Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 .Литературный обзор стр.11
1.1. Современные направления исследований и теоретические основы биотехнологии разведения осетровых в период ранней предличинки с. 11
1.2. Исследования генетической структуры популяций рыб. Селекционные и генетические исследования осетровых, как объектов аквакультуры С15
1.3. Исследования экспрессии и регуляции генов в раннем онтогенезе животных. Генная детерминация эмбриогенеза, связь содержания РНК/ДНК и роста. Перспективные направления генной инженерии и генетики роста с.31
1.4. Исследования изменчивости и наследования фенотипических признаков и роста рыб. Морфология и энергетика предличинок рыб с.41
1.5. Применение математических методов в морфогенетике и фенетике роста ранних предличинок рыб с.44
Глава 2. Материалы и методы исследований стр.48
Глава 3. Результаты исследований и их обсуждение стр.59
3.1. Фенотипические вариации стандартных фоновых значений норм реакции генотипа у ранней предличинки осетровых
3.2. Влияние повышенной мутагенной активности загрязнения водной среды на фенотипическую изменчивость признака продуктивности на ранних этапах онтогенеза белуги и бестера и скрытый генетический ущерб стр. 71
3.3. Фенотипические вариации норм реакции генотипа у гибрида бестера и родительских видов белуги и стерляди в раннем онтогенезе при нормальном уровне мутагенной активности загрязнения водной среды.
3.4. Фенотипическая изменчивость суперпризнака у гибрида Fi бестера и исходных родительских видов при нормальной мутагенности стр. 9'/
3.5. Динамика изменчивости субпризнаков предличинок чистых родительских и гибридных форм осетровых рыб при нормальной мутагенности стр. 101
3.6. Особенности фенотипического проявления механизма первичной адаптации осетровых в раннем онтогенезе (гетерозис у бестера Fi)
3.7. Предложения по внедрению в практику осетроводства индивидуального отбора по генотипам (оценки производителей по качеству их потомства) на ранних этапах развития для формирования маточных стад и выращивания товарной продукции стр. іЛС
Заключение
Выводы
Научно-практические рекомендации стр. ^ с'
Список использованных источников стр. М 9
Приложение стр. 1-і I
- Исследования генетической структуры популяций рыб. Селекционные и генетические исследования осетровых, как объектов аквакультуры
- Исследования изменчивости и наследования фенотипических признаков и роста рыб. Морфология и энергетика предличинок рыб
- Влияние повышенной мутагенной активности загрязнения водной среды на фенотипическую изменчивость признака продуктивности на ранних этапах онтогенеза белуги и бестера и скрытый генетический ущерб
- Особенности фенотипического проявления механизма первичной адаптации осетровых в раннем онтогенезе (гетерозис у бестера Fi)
Введение к работе
Актуальность исследований. Эффективное использование
биологических ресурсов рыбохозяйственных водоемов напрямую связано с уровнем загрязнения водной среды, особенно имеющим мутагенный эффект. Например, увеличение уровня мутагенной активности на каждые 0,1% выше фонового (0,37%) сопровождается падением рыбопродуктивности на 0,15 частей ее с каждого гектара акватории. Превышение уровня мутагенной активности загрязнения окружающей среды выше критического (1,00%) вызывает необратимые нарушения процессов жизнедеятельности живых форм (Якубов, 1993, 2001, 2002; Дубинин, 1996). В регионе Волго - Каспия повышение уровня мутагенной активности факторов природной среды связано с нефте- и газодобычей, общей неблагоприятной токсикологической обстановкой, угнетающими процессы жизнедеятельности гидробионтов (Иванов, 2001; Катунин и др., 2000; Сокольский и др., 2000).
К 2002 году общее количество видов загрязняющих веществ в рыбохозяйственных водоемах превысило 5 миллионов, при этом более 150 тысяч видов химических веществ - это поллютанты, т.е. ксенобиотики, вызывающие образование антител, которые резко угнетают иммунитет живых форм (Якубов, 1999, 2000, 2001, 2002). Согласно материалам межведомственной Ихтиологической Комиссии (1999, 2002) и Генеральной Прокуратуры Российской Федерации на 2002 год предельно допустимая концентрация (ПДК) установлена только для 1300 видов химических веществ. Если к тому же учесть эффект синергизма загрязняющих веществ (например, при совместном действии меди и цинка их токсичность возрастает в восемь раз), то становится понятным вывод о бесперспективности успешного решения проблем сохранения биологических ресурсов и здоровья людей только с помощью системы ПДК (Березовская, 2002). Т.о. необходимо внедрение системы биотестирования загрязняющих факторов окружающей природной среды как с помощью общепринятых классических генетических тест-объектов,
5 так и других живых форм. Таким образом, перспективным является
использование представителей живых форм - объектов биотестирования,
включая и ценные виды промысловых рыб и классические тест-объекты
генетических исследований. Особого внимания требует состояние здоровья
населения приграничных территорий - побережий Каспийского, Черного и
Балтийского морей, Белого, Баренцева и морей Дальнего востока (Материалы
межведомственной Ихтиологической Комиссии при ГосКомРыболовстве РФ и
Генеральной Прокуратуры Российской Федерации, 2000-2002 гг.).
Спад промышленного и сельскохозяйственного производства в Российской Федерации и в странах ближнего зарубежья за истекшие пять лет более чем на 50% не вызвал адекватного улучшения состояния гидробионтов. Наоборот, ситуация на рыбохозяйственных водоемах резко ухудшилась. На Волго-Каспии уровень мутагенной активности достоверно увеличился на 42% в 2000 году по сравнению с 1990 годом (Якубов, 2000, 2001, 2002).
Последствиями многофакторного антропогенного воздействия стали резкие негативные изменения в современных экосистемах большинства водоемов России и зарубежных стран. Ухудшилось качество природной воды из-за снижения активности процессов самоочищения, снизилось разнообразие биологических ресурсов (особенно ценных промысловых видов рыб), изменилась структура водных биоценозов, где ведущее место стали занимать сорные виды и формы живых организмов, снизились такие показатели, как количество и вес ценных видов промысловых организмов. Для оценки загрязнения водоемов токсическими веществами - мутагенами и поисков выхода из сложившейся ситуации необходима система постоянного мониторинга водоемов и их биоресурсов с использованием современных экологических, генетических и медицинских методов исследований качества воды, самих гидробионтов и других живых организмов, включая людей.
Основной целью наших исследований явилась разработка нормативной базы биотестирования загрязнения рыбохозяйственных водоемов на Волго-Каспийском бассейне с помощью классических генетических и
ихтиологических тест-объектов. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
- определить интервалы фенотипических вариаций стандартных фоновых
значений норм реакции генотипа для белуги, стерляди, осетра, бестера и
гибрида осетр х белуга на стадиях ранней предличинки при фоновом
(нормальном - 0,33±0,011%) уровне мутагенности;
- установить степень влияния повышенной мутагенной активности
загрязнения водной среды на фенотипическую изменчивость субпризнаков и
суперпризнаков продуктивности на ранних этапах онтогенеза белуги и бестера,
и предложить методику определения скрытого генетического ущерба от
загрязнения;
- проанализировать вариации норм реакции генотипа у гибрида Fi бестера
и исходных родительских видов на стадиях ранней предличинки при
нормальном уровне мутагенности по выведенным формулам и в рамках
аддитивно-доминантной модели изменчивости;
- изучить фенотипическую изменчивость суперпризнака у гибрида F]
бестера и исходных родительских видов при нормальном уровне мутагенности
по предложенным формулам;
- создать и проанализировать математические модели динамики вариаций
пяти субпризнаков предличинок чистых родительских и гибридных форм
осетровых рыб при фоновом уровне мутагенности водной среды;
изучить особенности фенотипического проявления механизма первичной адаптации осетровых рыб (гетерозиса) на стадиях ранней предличинки;
- разработать предложения по внедрению в практику осетроводства
индивидуального отбора по генотипам (оценки производителей по качеству их
потомства) на ранних стадиях развития для формирования маточных стад и
выращивания товарной продукции.
Биологические ресурсы рыбохозяйственных водоемов Волго-Каспия в количественном отношении определяют стратегию обеспечения населения
7 продуктами питания, при этом решение вопросов тактики во многом связано с
качеством данных продуктов. Гидробионты могут накапливать в своем теле до
7 тысяч ПДК по ртути и иногда характеризуются многократной концентрацией
радионуклеотидов и ядохимикатов, что таит в себе прямую угрозу здоровью
людей. Применение методов биотестирования в системе мониторинга
загрязнения факторов окружающей природной среды, основываясь на
сопоставлении классических общепринятых генетических тест-объектов и
ценных видов промысловых рыб (включая перспективные объекты
аквакультуры), призвано уменьшить последствия воздействия на людей
повышенной мутагенности воды и потребления обитающих в ней ценных видов
гидробионтов.
В регионе Волго-Каспия рыбная продукция, в том числе и продукция из
осетровых, всегда составляла значительную часть пищевого рациона населения.
Поэтому возможно, что наносимый повышенной мутагенной активностью воды
и развивающихся в ней осетровых рыб вред выражается не только в потерях
через снижение рыбопродуктивности, но и в ущербе здоровью людей. В 2000
году, по данным ГосКомСтата РФ в Астраханской области процент
заболеваний пищеварительной, дыхательной и кровеносной систем у людей, по
сравнению с 1996 годом, достоверно втрое выше в среднем на 20%. Поэтому
вызывает сомнение факт снижения онкозаболеваемости в среднем, на 5%, по
сравнению со средними показателями по РФ. Дальнейшее расширение и
углубление молекулярно-генетических исследований, основанных на
выявленных морфо-генетических нормативах изменчивости чистых и
гибридных форм осетровых рыб будет способствовать внедрению методов
биотестирования и в медицине - на основе применения современных
инструментальных, физико-химических и медико-генетических исследованиях.
Научная новизна. Впервые разработанное нами стандартное нормирование морфогенетической изменчивости чистых и гибридных форм осетровых рыб как при фоновом уровне мутагенной активности загрязнения
8 водной среды (0,33+0,011%), так и при повышенном (0,55±0,016%) могут
служить существенным вкладом в нормативную базу биотестирования
загрязнения рыбохозяйственных водоемов Волго-Каспия. Впервые предложено
использование изучения морфогенетическими методами статических и
динамических вариаций норм реакции генотипа осетровых рыб чистых и
гибридных форм на ранних этапах онтогенеза в качестве биотестов
рыбохозяйственных водоемов Волго-Каспия при фоновом и опытном уровнях
мутагенности загрязнения водной среды.
Впервые рассмотрено влияние шкалы фенотипической вариации
признака продуктивности на стадиях ранней предличинки в абсолютных
числах, натуральных и десятичных логарифмах на фенотипическое проявление
действия генов роста. Автором выведены формулы частного и общего
коэффициентов фенотипической вариации и относительный показатель
гетерозиса в раннем онтогенезе осетровых и определены их значения для
белуги, бестера и стерляди. На основании линейных, логарифмических и
степенных уравнений впервые составлена и проанализирована математическая
модель изменений пяти норм реакции фенотипа на 36, 38, 40 стадиях развития.
Основные положения, выносимые на защиту:
изменение фенотипических норм реакции генотипа на ранних этапах развития осетровых при влиянии повышенной мутагенной активности загрязнения водной среды и оценка скрытого генетического ущерба осетроводству по признаку продуктивности;
двойственная сущность гетерозиса на ранних этапах онтогенеза у осетровых рыб;
целесообразность использования суперпризнака - коэффициента упитанности по Фультону для изучения признака продуктивности на ранних этапах онтогенеза осетровых рыб;
выбор шкалы для морфогенетического анализа суб- и суперпризнаков продуктивности.
9 Теоретическая и практическая значимость работы. Впервые
полученные данные по разработке нормативной базы биотестирования, и
формулы, коэффициенты и уравнения изменчивости норм реакции фенотипа и
признака продуктивности на стадиях ранней предличинки осетровых рыб могут
использоваться в генетических, экологических, токсикологических
исследованиях, как морфогенетическая основа для работ по молекулярной
генетике, как контрольные данные для токсикогенного анализа экологической
обстановки в регионе и ориентирные данные для ведения селекционных работ
на ранних этапах развития в товарном осетроводстве. Для практикующих
рыбоводов разработаны предложения по селекционному отбору особей по
качеству их потомства на ранних стадиях его развития для формирования
маточных стад и выращивания товарной продукции.
Апробация результатов исследований. Основные результаты диссертационного исследования доложены на конференциях студентов и аспирантов АГТУ (1994 - 1997, 2000 гг.), на Ученых Советах Рыбохозяйственного Факультета и заседаниях кафедры «Аквакультура и водные биоресурсы», научно-технических конференциях профессорско -преподавательского состава АГТУ (1995 - 1997 гг.), на съезде ПО РАН (Казань, 1996), на Международной конференции «Проблемы экологии в медицине» (Астрахань, 1996), на конференции молодых ученых КаспНИИРХа (1999), на конференции «Состояние и перспективы научно-исследовательских разработок в области марикультуры России (Ростов - на - Дону, 1996), на первой научно-практической конференции «Проблемы товарного осетроводства» (Астрахань, 1999), на конференции АГМИ «Актуальные вопросы социальной медицины и организации здравоохранения» (Астрахань, 1997.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 18 печатных работ и разработано методическое пособие, которые представлены в реферате.
Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследований из 7 глав, результатов и обсуждения собственных исследований, выводов, рекомендаций, списка использованной литературы. Общий объем диссертации - 171 страница. Текст иллюстрирован 9 рисунками и 26 таблицами. Список литературы включает 447 источников, из них 167 - иностранные.
Исследования генетической структуры популяций рыб. Селекционные и генетические исследования осетровых, как объектов аквакультуры
Генетическая структура популяций рыб в значительно большей степени, чем других позвоночных, подверглась антропогенному воздействию. Например, среди других позвоночных трудно найти аналогию тому обширному, продолжительному, часто неконтролируемому распространению генетического материала по большим территориям, которое стало возможным благодаря развитию методов искусственного выращивания рыб, практиковавшихся уже в прошлом веке [297, 354, 398, 406]. Рыбы, по-видимому, фенотипически более разнообразны, чем другие виды позвоночных. В частности, у многих рыб нередко наблюдаются отчетливо заметные и экономически важные различия по скорости роста и размерам тела как внутрипопуляционном [276-278, 356, 370], так и на межпопуляционном уровне [422], часто в пределах одной популяции [280, 281, 282].
Для рыб характерна большая изменчивость внутри популяций. Коэффициенты вариации различаются между особями в пределах одной популяции значительно выше, чем у других позвоночных. Так, у большинства позвоночных коэффициенты вариации длины тела обычно не превышают 10 %, в то время как у рыб эти величины значительно выше, вплоть до 20-60 % у лососей [328]. Аналогичная картина наблюдается в отношении коэффициентов вариации массы тела: у большинства позвоночных эти величины не достигают 15 %, тогда как у рыб, как правило, превышают это значение (вплоть до 75-100% у лососей). По данным вышеупомянутого автора, диапазон внутривидовых колебания массы тела у рыб достигает величины, в 15 раз большей, чем у позвоночных. То же самое автор относит и к линейным размерам: диапазон изменчивости, наблюдаемой в пределах одного вида рыб, в 2 раза и более превышает диапазон различий, характерных для других позвоночных на внутрипопуляционном уровне.
Значительные фенотипические различия, наблюдаемые в популяциях рыб, совсем не обязательно связаны с высоким уровнем генетической изменчивости. Есть данные, что связь между генотипом и фенотипом у рыб, возможно, несколько отличается от этой связи у других позвоночных [114 -118]. Наследуемость, как доля общей фенотипической изменчивости в популяции, обусловленная генетическими различиями между особями, варьирует от 0 (когда вся изменчивость обусловлена действием внешней среды) до 1 (когда вся изменчивость имеет генотипическую основу). Наследуемость таких признаков, как длина и масса тела у рыб, обычно гораздо ниже, чем в популяциях других позвоночных [399]. Этот автор считает, что высокий уровень изменчивости в сочетании с низкой наследуемостью свидетельствует о высокой подверженности действию внешней среды. Хочется обратить внимание на некоторые уникальные физиологические характеристики рыб. Наличие полигенно детерминированной способности к росту создает большую, чем у других позвоночных, возможность адаптации к таким факторам внешней среды, как количество доступной пищи и плотность популяции [399]. Во-вторых, рыбы в большей степени, чем гомойотермные птицы и млекопитающие, чувствительны к изменениям температуры, непосредственно влияющим на процессы метаболизма. В-третьих, возраст и размеры рыб в момент достижения половозрелости связаны таким образом, что обеспечивают значительную пластичность без снижения показателей репродуктивности [282, 328, 357]. Следует, однако, отметить, что наследуемость меристических признаков у рыб обычно весьма высока [365]. Это не противоречит всему изложенному выше, поскольку меристические признаки обычно формируются в раннем онтогенезе, и, следовательно, не испытывают воздействия факторов внешней среды [3].
Изучение коэффициентов наследуемости признаков продуктивности, проводившееся у потомства волжских осетровых рыб, представленного личинками, перешедшими на активное питание, показало, что эти коэффициенты составляли до 0,6. Повторяемость данных признаков составляла значения до 0,9 [265]. Для исследований в области селекционно-генетических аспектов авторы предлагали выбирать наиболее показательные фены на определенных стадиях развития, когда коэффициенты наследуемости признаков продуктивности имеют наибольшие значения, которые должны были облегчить и ускорить процесс формирования маточных стад и подбор производителей при искусственном воспроизводстве у широкого числа видов осетровых рыб. Однако в то время эксперименты в области генетики и селекции осетровых проводились в основном на молоди осетровых [178] и на личинках, перешедших на активное питание, когда доля наследуемости признаков продуктивности невелика [124]. По многим данным в дальнейшем оптимальный период для таких исследований (морфогенетических) - период постэмбриона, так как меристические признаки формируются в раннем онтогенезе, и, следовательно, в наименьшей степени испытывают воздействие факторов внешней среды [3]. На ранних этапах онтогенетического развития, когда доля генетической изменчивости в фенотипической особенно велика, детермирована максимальным аддитивным действием генов продуктивности, проявление которых в фенотипе характеризуется низкими коэффициентами вариации [108]. Установлено, что на ранних стадиях развития организма по активности синтеза и-РНК можно судить о будущем росте и характере развития животного [183, 184]. Степень синтеза того или иного белка пропорциональна количеству его РНК, что имеет значение для прогноза продуктивности животного.
Особенности рыб, отличающие их от других позвоночных, в сочетании с четкой внутривидовой структурой, которой обладают многие виды рыб, иногда создают неверную картину связей между генотипом и фенотипом у используемых человеком видов рыб. Задачей исследователей является нахождение и использование адекватных морфогенетических (фенетических) методов для решения возникающих современных проблем управления рыбным хозяйством, и осетроводством, в частности.
Одним из имеющихся в распоряжении ученых методов исследования является электрофоретический метод получения генетической информации. Однако даже при полном использовании генетической информации, получаемой электрофоретическими методами, было изучено менее 1% всего генетического материала организма [15]. Прямое секвенирование ДНК для непосредственного анализа материала по-прежнему остается трудоемкой процедурой [3]. Новую область в изучении связи между морфологической изменчивостью и приспособленностью открывает обнаружение корреляций между билатеральной симметрией и гетерозиготностью [364, 365]. Морфогенетические методы [164] дают возможность найти новые подходы к исследованиям признака продуктивности и на их основе, учитывая имеющиеся объективные данные по другим методам, проводить селекционно-генетические мероприятия в осетроводстве.
Исследования изменчивости и наследования фенотипических признаков и роста рыб. Морфология и энергетика предличинок рыб
Для характеристики производителей по продуктивным признакам потомства важно изучение генетической и фенетической детерминант этих признаков. Анализ факторов, детерминирующих изменчивость продуктивного признака длины тела, прогноз признаков, основанный на начальных параметрах тест-признаков, прогноз условий, оптимальных для раскрытия потенциала роста рыб дается в работе De March [309]. Передача по наследству количественных характеристик ядрышеку карповых рыб изучалась В.В.Архипчук [14]. Проанализировав уроки фенетической и генетической изменчивости популяций горбуши, Агапов Г. А. и Пустовойт С. П. [1] указывают на независимый друг от друга характер варьирования уровней генетической и фенетической изменчивости популяций. Стабильность развития морфологических признаков у микижи оценивалась с помощью показателя флуктуирующей асимметрии [366]. Авторы считают, что стабильность развития связана с увеличением приспособленности. В работе Y. P. Grobler, F. Н. Van der Bank [327] обсуждается взаимосвязь между фенотипической изменчивостью рыб и степенью гетерозиготности по локусам, контролирующим аллоферменты. Исследования по количественной генетике ряда рыбоводных признаков у гольцов [315] показали, что уровни наследуемости длины тела, массы внутренних органов и некоторых других находятся в пределах h =0,0-0,28. Содержание астаксантина (пигмента) коррелировало с рядом параметров тела, масса тела - с содержанием сухого вещества и жира.
Возможность прогноза изменения размеров тела лососевых рыб в результате расширения работ по искусственному воспроизводству и выращиванию подтверждается тем, что морфологические различия у них могут накапливаться от поколения к поколению [319]. При попадании заводской молоди в природную среду (при пастбищном выращивании), как констатируют авторы, происходит «растворение» многих фенотипических признаков, однако при выращивании на разных хозяйствах различия по большинству признаков сохраняются. Самцы горбуш [74] оказались более вариабельными по фенотипическим признакам, чем самки, и неотличимы от них по числу аллелей и числу ферментных гетерозиготных локусов на особь. У самцов обнаружена связь между числом гетерозиготных локусов и коэффициентом вариации логарифма массы и длины тела.
Изучение наследования признака длины хвоста у аквариумной рыбки Brachydanio rerio [423] показало, что признак длинохвостости является доминантным по отношению к признаку дикого типа. Исследованиями дивергенции признаков в ходе раннего онтогенеза у личинок близких видов осетровых занималась Сытина Л. А. [235].
Изучение количественных характеристик роста, его закономерности на различных этапах онтогенеза рыб, потенциал роста, влияние различных факторов на рост, видовые особенности роста осетровых рыб составляют отдельное направление в физиологии рыб [7] (Аминева, Яржомбек, 1984). Математические модели, эмпирические шкалы для описания роста рыб применялись отечественными учеными в общетеоретическом плане, начиная с конца 30-х годов XX века [58, 38, 30, 21, 31, 27]. О свойствах и потенциях роста рыб, в том числе и осетровых исследователи начинали писать с начала прошлого века [187, 198, 69]. Исследования продолжаются до сих пор [145, 274]. Влияние абиотических и биотических факторов на рост рыб, связь его с интенсивностью обмена веществ описывается в работах таких известных ученых, как Винберг Г. Г. [42, 43], Мильштейн В. В. и другие [174], Гершанович А. Д. [52]. Росту рыб в раннем онтогенезе и влияние этого периода на последующий рост, посвящены работы Остроумова А. А. [197], Олифан В. И. [196], Матвеева Б. С. [168, 169], Замахаева Ц. X. [78], Кауфман 3. С. [111], Купинского С. Б. [141,142]. Делались попытки найти фены, связанные с ростовыми потенциями молоди осетровых рыб, для селекционной работы [194]. Однако они не получили дальнейшего развития из-за того, что связь оказалась малозначимой, и условия, при которых проводились эксперименты, сильно влияли на результаты исследований. Дальнейшие исследования подтвердили, что наиболее показательным для таких исследований является период ранней предличинки [320, 429, 129, 231 ]. Исследования региональных и видовых особенностей роста молоди осетровых проводились в КаспНИРХе [4, 214] и на Азове. Вопросы морфологии на ранних стадиях онтогенеза затрагиваются в работах Веригина Б.В. [39], Матвеева Б.С. [168-170], Кауфман З.С. [ПО, 11 .Характеристики эмбриогенеза шипа и осетра с точки зрения динамики содержания аминокислот содержится в работе Джабарова М.И. и Бабаевой Р.Ф. [66], Шевченко В.Н. [252].Скорость белкового роста в теле зародышей лосося исследуется и работе Новикова Г.Г., Куфтиной Н.Д., Зайцевой Н.Д. [195]. Исследователи считают, что особенности роста зародышей и резорбции запасных белковых веществ желтка в период эндогенного питания свидетельствуют об относительной независимости этих процессов. Работы по энергетике в ранний период онтогенеза белуги проводила Шевченко В.Н. [253]. Она обнаружила, что гибель приблизительно пятой части общего числа предличинок на переходе их на смешанное питание биологически закономерна, т.к. обусловлена энергетической обеспеченностью предличинок. Причины гибели аномальных предличинок на ранних стадиях онтогенеза волновали ученных в связи с вопросами разработки биотехнологии разведения осетровых рыб [29, 60, 234]. Ухудшение токсикологической обстановки, несомненно, сказалось на увеличении количества и видов аномалии в наиболее уязвимый период постэмбрионального развития осетровых [251, 130, 57, 151-155], и заставило исследователей в лабораторных условиях искать вещества и их безопасные для предличинок дозы, которые могли бы вызывать морфофункциональные нарушения [124, 113].
Вопросами морфологических исследований на ранних этапах онтогенеза осетровых рыб занимались многие исследователи. В их числе Т.А.Детлаф, А.С.Гинзбург, О.И.Шмальгаузен [64, 65], Н.И.Драгомиров [68], А.Ф.Коблицкая [120], В.Д.Крылова [137, 133, 134], И.В.Яковлева [265], В.В.Милыптейн [173], Н.В.Жукинский [77], А.А.Попова и В.В.Милыптейн [175, 176, 178], В.Н.Беляева [24], В.Н.Шевченко [252, 253], и другие. Однако работ, которые бы определяли фенотипические значения норм реакции генотипа по признаку продуктивности на ранних стадиях онтогенеза осетровых рыб осетровых рыб при нормальной мутагенности, практически нет. Такие исследования были начаты нами в 1994 году [266-272, 79-84].
Влияние повышенной мутагенной активности загрязнения водной среды на фенотипическую изменчивость признака продуктивности на ранних этапах онтогенеза белуги и бестера и скрытый генетический ущерб
Интерес представляет не только разложение признака на многие субпризнаки, но и совместное рассмотрение комплекса из нескольких признаков, т.е. суперпризнаков, которые характеризуют рыбопродуктивность, осетровых рыб и степень влияния на него повышения мутагенной активности загрязнения факторами природной среды, например - водной (см. табл. 2.1-2.8 и таблицы в Приложении).
В таблицах (см. Приложение 3-8) приведены результаты сравнения фено-типической изменчивости пяти субпризнаков (средне - арифметические значения с ошибкой средней при N 30) у белуги и гибрида бестера на ранних стадиях онтогенеза при разных уровнях мутагенности (контроль - уровень мутагенной активности загрязнения природной волжской воды в инкубационных цехах осетровых рыбоводных заводов Астраханской области, равной 0,33 + 0,011%; и опыт - мутагенная активность загрязнения водной среды - 0,55 + 0,016): 36 стадия - массовый выклев после 100-часового эмбриогенеза; 38 стадия - начало перехода на жаберное дыхание; 40 стадия - начало формирования челюстей ротового аппарата.
На основании данных этих таблиц проведен анализ влияния повышенной мутагенной активности загрязнения на суперпризнаки белуги (см. таблицу 2.1) и бестера (см. таблицу 2.5). Анализ результатов, приведенных в таблице 2.1, свидетельствует о наличии 40-процентной достоверной разницы (критерий Стьюдента фактический, равный 22,11, значительно превышает табличное значение 2,04). Данное утверждение справедливо как при уровне значимости 0,05 (в 95 случаях из 100), так и при уровне значимости 0,001 (в 999 случаях из 1000). В то же время во всех 5 рассмотренных суперпризнаках белуги (см. признаки 1-5 в таблице 2.1) выявленные разницы 5-7-10-4-6% имеют достоверный, т.е. закономерный характер, так как критерий Стьюдента фактически равный 11,00-4,75-3,00-9,10, соответственно, больше табличного (2,04), при уровне значимости 0,05.
Подход к изучению влияния различных уровней мутагенной активности загрязнения природной волжской воды в инкубационных цехах осетровых рыбоводных заводов Астраханской области на проявление фенотипической изменчивости признаков (см. табл. 2.1) белуги на ранних стадиях онтогенетического развития (стадии 36-40) с использованием интегрированного способа изучения на основе суб- и суперпризнаков продуктивности, является наиболее приемлемым и показательным для биотестирования рыбохозяйственных водоемов Волго-Каспия. Биотестирование показало, что генетический гомеостаз у предличинок белуги на индивидуально—организменном уровне обладает пока должным и значимым механизмом репарации ДІЖ, который нейтрализует действие мутагенов из внешней среды, вызывающих нарушения процессов жизнедеятельности у белуги за счет непосредственных изменений в экспрессии генов, детерминирующих продуктивность белуги на Волго-Каспии.
Наиболее показательным субпризнаком продуктивности является средняя масса тела предличинки белуги, так как она непосредственно связана с продуктивностью. Колебания данных сравнительного анализа фенотипической изменчивости в виде пяти субпризнаков, в зависимости от варианта опыта, служат одним из доказательств нарушения генетического гомеостаза белуги на инди-видуально-организменном уровне жизни (ранние этапы онтогенеза) в условиях Волго-Каспия. В этой связи возникает вопрос, как поведут себя в зависимости от уровня мутагенной активности загрязнения водной среды суперпризнаки белуги на 36-40 стадиях онтогенетического развития.
В таблице 2.2 отражены исходные расчеты моделирования линейной зависимости между стадиями онтогенетического развития белуги и изменениями средней массы тела при фоновом уровне (контрольный вариант) мутагенной активности загрязнения природной волжской воды в инкубационном и личиночном цехах Икрянинского осетрового рыбоводного завода ОНПЦ «Биос», равном в среднем 0,33+0,011%. Это контрольный вариант. Вычисление коэффициента регрессии, или Ь, в линейном уравнении у=а+Ьх осуществлялось с применением метода наименьших квадратов (Якубов и др., 1999, 2000, 2001). В результате было установлено теоретическое распределение значений фенотипической изменчивости субпризнака (средняя масса тела), в зависимости от стадии онтогенетического развития белуги: 36-38-40 стадии, которое определяется с помощью математической модели в виде линейного уравнения: Y = 18,7+4,515х.
Разница между теоретическими и практическими значениями субпризнака была недостоверна, так как фактическое значение критерия % Фишера, равное 0,026 меньше табличного - 3,18, при уровне значимости 0,05. Таким образом, нулевая гипотеза, которая гласит, что между практическим и теоретическим значениями нет достоверной разницы, приемлема в 95 случаях из 100. Следовательно, выявленная линейная зависимость может служить основанием для утверждения о том, что увеличение длины тела белуги на ранних этапах онтогенеза обусловлено наличием биологической закономерности, детерминированной последовательной экспрессией генов, отвечающих за рост белуги. Это свидетельствует об отсутствии негативного воздействия загрязнения данного уровня мутагенной активности водной среды на процессы жизнедеятельности белуги.
Особенности фенотипического проявления механизма первичной адаптации осетровых в раннем онтогенезе (гетерозис у бестера Fi)
Оценка степени гетерозисного эффекта при скрещивании производителей разных внутривидовых линий и производителей разных видов дает возможность повышать «племенную ценность» внутривидовых линий, увеличивать выживаемость разводимых видов рыб, общую жизнеспособность и устойчивость к неблагоприятным факторам среды. Вопрос о практическом использовании в рыбоводстве гибридов первого поколения подробно обсужден в работах М.А.Андрияшевой (1966, 1971). Выращивать гибридов первого поколения выгодно в том случае, если по определенным признакам они превосходят обоих своих родителей, т.е. у них наблюдается эффект гетерозиса.
Под гетерозисом понимают преимущество гибридов (помесей) первого поколения F) по сравнению с родительскими формами. В природных условиях гетерозис выражается обычно в увеличении выживаемости гибридов. Такой гетерозис характерен для многих внутривидовых скрещиваний и носит название эугетерозиса. Из-за недочетов в селекционной работе или неудачно подобранных пар производителей иногда наблюдается избыточный гетерозис (или гигантизм), дающий особей с ускорением роста и увеличением размеров тела или его отдельных частей (Dobzhansky, 1952), что может сопровождаться нарушениями в развитии воспроизводительной системы. При оценке гетерозиса проводят сравнение гибридов с лучшей родительской формой (конкурсный, или истинный гетерозис), либо со средним родительским значением (гипотетический гетерозис). У межвидовых гибридов обычно определяют гипотетический гетерозис, а у внутривидовых - конкурсный.
Первые попытки скрещиваний были предприняты академиком Ф.В.Овсянниковым в 1870 году, который оплодотворял икру стерляди спермой севрюги. Затем работы по гибридизации были продолжены профессором Н.И.Николюкиным в 1949 году. Н.И.Николюкин и И.А.Тимофеева сосредоточили внимание на разведении гибридов, исходя из того, что осетровые в своем большинстве не приспособлены к жизни в прудах и бассейнах, в озерах и водохранилищах, а создание гибридов - наиболее короткий и быстрый путь к приспособлению гибридных форм осетровых к измененной среде обитания через лучшую жизнестойкость. В 1952 году профессором Николюкиным был получен гибрид белуги со стерлядью, получивший название «бестер». В 1966 году Минрыбхоз СССР утвердил инструкцию по товарному выращиванию бестера (Николюкин, Бурцев, 1969). Исследователи, наряду с товарным выращиванием ставили задачу выведения методом гибридизации и селекции новых наследственно устойчивых форм осетровых, причем они считали, что гибридным формам должно отдаваться предпочтение перед чистыми видами при разведении. Исследованиями гетерозисного эффекта у осетровых занимался Н.Л .Гербильский (1967), предполагая раннее проявление его в потомстве на стадиях сеголетка, что нашло подтверждение в соответствующих экспериментах (Мильштейн, Попова, 1969). В.Д. Крылова (1985) рекомендует промышленности формировать маточные стада ОРЗ из гибридных производителей.
B.C. Кирпичников (1979) предупреждал, что выпуск гибридов в озера, лиманы, и водохранилища неизбежно приведет к загрязнению стад осетровых рыб и использование икры белуги для скрещивания со стерлядью наносит ущерб воспроизводству белуги. В качестве еще одного печального примера он приводит гибридизацию карпа с его диким предком - сазаном. Как правило, гибридов сохраняли и следствием этого было засорение стад сазана и карпа и снижение их продуктивных качеств. Также В.С.Кирпичников утверждал, что при оставлении гибридов первого поколения на племя (запланированное или случайное) приводит к засорению маточных стад исходных форм.
При сравнительном анализе морфологических признаков гибридов и исходных форм (Хаббс, Куронума, 1942) использовался «гибридный индекс», показывающий степень «промежуточности» гибрида по отдельным признакам (в числовых выражениях). Однако гибридный индекс имеет существенные недостатки - требуется идентификация априори особей от двух родительских видов и нельзя рассчитать дисперсию и ковариацию отличительных признаков. Он учитывает все признаки, как равноценные, независимо от их детерминирующей силы. Поэтому в последнее время разрабатываются новые методики исследований признаков, используются многомерные статистические методы, так как они включают процедуру взвешивания каждого признака по вкладу факторов на основе дисперсионно - ковариационной структуры данных.
Ценность фенетического анализа состоит в том, что его посредством возможна идентификация генотипа (через фенотипическиенормы реакции фенотипа). При этом важен выбор маркерных генов, эффекты которых явно проявляются, вследствии чего генотипическая классификация оказывается четкой. Методами фенетического анализа является разложение исследуемого признака на субпризнаки и объединение их в суперпризнаки.
Мы предлагаем рассмотреть фенотипическую вариацию пяти субпризнаков, входящих в признак продуктивности, как проявление механизма первичной адаптации при межвидовом скрещивании осетровых рыб: общей длины тела, массы тела, высоты тела, высоты головы, длины туловища ранних предличинок осетровых. Они наглядно показывают (с помощью разработанных нами шкал фенотипической вариации субпризнаков) присутствие эффекта гетерозиса на ранних стадиях онтогенеза чистых и гибридных форм осетровых рыб и особенности его проявления. Для измерения эффекта гетерозиса посредством шкал мы использовали такие показатели, как частота встречаемости вариант (субпризнака), величины классового интервала, границы модального класса. Разбив весь интервал значений субпризнака на трех последовательных стадиях (36, 38, 40) развития на классовые интервалы, мы подсчитали количество вариант, выпадающих на конкретных интервал.
Похожие диссертации на Биотестирование рыбохозяйственных водоемов Волго-Каспийского бассейна с применением генетических и ихтиологических тест-объектов
