Содержание к диссертации
Введение
1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 7
1.1. Пенициллинацилазы 7
1.1.1. Общие свойства 7
1.1.2. Строение активного центра ПА поданным РСА 8
1.1.3. Механизм катализа 10
1.1.4. рН-профилъ каталитической активности и стабильности ПА
1.1.5. Субстратная специфичность 14
1.1.6. Стереоспецифичность 16
1.2. Пенициллинацилазы в реакциях синтеза 17
1.2.1. Синтез р-лактамных антибиотиков 17
1.2.1.1. Кинетические закономерности ацильного переноса на ядра антибиотиков 18
1.2.2. Ацилирование аминосоединений 21
1.3. Ферменты в тонком органическом синтезе 24
1.3.1. Использование ферментов в реакциях конденсации 25
1.3,1.1. Селективное ацилирование полнфункционалыгых субстратов 26
1.3.2. Ферментативное получение оптически активных соединений 29
ПОСТАНОВКА ЗАДАЧИ 33
2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 34
2.1. Материалы 34
2.2. Методы 35
2.2.1. Определение активности пеннциллинацилаз 35
2.2.2. Определение компонентов реакционной смеси методом ВЭЖХ 36
2.2.3. Определение оптической чистоты аминосоединений 37
2.2.4. Изучение растворимости компонентов реакции 38
2.2.5. Исследование кинетических закономерностей реакций ферментативного ацильного переноса 39
2.2.5.1. Определение зависимости соотношения начальных скоростей синтеза/гидролиза от концентрации аминосоединения 39
2.2.5.2. Определение соотношения констант специфичности при ферментативном гидролизе ацильного донора и продукта переноса 39
2.2.6. Слежение за реакцией синтеза ацильных производных аминов п аминокислот 40
2.2.7. Хемо-энзиматическнй синтез дикетопиперазннов 41
2.2.8. Слежение за ферментативным гидролизом рацематов N-ацнльных производных аминосоединений 42
2.2.9. Получение рацематов R-фенилглицильных производных аминосоединений 43
2.2.10. Разделение энантиомеров СС-РЕА 44
2.2.11. Разделение энантиомеров 2-амнно-4-феннлбутана 45
2.2.12. Разделение энантиомеров 2-амино-1-бутанола 45
2.2.13. Обработка результатов и вычисления 47
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 48
3.1. Кинетические закономерности реакций а пильного переноса на аминосоединения, катализируемого пенициллинаиилазон 48
3.1.1. Ацилирование аминокислот 49
3.1.2. Ацилирование аминов и аминоспиртов 51
3.1.3. Стереоселективное ацилирование аминосоединений 54
3.1.3.1, Установление кинетической схемы 54
3.1.3.2, Энантиоселективность реакций ферментативного ацильного переноса по отношению к нуклеофилу 58
3.1.3.3, Стереоселективное ацилирование аминосоединений при использовании R-фенилглицинамида в качестве ацильного донора 62
3.2. Влияние структуры ацильного донора в реакциях ацилирования 65
3.2.1. Характеристика доноров ацильной части 65
3.2.2, Зависимость эффективности и стереоселективности ацильного переноса от природы
донора 66
3.3. Моделирование интсгральнон кинетики ацилирования аминосоединений.... 72
3.4. Влияние различных факторов на эффективность стерео селективного ацилирования 75
3.4.1. Влияние растворимости N-ацилированного продукта 77
3.4.2, Влияние концентраций реагентов 79
3.4.3, Влияние ионной силы и температуры 80
3.4.4. Использование пативных и иммобилизованных препаратов пенициллннацнлазы 85
3.5. Синтез стереопзомерно чистых соединений при использовании пенициллішашілаз 87
3.5.1. Синтез N-ацильных производных S-аминокислот 87
3.5.2. Региоселективное ацилирование аминогрупп лнзинаи орнитина 91
3.5.3. Хемо-энзиматический синтез дикетопиперазинов 94
3.6. Получение энантиомеров аминов и аминоспиртов при использовании пенициллинацнлаз 99
3.6.1. Выбор донора ацильной части 100
3.6.2. Интегральный биокаталитический метод 104
3.6.3. Модификация интегрального биокаталитического метода. Циклический подход 108
3.6.4. Сравнение методов получения индивидуальных энантиомеров 113
ВЫВОДЫ 115
ПРИЛОЖЕНИЕ 116
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 121
- Пенициллинацилазы
- Материалы
- Кинетические закономерности реакций а пильного переноса на аминосоединения, катализируемого пенициллинаиилазон
Введение к работе
Актуальность проблемы. Пенициллинацилазы (ПА) - биокатализаторы промышленного значения, используемые в производстве пенициллинов и цефалоспоринов. В последние годы показано, однако, что ферменты этого семейства обладают существенно более широкой субстратной специфичностью. Открытая недавно способность малоизученной ПА из Alcaligenes faecalis катализировать высокоэффективное и стерео селективное ацилирование аминов в водной среде послужило стимулом, определившем цель настоящего исследования - выяснение причин того, чем обусловлен столь эффективный синтез амидной связи, катализируемый гидролазой в 100% водной среде, каковы его ограничения, какие возможности открывает использование этого подхода. Особый интерес представляет использование таких реакций для получения оптически чистых соединений, а также для разделения энантпомеров веществ. Кроме того, использование биокатализа в водных средах является одной из главных тенденций развития современной промышленности в связи с растущими экологическими требованиями. Цель и задачи исследования. Целью работы явилось исследование кинетических закономерностей реакций ацильного переноса на первичную аминогруппу различных классов соединений, катализируемого ПА из A.faecalis в водной среде, включая стереоселективность ацилирования; выявление факторов, влияющих на эффективность синтеза N-ацильных производных и разделения энантиомеров ам и но соединений, определение оптимальных условий этого процесса; разработка и апробация новых методов препаративного синтеза хиральных N-ацильных производных и получения индивидуальных энантиомеров аминосоединений при использовании как ПА из A.faecalis, так и ПА из Escherichia colt.
Научная новизна. Впервые показано, что ферментативное ацилирование высокоосновных аминосоединений, катализируемое ПА из A.faecalis в водной среде, протекает через
стадию образования ацилфермент-нуклеофильного комплекса, выявлены особенности ацильного переноса на различные классы аминосоединений. Предложены "минимальные" кинетические схемы стереоселективного ацилирования аминокислот и аминов/аминоспиртов, на основании которых разработан алгоритм моделирования, позволяющий адекватно описать протекание реакции в условиях гомогенных и гетерогенных систем. Проанализировано влияние различных факторов на эффективность синтеза N-ацильных производных и разделения энантиомеров аминосоединений. Разработана методология определения ключевых кинетических параметров стереоселективного ферментативного ацильного переноса в водной среде. Впервые на количественном уровне показано влияние структуры ацильного донора на эффективность реакций ацильного переноса и стерео селективность по отношению к нуклеофнлу. Разработан и апробирован принципиально новый полностью биокаталитический метод разделения энантиомеров аминосоединений в водной среде.
Практическая значимость работы. Разработаны методы препаративного синтеза оптически активных N-ацильных производных аминокислот и дикетопиперазинов, избирательного ацилирования аминогруппы в боковой цепи аминокислот, основанных на использовании ПА из A.faecalis и Е.соїі в водной среде. Предложенный интегральный метод получения индивидуальных энантиомеров аминосоединений, сочетающий ферментативную реакцию стереоселективного ацилирования их рацематов и последующего ферментативного деацилирования в водной среде, по своей эффективности значительно превышает другие известные примеры из научной и патентной литературы в области препаративной хир отехноло гии.
Пенициллинацилазы
Опубликованные в 1995 году данные по рентгеноструктурному анализу (РСА) ПА из Exoli, а также комплексов фермента с ФУК, фенил метил сульфонил фторидом [31] и другими ингибиторами [20] позволили сформировать основные представления о структуре и гипотезу о механизме каталитического действия данного фермента.
Общий вид гетеродимера тнициллинацилазы из E.coli, построенный на основании данных РСА. Усредненные размеры составляют 70x50x55 А. Синим цветом показана а-субъединица, красным - Р-субъединица фермента.
Гетеродимер пенициллинацилазы состоит из двух тесно переплетенных цепей без очевидных дискретных областей с глубокой чашеобразной выемкой в центре (рис. 1). Из анализа структуры комплекса фермента с ФУК, являющейся сильным конкурентным ингибитором, следует, что связывание субстрата происходит внутри выемки, на дне которой находится гидрофобный "карман", образованный многочисленными ароматическими аминокислотными остатками. Фенильная часть ингибитора направлена внутрь этого "кармана", а карбоксильная группа взаимодействует с серином pi. Специфичность фермента к фенилацетильной группе объясняется комплементарностью фенилацетильного остатка и участка связывания ацильной группы субстрата активного центра фермента. Предполагается, что нуклеофильность гидроксилъной группы N-концевого серина pi увеличивается за счет взаимодействия с собственной а-аминогруппой при участии молекулы воды [31].
В ранних работах по изучению ПА показано, что ФМСФ (специфический реагент на гидроксильную группу серина) ковалентно модифицирует ПА из Е.соИ [32, 33, 34], B.megaterium [35], P.rettgeri [36] и был сделан вывод о том, что реакции, катализируемые ПА, протекают через образование ацилферментного комплекса [33]. Позднее было найдено, что именно N-концевой Ser р-цепи является нуклеофилом активного центра ПА: замена Ser pi на цистеин сайт-направленным мутагенезом (ПА из Е.соИ [19]) или химической модификацией (ПА из E.coli [37] и Kxitrophila [38]) практически полностью подавляет активность фермента. Анализ структуры продукта взаимодействия ПА с ФМСФ, ацилферментного комплекса фенилметилсульфонил-ПА, на основании данных РСА, подтвердил эти предположения н позволил авторам [31] предложить ранее неизвестный механизм катализа, основанный на самоактивации N-концевого нуклеофила (рис. 2).
В отличие от сериновых протеаз, когда усиление нуклеофильности гидроксильной группы серина достигается за счет системы с переносом заряда Ser-His-Asp [39], вблизи N-концевого серина рі ПА нет оснований, поэтому предполагают, что нуклеофильность гидроксила Ser (31 усиливается собственной а-аминогруппой (рис. 2) [31]. ПА является представителем нового семейства ферментов, названные гидролазами с N-концевым нуклеофилом [18], в активном центре которых предполагается реализация ранее неизвестного механизма самоактивации нуклеофильного центра.
Материалы
В работе использовались следующие реактивы: 2-меркаптоэтанол, R- и S-a-фенилглицинол, R- и 5-1-(1-нафтил)этиламин, R- и S-l-(2-нафтил)этиламин, (±)-2-амино-4-фенилбутан, R-фенил глицин, R- и S-лейцшюл, R- и S-фенилалакинол, (±)-6-амино-2-метилгептанол гидрохлорид, (±)-2-ам и но-б-метил гептан, (±)-2-аминопентан, бензиламин - препараты Fluka (Швейцария);
м-карбокси-п-нитроанилид ФУК (NIPAB), S-аланин, S-лейцин, R- и S-a-PEA, (±)-a-PEA-препараты Sigma (США);
метанол, этанол, додецилсульфат натрия - препараты Merck (Германия); R- и S-лизин гидрохлорид - препараты Reanal (Венгрия); R- и S-фенилаланин- препарат Serva (Германия);
Феноксиацетамид, (±)-(п-хлор)-а-РЕА, 3-фенилпропиламин, глицин, S-изолейцин, S-трнптофан, S-гистидин, диметоксиэтан - препарат Across (Нидерланды); (±)-аланинол, (±)-гептиламин, (±)-2-аминобутан, (±)-3-метил-2-бутиламин, (±), R- и S-2-амино-1-бутанол - препараты DSM (Нидерланды)
Фен ил аистам ид, S- и R-валин, лейцин и другие а-ами но кислоты - препараты Реахим (Россия);
ФУК, (±)-1-фенил-1-этанол - препараты Aldrich Chemte (Германия); о-фталевый альдепщ - препарат Koch Light (Англия); ацетонитрил - препарат Криохром (Россия);
N-фенилацетильные производные лизина - препараты Constanta (Российско-Германское совместное предприятие); тартрат (±)-1-метил-2-фенилэтиламина, (±)-2-н-бутиламин, (±)-1,2-пропандиамин любезно предоставлены д.х.н. Гришиной Г.В.; другие реактивы и компоненты буферных растворов отечественного производства марки о.с.ч. и ч.д.а.
Все вещества, используемые для кинетических исследований, категории "хро мато графически чистые". Очищенный препарат ПА из A.faecalis (200 мкМ), Е.соН (286 мкМ), иммобилизованная ПА из A.faecalis (Separase 250 U/g) и иммобилизованная ПА из E.coli (Assemblase 315 U/g) предоставлены корпорацией DSM (Нидерланды).
Кинетические закономерности реакций а пильного переноса на аминосоединения, катализируемого пенициллинаиилазон
Возможность использования ПА из E.coli для синтеза N-фен ил ацетильных производных аминокислот известна давно, хотя и не изучена систематически. Между тем биокаталитическое разделение энантиомеров широкого круга амииосоединении и синтез N-ацильных производных представляет интерес для тонкого органического и пептидного синтезов, где легкость введения и снятия N-защитных групп в мягких условиях имеет принципиальное значение.
ПА относится к ферментам, которые имеют весьма ограниченное использование в неводных средах в силу низкой стабильности в таких растворителях. Основной осложняющий фактор использования ПА в реакциях ацильного переноса в водном растворе обусловлен действием воды как конкурирующего нуклеофила. Поэтому детальное исследование кинетических закономерностей реакций ацильного переноса на различные аминосоединения, катализируемые ПА в водной среде, позволит выявить критические факторы, ограничивающие эффективность ферментативного синтеза, построить алгоритм моделирования интегральной кинетики этих реакций и их оптимизации. В качестве ацильных доноров использовали традиционный фенилацетамид, а также ряд новых доноров - амиды феноксиуксусной кислоты, R- и S-миндальных кислот, R-фен ил глицина.
Как было отмечено ранее, анализ зависимости отношения начальных скоростей накопления продуктов синтеза и гидролиза (Л ///)0 от концентрации нуклеофила позволяет дискриминировать различные кинетические схемы реакций ацильного переноса [130, 132], поэтому первоначальные исследования были направлены именно на изучение влияния концентрации аминосоединения в реакционной смеси на начальные скорости накопления N-ацилированного продукта и продукта гидролиза активированного донора.
Сравнивая перспективы использования ПА из E.coli с ферментом из A.faecalis, следует отметить, что интерес к последнему связан с более широким рН оптимумом активности, сдвинутым в щелочную область. Этот фермент активен и стабилен при рН I См-10.5 в условиях депротонирования аминогрупп высокоосновных аминов и аминоспиртов, в то время как ПА из Е.соІі в этих условиях проявляет ншкую активность и быстро инактивируется, что ограничивает его применение,
Исследование кинетики ацильного переноса на аминокислоты, катализируемого ПА из A.faecalis показало, что при увеличении концентрации нуклеофила в реакционной смеси скорость накопления продукта гидролиза уменьшается, а скорость синтеза гиперболически возрастает (рис. 4, А). Зависимость отношения (Л ///)„ от концентрации нуклеофила описывается гиперболой (рис. 4, Б), что свидетельствует об образовании ацилфермент-нуклеофильного комплекса в ходе биокаталитического превращения (схема I), который может переноситься на аминогруппу нуклеофила (IQ) С образованием целевого продукта, так и на воду (к5) с образованием продукта гидролиза. Аналогичные зависимости получены ранее при исследовании кинетики ферментативного синтеза ампициллина, катализируемого ПА из A.faecalis [&9]и E.coli [41].
