтарной кислоты в культуральной жидкости 79
3.2.3. Влияние перекиси водорода па выживаемость Y. lipolytica 212 и количество образуемой янтарной кислоты из а-кетоглутаровой кислоты 80
3.2.4. Культивирование дрожжей Y. lipolytica 212 в присутствии перекиси водорода 82
3.2.5. Культивирование дрожжей Y. lipolytica в ферментере с целью наработки янтарной кислоты
3.3. Выделение ЯК из культуральной жидкости дрожжей Y. lipolytica 85
3.4. Биохимическая характеристика препарата янтарной кислоты 89
Глава 4. Заключение 92
Выводы 95
Список литературы
- Янтарная кислота, её характеристика и применение
- Метод получения янтарной кислоты из культуралыюй жидкости дрожжей Y. lipolytica
- Влияние концентрации этанола на рост дрожжей С. catenulata и С. zeylanoides
- Выделение ЯК из культуральной жидкости дрожжей Y. lipolytica
Введение к работе
Актуальность проблемы
Янтарная кислота (ЯК) широко используется в химической промышленности в качестве исходного сырья для производства различных четырехуглеродных соединений; на её основе получают биодеградируемые полимеры, применяемые при производстве пищевых плёнок и упаковок, средств личной гигиены и одноразовой посуды. В пищевой промышленности ЯК применяется в качестве пищевой добавки, подкислителя и консерванта. В последние годы ЯК стала применяться в здравохранении. Исследованиями научной школы М.Н. Кондрашовой (ИТЭБ РАН) показано, что ЯК является сигнальным веществом, связывающим энергетическую и гормональную системы организма. На основании этих исследований разработан ряд биологически активных добавок и лекарственных средств на основе ЯК. Производство ЯК ежегодно возрастает не менее, чем на 10% (Sauer et al, 2008).
В настоящее время ЯК получают методом химического синтеза из малеиновой кислоты или ее ангидрида, с использованием дорогостоящего катализатора ванадия. Известно, что малеиновая кислота и соединения ванадия являются клеточными ядами, и даже небольшие их примеси резко снижают качество ЯК. Также для получения ЯК используется процесс термического разложения янтаря и его очистки путем многократной перекристаллизации; однако этот процесс является дорогостоящим.
В последние годы наиболее перспективным рассматривается микробиологический синтез ЯК, при котором произведенный продукт характеризуется высокой чистотой и по своему конформерному составу близок к природной субстанции. По оценке специалистов замена химического метода получения ЯК на микробиологический снизит не только риск загрязнения окружающей среды, но и увеличит производство ЯК с 16 до 270 000 т/год, что, в свою очередь, может существенно расширить сферы применения ЯК и химических соединений, полученных на её основе.
В литературе имеется мало сведений о сверхсинтезе ЯК микроорганизмами. В лабораториях США, Китая и Франции предпринимались попытки разработать промышленный процесс получения ЯК с помощью различных генетически-модифицированных мутантных штаммов анаэробных бактерий Anaerobiospirillum succiniciproducens, Actinobacillus succinogenes, Escherichia coli и Mannheimia succiniciproducens при их росте на углеводах. Эти работы не привели к положительным результатам в связи с тем, что мутанты со временем теряли свою кислотообразующую активность. Имеются данные о сверхсинтезе ЯК у аэробных организмов - дрожжей и грибов (Sato et al., 1972; Ермакова, Мандева, 1981), но дальнейшего развития эти исследования не получили. Большая потребность в ЯК при всей сложности её химического синтеза, делает проблему разработки микробиологического способа её получения весьма актуальной.
Цель и задачи исследования
Целью настоящей работы было изучение закономерностей синтеза ЯК дрожжами из этанола и разработка способа получения и выделения этого продукта.
В число основных задач входило:
Изучение способности дрожжей различного таксономического положения синтезировать ЯК;
Определение условий культивирования дрожжей, оптимальных для получения ЯК;
Исследование физиолого-биохимических особенностей роста дрожжей в среде с этанолом в условиях сверхсинтеза ЯК;
Разработка микробиологического способа получения ЯК из а-кетоглутаровой кислоты (КГК) с участием тиаминауксотрофных дрожжей Yarrowia lipolytica;
Разработка метода выделения и очистки препарата ЯК высокой чистоты;
Сравнение биологической активности полученного препарата с коммерческими синтетическими препаратами.
Научная новизна работы
Впервые установлена принципиальная возможность направленного синтеза ЯК дрожжами из этанола при лимитировании их роста источником азота; отобраны наиболее активные продуценты Candida zeylanoides ВКМ Y-2324 и С. catenulata ВКМ Y-5; оптимизированы условия культивирования (рН среды, концентрация растворенного кислорода) и состав питательной среды (концентрации азота, этанола и микроэлементов), обеспечивающие максимальный синтез ЯК.
Показано, что сверхсинтез ЯК у С. zeylanoides ВКМ Y-2324 и С. catenulata ВКМ Y-5 обусловлен особенностью функционирования глиоксилатного цикла, в частности высокой активностью ферментов цитратсинтазы, аконитат-гидратазы и изоцитрат-лиазы.
Впервые разработан принципиально новый способ получения ЯК, включающий последовательный микробиологический синтез КГК из этанола тиаминауксотрофными дрожжами Y. lipolytica ВКМ Y-2412 и ее дальнейшее эквимолярное окисление до ЯК под воздействием перекиси водорода. Разработана схема выделения ЯК из культуральной жидкости и очистка её до высокой чистоты.
Практическая значимость работы
Предложенный микробиологический способ получения ЯК может заменить дорогостоящий химический синтез. ЯК, полученная данным способом, обеспечивает требуемый уровень чистоты и биологической активности, позволяющий использовать её в медицине, пищевой промышленности и сельском хозяйстве (протокол о проведении процесса биосинтеза и приготовлении опытной партии янтарной кислоты на базе Опытной технологической установки ИБФМ РАН от 20.04.11, протокол о проведении испытаний янтарной кислоты на содержание токсичных элементов ООО «ИЛ Тест-Пущино» № 2695 от 25.04.11, отчёт о проведении доклинических испытаний ГОУ ВПО РГМУ Росздрава № 22/10 от 15.04.10).
Апробация работы
Основные материалы диссертации были представлены на Международных Пущинских школах-конференциях для молодых учёных (2007, 2008, 2010), ежегодных стендовых сессиях ИБФМ РАН (2007-2009), Международной школе-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология» (Москва, 2008), Первом научно-практическом симпозиуме «Научная молодёжь - биотехнологии России», (Пущино, 2008), Российском молодёжном инновационном конвенте (Москва, 2008), Форуме молодых учёных и 35-ом FEBS конгрессе (Ґетеборг, Швеция, 2010).
Публикации
По теме диссертационной работы опубликовано 12 печатных работ, в том числе, 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК.
Структура и объём диссертации
Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание материалов и методов исследований, изложение полученных результатов и их обсуждение, заключения, выводов, списка цитируемой литературы, приложений. Работа
изложена на страницах, содержит таблицы и рисунков. Список
литературы включает наименований, из них - публикации в
иностранных изданиях.
Янтарная кислота, её характеристика и применение
Для оценки экономической эффективности крупномасштабных биотехнологических процессов получения органических: кислот важными являются не только такие характеристики, как выход продукта и производительность процесса, но и стоимость углеродного сырья и затраты на выделение и очистку целевого продукта. И зачастую высокие концентрации продукта в среде и (или) высокая производительность процесса ещё не всегда являются показателями эффективной технологии. Например; процессы, в которых концентрация получаемого продукта довольно высокая, но при этом используется дорогое сырье, или процессы, в которых используют дешевый субстрат, но стоимость очистки целевого продукта при этом высокая, могут не дать никакого экономического эффекта. Очевидно, что эти факторы взаимосвязаны. Например, рафинированный сахар является весьма дорогим сырьём для ферментации, но в тоже время использование такого чистого субстрата существенно снижает затраты на очистку целевого продукта. С другой стороны, растительное сырьё значительно дешевле, однако наличие примесей в субстрате существенно усложняет ведение процесса ферментации и очистки, и как следствие, сказывается на себестоимости целевого продукта (Sauer et al., 2008).
Тем не менее, в последнее время всё большее внимание уделяется дешевому растительному сырью, отходам лесной и сельскохозяйственной промышленности в качестве субстратов для микробиологических процессов получения органических кислот.
Примером этого является использование лигноцеллюлозного сырья для-получения целлюлозы, гемицеллюлозы и лигнина. Целлюлозу и лигнин подвергают дальнейшему гидролизу для получения Сахаров, которые затем используют в качестве сырья для различных микробиологических процессов (Sauer et al., 2008). Показано, что при утилизации гидролизатов гемицеллюлозы грамположительными бактериями Bacillus coagulans в среде накапливалась молочная кислота (Patel et al., 2005).
Для эффективного синтеза органических кислот важен и такой параметр, как морфология культуры (Berovic and Legisa, 2007; Magnuson and Lasure, 2004; Grimm et al., 2005). Например, для процессов биосинтеза лимонной кислоты (JIK) было показано, что рост грибов-продуцентов в виде пеллетов размером около 1 мм является наиболее оптимальным, поскольку при таком морфологическом состоянии гриба наблюдается максимальная производительность процесса (Magnuson and Lasure, 2004).
Важное внимание при разработке микробиологических процессов следует уделять вопросу выбора методов ведения ферментации. Например, известны приёмы иммобилизации клеток и их неоднократного использования в процессах биосинтеза. Такой подход был реализован при получении молочной кислоты в полунепрерывном процессе ферментации с использованием иммобилизованных клеток молочнокислых бактерий, (Sirisansaneeyakuletal., 2007).
Неотъемлемой частью оптимизации процесса является сокращение расходов на очистку целевого продукта,, поскольку, как было указано выше, эта процедура во многом сказывается на себестоимости конечного продукта.
Ряд технологических проблем можно решить путём простой селекции штамма-продуцента и оптимизации условий культивирования. Однако в настоящее время использование методов молекулярной биологии открывает новые подходы в конструировании штаммов с заданными свойствами. Так с помощью генетических манипуляций, направленных на снижение образования побочных продуктов, ферментации, удалось повысить эффективность биосинтеза ЯК у бактерий Mannheimia succiniciproducens (Lee et al., 2006; Song et al., 2007).
Определённые трудности возникают при культивировании штаммов-продуцентов в производственных условиях, поскольку продуцент, как правило, подвергается воздействию различных стрессовых факторов; Как следствие, происходит снижение темпов роста штамма и его жизнеспособности, что сказывается на производительности процесса. Устойчивость штамма к различным условиям производственной среды, является ключевым фактором, определяющим эффективность микробиологического процесса получения органических кислот.
На сегодняшний; день основная проблема заключается в TOMJ, что зачастую разработанные микробиологические способы получения органических кислот бывает трудно реализовать в промышленном масштабе ш требуется тщательный анализ воздействия различных параметров на эти процессы (Sauer et al., 2008).
И, тем не менее, поскольку по оценкам экспертов в ближайшем будущем микробиологические процессы» производства органических кислот станут вполне конкурентоспособными по сравнению с их: химическим синтезом, их разработка является первостепенной задачей (Hermann and Patel, 2007).
Рассмотрим процессы получения отдельных органических кислот. Лимонная кислота и Tpeo-Ds-изолимонная кислота Наиболее важная-пищевая кислота —лимонная, производится в количестве 1 млн 600 тыс. т/год, её производство ежегодно увеличивается не менее чем на 5% (Berovic and Legisa, 2007). По оценкам специалистов емкость российского рынка составляет около 10 тыс. т ЛК/г. ЛК является самым популярным подкислителем, она также применяется как консервант при изготовлении продуктов питания и напитков. Соли ЛК - цитраты, применяются в качестве вкусовых добавок при изготовлении пищевых продуктов или как заменители полифосфатов при производстве синтетических моющих средств.
Первоначально ЛК производили путём экстракции продукта из итальянских лимонов. Однако в дальнейшем её стали получать из углеводов с помощью грибов родов Aspergillus и Penicillum. В 1927 г. исследователями была выявлена определённая взаимосвязь между синтезом цитрата и азотным питанием гриба A. niger, и было показано, что синтез ЛК происходил после полного потребления азота из среды. В дальнейшем установлено, что такие элементы как фосфор, сера, магний и калий, концентрация кислорода в среде и рН также влияют на процесс кислотообразования у A. niger (Буткевич, Тимофеева, 1935; Kubicek, Rohr, 1977). Результаты этих экспериментальных исследований были положены в основу разработки промышленных процессов получения ЛК из углеводных субстратов с помощью грибов.
В настоящее время пищевую ЛК получают с помощью плесневых грибов А. niger из отходов! сахарного производства — мелассы. Эта технология достаточно сложная, требующая не только специального оборудования, но и соблюдения высоких санитарно-гигиенических нормативов.
В качестве перспективного продуцента ЛК рассматриваются дрожжи Yarrowia lipolytica. В 60-х годах прошлого века исследователей привлекло направление, связанное с изучением процессов биосинтеза ЛК дрожжами, что, в первую очередь, было связано с использованием в качестве субстрата парафинов нефти. В нашей стране эти работы проводились в Отделе биоэнергетики Института биохимии и физиологии. микроорганизмов под руководством А.Б. Лозинова. Был детально изучен процесс кислотообразования у дрожжей Y. lipolytica при росте в среде с н-алканами, глюкозой, глицерином, этанолом и другими субстратами в условиях периодического культивирования (Финогенова и др., 1973; Финогенова, 1975, Финогенова и др., 1979). Были также получены мутантные штаммы дрожжей Y. lipolytica и разработана технология получения технической Л К и цитрата натрия (Лозинов и др., 1982) и изолимонной кислоты (ИЛК) (Илларионова и др., 1983) и монокалиевой соли ИЛК (Романова и др., 2000) из жидкого парафина.
В дальнейшем была разработана технология получения ЛК и ИЛК из этилового спирта для применения в пищевой промышленности и медицине (Фаусек, 1991а; Фаусек и др., 19916; Finogenova et al., 1991). Был также детально изучен один из мутантных штаммов дрожжей Y. lipolytica N 1 в условиях непрерывного культивирования на этаноле (Камзолова, 1995; Камзолова и др., 1996а; Финогенова и др., 1996; Камзолова и др., 19966) и разработан процесс получения ЛК и цитрата калия из пищевого спирта (Финогенова и др., 1997). В последующем работа была направлена на поиск более дешёвого спиртсодержащего сырья и разработке полунепрерывного метода ферментации (Шишканова и др., 1998а; Шишканова и др., 19986; Арзуманов, 1998; Arzumanov et al., 2000).
Интересные работы по изучению биосинтеза ЛК дрожжами Y. lipolytica представлены также в иностранной литературе. Были описаны процессы получения ЛК на н-алканах (Crolla and Kennedy, 2004) и жирных кислотах (животные жиры) (Papanikolaou et al., 2006). Также в качестве субстратов для культивирования исследованы глюкоза и сахароза (Forster et al., 2007).
Однако, данные о промышленном получении пищевой ЛК с помощью дрожжей Y. lipolytica отсутствуют (Lopez-Garcia, 2002). Тем. не менее, внедрение технологии получения ЛК с помощью дрожжей может не только сократить расходы на производство, но и существенно повысить чистоту получаемого продукта, тогда как при традиционном производстве ЛК не всегда удаётся, получить продукт со стабильно высоким качеством.
Метод получения янтарной кислоты из культуралыюй жидкости дрожжей Y. lipolytica
Для определения содержания органических кислот был использован метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC).
Для анализа отбирали 1 мл культуральной жидкости, центрифугировали 6 минут при 8000 об/мин; далее отбирали 0,5 мл надосадочной жидкости и добавляли 0,5 мл 6% HCIO4, тем самым осаждались белки, затем пробу центрифугировали в эппсндорфах (6 минут при 8000 об/мин).
Элюцию вели при следующих условиях: скорость элюции 1 мл/мин; температура 35 С, в качестве элюанта использовали фосфорную кислоту 20 мМ. В работе использовали HPLC хроматограф фирмы LKB (Швеция) и колонку фирмы Элсико (Россия) с обращенной фазой Inertsil ODS-3 (250x4мм). Регистрацию кислот проводили при длине волны 210 нм. Органические кислоты (а-кетоглутаровая, лимонная, уксусная, фумаровая, яблочная, янтарная) идентифицировали с соответствующими стандартами (реактивы фирмы «Реахим» (Россия) и «Sigma» (США)).
В основе определения ЯК энзиматическим методом лежит реакция превращения ЯК в сукцинил-КоА с помощью фермента сукцинил-КоА-синтетазы (сукцинат-тиокиназы) в присутствии инозин-5 -трифосфата и Ко А, которые превращаются в инозин-5 -дифосфат и неорганический фосфор. Инозин-5 -дифосфат реагирует с фосфоенол-пируватом в присутствии пируват-киназы с образованием пирувата и инозин-5 -трифосфата. Пируват превращается в лактат с помощью лактатдегидрогеназы. При этом НАДН окисляется до НАД. Количество окисленного НАДН эквимолярно количеству содержащейся в среде ЯК. В процессе проведения определений использовались реактивы в следующих количествах:
Определение проводили следующим образом. В кювету вносили 1,0 мл реактива 2, 0,05 мл реактива 3, 0,1 мл пробы и 1,9 мл дистиллированной воды, тщательно перемешивали, инкубировали при температуре 37 С в течение 5-10 мин. Количество окисленного в данной реакции НАДН определяли спсктрофотометрически на спектрофотометре «Shimadsu» при длине волны 340 нм (экстинкция Ei). Затем в кювету вносили 0,02 мл фермента сукцинил-КоА-синтетазы, вновь перемешивали, инкубировали при температуре 37 С в течение 20 мин и измеряли экстинкцию Ег. Измерения велись против воды. Для контроля реактивов вместо пробы использовали раствор ЯК с высокой степенью очистки (1,4 мг/мл).
Количество НАДН определяли спектрофотометрически на спектрофотометре «Spekol» (ГДР) при длине волны 340 нм. Определение проводили следующим образом. В кювету вносили 2,5 мл 0,2 М трис-буфера с НАДН, 0,1 мл образца и 0,01 мл 2,8 М (NH SC и измеряли экстинкцию Е[. Затем в кювету вносили 0,01 мл фермента глутаматдегидрогеназы инкубировали в течение 5-10 мин и измеряли экстинкцию Е2. Измерения велись против трис-буфера.
Реакция протекает при комнатной температуре и начинается при добавлении НАДФ. Увеличение оптической плотности регистрируется каждые 0,5 — 1,0 минуты до тех пор, пока не будет получено постоянное значение. При молекулярной экстинкции 6,22-103 для НАДФ увеличение оптической плотности на 0,01 соответствует восстановлению 0,0048 мкмоль НАДФ или окислению 0,924 изоцитрата. Точность определения ИЛК данным методом составляет 90-95%.
Содержание липидов определяли по методу Султановича (Султанович и др., 1982). Метиловые эфиры жирных кислот анализировали методом ГЖХ на хроматографе «Chrom-5» с пламенно-ионизационным детектором. Колонка 2 м х 3 мм с 15% «Reoplex 400», нанесённым на «Chromaton N-AW» (0,16-0,200 мм). Температура колонки составляла 200 С. К биомассе последовательно, добавляли ацетилхлорид и метанол, кипятили до выпаривания растворителей, остаток обрабатывали гексаном. Содержание липидов в биомассе определяли по сумме жирных кислот, используя в качестве внутреннего стандарта докозан (СггЩб) или гептадекановую кислоту.
Получение бесклеточных экстрактов. Клетки отделяли от культуральной жидкости центрифугированием; при 5 000 g в течение 10 мин и дважды промывали 0,9% раствором NaCl. Клетки ресуспендировали в 50 мМ калий-фосфатном буфере, рН=7,5, содержащем 1 мМ ЭДТА, 5 мМ ДТТ и 0,3 мМ фенилметилсульфонилфторида, и разрушали с применением стеклянных бус «баллотини» (100 - 150 мкм) на планетарной мельнице при 1 000 об./мин в течение 3 мин. Также в некоторых экспериментах дезинтеграцию дрожжей проводили на прессе Френча.
Суспензию, полученную после разрушения, центрифугировали при 10 000 g в течение 30 мин для удаления неразрушенных клеток и клеточных фрагментов. Все процедуры проводили при температуре 4 С.
Определение активности ферментов. Активности ферментов измеряли на двухлучевом спектрофотометре Shimadzu UV-160 (Япония) при температуре 25 С.
В бесклеточных гомогенатах дрожжей определяли активность следующих ферментов. Активность цитратсинтазы определяли по методу, описанному Srere (Srere, 1969). Реакционная смесь содержала 0,25 мМ оксалоацетата натрия, 0,25 мМ ацетил-СоА, 0,10 мМ ДТНБ, 100 мМ трис-НСЬ буфера (рН=8,5).
Влияние концентрации этанола на рост дрожжей С. catenulata и С. zeylanoides
Опыты были проведены в 10-ти литровом ферментере АНКУМ-2М в среде с низким содержанием тиамина. Культивирование дрожжей Y. lipolytica 212 проводили без Н2О2 (рис 15а) и в присутствии Н2О2 (рис. 156).
При культивировании дрожжей Y. lipolytica 212 без добавления НгОг, кривая роста имела укороченную лаг-фазу и четко выраженные экспоненциальную фазу (до 24 ч), фазу замедления «роста (до 96 ч) и стационарную фазу (рис. 15а). На основании данных о накоплении биомассы была рассчитана максимальная удельная скорость роста (цтах) которая достигала своего максимального значения (0,122 ч" ).
Синтез КГК начинался после 21 ч в начале фазы замедления роста. В контрольном опыте в отсутствие Н2О2 в культуральной жидкости на 8 суток содержалось 60,8 г/л КГК и 1,0 г/л ЯК. Содержание других органических кислот было незначительным. Расход этанола в процессе культивирования составил 124 мл/л.
После окончания процесса ферментации, культуральную жидкость, содержащую 60,8 г/л (416 мМ/л) КГК фильтровали, и фильтрат обрабатывали 2000 мМ/л Н2О2. Концентрация ЯК составила 49,1 г/л (416 мМ/л).
Культивирование дрожжей Y. lipolytica 212 в присутствии Н2О2 не оказывало заметного влияния на накопление биомассы. Максимальная удельная скорость роста (Umax) была равна (0,115 ч 1).
Однако процесс кислотообразования был более интенсивным (рис. 156). В ходе культивирования в несколько приемов была внесена Н2О2 (560 мМ/л), при которой происходило частичное окисление КГК до ЯК. На 8 сутки культивирования в присутствии Н2О2 в культуральной жидкости накапливалось 60,8 г/л КГК и 14,3 г/л ЯК с незначительным содержанием других кислот. Расход этанола в процессе культивирования составил 164 мл/л. И 15 (А ) без добавления Н2О2 (а) и в присутствии Н2О2 (б). Стрелками показано добавление Н2О2. Следует отметить, что имелись некоторые трудности с проведением процесса культивирования дрожжей в присутствии Н2О2, так как в, ходе декарбоксилирования КГК до ЯК происходило образование углекислого газа и пенообразование, что с технологической точки зрения-мешало проведению процесса в ферментёре. Поэтому дальнейшая работа по полному окислению КГК до ЯК проводилась уже в фильтрате культуральной жидкости, а не в ферментёре.
При инкубации фильтрата культуральной жидкости с 2250 мМ/л Н2О2 наблюдалось полное окисление 60,8 г/л КГК (416 мМ/л) до ЯК (на HPLC-хроматограмме обнаружен только пик ЯК); суммарная концентрация ЯК (49,1 г/л + 14,3 г/л) составила 63,4 г/л (537мМ/л).
Такимі образом, в данном разделе работы была показана принципиальная возможность получения ЯК из КГК при культивировании дрожжей Y. lipolytica 212 в присутствии Н2О2. Такой способ получения ЯК позволил повысить эффективность процесса на 29% (с 416 мМ/л до 537 мМ/л ЯК) в сравнении! с культивированием дрожжей без Н2О2.
При разработке способа выделения соединения из раствора, прежде всего, учитываются индивидуальные свойства соединения, его концентрация в смеси, наличие и характер сопутствующих компонентов. Выделение многоосновных кислот из культуральных жидкостей и природных объектов?в-большинстве случаев основано на получении плохо растворимых кальциевых (лимонная, молочная, винная) или монокалиевых солей (изолимонная, Х.-кетоглутаровая).
Разработанный нами, метод выделения ЯК в, отличие от других карбоновых кислот базировался на относительно хорошей растворимости этой кислоты в органических растворителях. ЯК возможно экстрагировать этанолом из культуральной жидкости и получать сразу в виде кислоты, а не в солевой форме. Были учтены также дваї момента: подкисление фильтрата культуральной жидкости для перевода ЯК из солевой формы в свободную кислоту необходимо осуществлять серной кислотой, поскольку большинство сульфатов хуже растворимы в органических растворителях чем, например, хлориды. Для регулирования рИ культуральной жидкости в процессе ферментации использовать гидроксид калия, поскольку образующийся в дальнейшем сульфат калижпрактически не растворим в спирте.
Последовательность операций сводилась к разложению остаточных количеств перекиси, обесцвечиванию нативного раствора, подкислению и концентрированию фильтрата. ЯК экстрагировали этанолом и после отгонки спирта перекристаллизовывали остаток.
Выделение ЯК из культуральной жидкости дрожжей Y. lipolytica
В итоге настоящей работы.показана возможность практического получения ЯК из этанола при культивировании дрожжей.
В результате исследований было установлено, что способность к экскреции ЯК характерна для многих видов дрожжей, относящихся к родам Candida, Debaromyces, Pichia, Yarrowia, Kluyveromyces, Torulopsis и Saccharomyses при росте в среде с этанолом.
В качестве наиболее активных продуцентов ЯК были отобраны штаммы С. zeylanoides ВКМ Y-2324 и С. catenulata ВКМ Y-5 и с ними проводилась дальнейшая работа по подбору условий культивирования оптимальных для роста и накопления ЯК.
Следует отметить, что использование этанола в качестве источника углерода для культивирования создаёт определённые трудности из-за токсичности этого соединения для клеток дрожжей. Поэтому исследовали влияние этанола на рост дрожжей С. catenulata и С. zeylanoides в широком дипазоне концентраций. Было установлено, что этанол следует вносить в среду культивирования дробно в количестве не превышающем 1,0 г/л для С. catenulata и 3,0 г/л для С. zeylanoides.
При исследовании потребности дрожжей С. catenulata в азоте была получена линейная зависимость между плотностью биомассы и концентрацией сульфата аммония в среде, которая имела следующий вид: Y = 4,35х + 0,673. Использование данной зависимости может быть полезной при масштабировании процессов культивирования дрожжей с целью определения концентрации азота для получения запланированной рабочей биомассы в ферментере.
В дальнейших экспериментах была показана важная роль цинка, который входит в активный центр НАД-зависимой алкогольдегидрогеназы — первого фермента окисления этанола. Было определено, что различные концентрации цинка в среде оказывают влияние на рост и синтез ЯК дрожжами. Так, у С. zeylanoides концентрация ионов Zn2+ ниже 0,2 мг/л лимитировала рост культуры, и синтез. ЯК отсутствовал. Концентрация ионов Zn +, равная 0,4 мг/л, была оптимальной для роста С. zeylanoides и продукции ЯК. Дальнейшее повышение концентрации ионов цинка вызывало снижение накопления биомассы и синтеза ЯК. Для С. catenulata обнаружен более широкий диапазон концентраций ионов Zn + (0,02 — 200 мг/л), оптимальных для роста клеток и биосинтеза ЯК. Наибольшая продукция ЯК наблюдалась при концентрации ионов Zn2+, равной 26 мг/л. Установлено, что важным фактором, влияющим на рост дрожжей и синтез ЯК, является аэрация, и активное кислотообразование наблюдается в условиях интенсивной аэрации среды.
При проведении процесса ферментации в оптимальных условиях в аппаратах АНКУМ-2М на 68 ч роста С. catenulata экскретировали 5,2 г/л ЯК, а С. zeylanoides — 9,4 г/л ЯК. Выход ЯК для С. catenulata и С. zeylanoides составлял 32,6% и 39% соответственно. В значительных количествах в качестве побочного продукта происходило накопление яблочной кислоты. Эти данные указывали на активное функционирование ГЛЦ в продукции ЯК из этанола.
Действительно, было установлено, что активности ферментов ЦТК - НАД-изоцитратдегидрогеназы и кетоглутаратдегидрогеназы были низкими, а активность изоцитрат-лиазы (ключевого фермента ГЛЦ) сохранялась на высоком уровне в экспоненциальной фазе и поддерживалась достаточно высокой в период синтеза ЯК (0,64 Ед./мг белка).
Также проводили сравнительное изучение активности изоцитрат-лиазы у 11 штаммов дрожжей, способных к продукции ЯК на этаноле. В качестве контроля использовали рост этих штаммов на глюкозе, когда синтез ЯК был незначительный. У всех штаммов при росте на этаноле активность изоцитрат-лиазы была существенно выше активности фермента у клеток, растущих на глюкозе. Таким образом, полученные данные позволяют сделать заключение, что сверхсинтез ЯК у исследуемых дрожжей являлся результатом активного функционирования ГЛЦ на среде с этанолом.
Следующим этапом работы явилась разработка метода получения ЯК, включающий синтез КГК с использованием дрожжей Y. lipolytica 212 и её дальнейшее окисление до ЯК в присутствии перекиси водорода.
Был отобран продуцент КГК - дрожжи Y. lipolytica 212, и подобраны условия, которые обеспечивали максимальное кислотообразование штамма при росте в среде с этанолом: высокая аэрация среды и рН=3,5-6,0.
Была также проверена и доказана возможность проведения реакции декарбоксилирования КГК до ЯК в фильтрате культуральной жидкости и подобрана концентрация перекиси водорода (100 мМ/л), которая не ингибировала рост дрожжей.
На базе опытной технологической установки ИБФМ РАН проведена апробация процессов биосинтеза КГК из этанола дрожжами Yarrowia lipolytica 1X1 и ее дальнейшее химическое декарбоксилирование до ЯК под воздействием перекиси водорода. Проведено три цикла биосинтеза ЯК в ферментерах объемом 10 - 100 л, а также выделения и очистки ЯК. Накопление продукта при биосинтезе составило около 63 г/л, выход готового продукта, соответствующего требованиям СанПиН 2.3.2.1078-0 после выделения и очистки в среднем составил 55%. (Приложение 1); чистота кристаллов ЯК составила 99,9%.
На заключительном этапе работы препарат ЯК сравнивали по биохимическим параметрам с ЯК фирмы Sigma. Было показано, что различия между препаратом ЯК, полученным нами и коммерческим препаратом ЯК фирмы Sigma минимальны.
В связи с тем, что ЯК планировалось использовать в доклинических испытаниях, эта кислота была проанализирована на содержание токсичных элементов аккредитованной организацией ООО «ИЛ ТЕСТ-ПУЩИНО». Установлено, что их содержание в препарате было в 5-10 раз ниже ПДК (Приложение 2).
Также на базе Испытательного лабораторного центра Российского государственного медицинского университета (г. Москва) было проведено изучение острой токсичности и характера вредного действия ЯК на организм животных. Было сделано заключение о том, что ЯК является малоопасным веществом при введении в желудок лабораторным животным (4 класс опасности по ГОСТ 12.1.007-76), не обладает кожно-резорбтивным действием, оказывает раздражающее действие на кожу и слизистые оболочки. Сенсибилизирующее действие кислоты не обнаружено. Предварительное введение в желудок белым мышам ЯК в дозе 1000 мг/кг оказывало антигипоксическое действие (Приложение 3).
