Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 6
1.1. Строение первичной клеточной стенки 6
1.2. Целлюлоза 8
1.3. Гемицеллюлозы 9
1.4. Камеди и слизи 12
1.5. Пектиновые полисахариды 16
1.5.1. Выделение пектинов из растительных клеток 16
1.5.2. Фракционирование смесей пектиновых веществ 23
1.5.3. Структура пектиновых полисахаридов 26
1.5.4. Линейная область пектиновых веществ 27
1.5.5. Разветвленные области пектиновых полисахаридов 28
1.5.6. Нейтральные компоненты пектиновых веществ 32
1.5.7. Ксилогалактуронаны и апиогалактуронаны 34
1.6. Заключение 35
2. Обсуждение результатов 39
2.1. Введение 39
2.2. Общие принципы изучения строения лемнана 40
2.3. Выделение и общая характеристика полисахарида ряски малой Lemna minor L... 41
2.3.1. Методы выделения лемнана 41
2.3.2. Определение моносахаридного состава лемнана 50
2.3.3. Определение конфигурации моносахаридов лемнана 54
2.3.4. Выделение апиозы из лемнана 56
2.3.5. Спектроскопия ЯМР апиозы 59
2.4. Галактуронан - главная углеводная цепь лемнана 63
2.5. Апиогалактуронан - основной фрагмент разветвленной области лемнана 65
2.6. Гетерогликаногалактуронаны - минорные участки разветвленной области лемнана 68
2.6.1. Фрагментация лемнана с помощью частичного кислотного гидролиза 68
2.6.2. Фрагментация лемнана с помощью распада по Смиту 77
2.7. О строении лемнана 82
2.8. Заключение 84
3. Экспериментальная часть 86
3.1. Реактивы и материалы 86
3.2. Экспериментальные условия 86
3.2.1. Общие экспериментальные условия 86
3.2.2. Аналитические методы 91
3.2.3. Выделение лемнана 93
3.2.4. Ионообменная хроматография 94
3.2.5. Частичный кислотный гидролиз 95
3.2.6. Препаративное выделение моносахаридов методом ВЭЖХ 97
3.2.7. Ферментативный гидролиз лемнана пектиназой
3.2.8. Распад по Смиту 99
Выводы 101
Список литературы 102
- Выделение пектинов из растительных клеток
- Разветвленные области пектиновых полисахаридов
- Апиогалактуронан - основной фрагмент разветвленной области лемнана
- Препаративное выделение моносахаридов методом ВЭЖХ
Выделение пектинов из растительных клеток
Гемицеллюлозы голосеменных растений представлены глюкоманна- нами и галактоглюкоманнанами. Их главная углеводная цепь образована (3-1,4-)-маннаном. Основная масса глюкоманнанов содержится в голосеменных растениях, но в небольших количествах они встречаются и в покрытосеменных. В глюкоманнанах часть остатков маннозы главной углеводной цепи замещена Б-глюкозой. Отношение количества замещенных остатков маннозы к количеству остатков глюкозы различается для представителей разных семейств и родов растений. Гемицеллюлозы древесины большей части голосеменных и покрытосеменных содержат главную линейную углеводную цепь, в состав которой входят остатки )-маннозы и Л-глюкозы в соотношении примерно 1-2:1 [60]. Исключение составляют глюкоманнаны некоторых видов ели, которые обладают разветвленной структурой [5].
Гемицеллюлозы покрытосеменных представлены ксиланами, 4-О-ме- шп-ТУ-глюкуроноксиланами и арабиноксиланами. Главная углеводная цепь ксиланов высших растений образована Р-1,4-связанными остатками D-ксило- зы [61, 62]. Ксилан древесины лиственных пород представляет собой линейные (3-1,4-связанные цепи ксилозы, в которых, в среднем, каждый десятый остаток замещен по второму положению 4-0-метил-/)-глюкуро- новой кислотой [22, 63]. В злаковых наиболее распространенными являются арабиноксиланы, в которых остатки ксилозы главной углеводной цепи замещены по третьему положению остатками L-арабинозы. Часто этот полисахарид содержит еще и остатки 4-0-метил-)-глюкуроновой кислоты, замещающей остатки ксилозы основной углеводной цепи по 2-положению [22, 63].
В настоящее время накоплены обширные сведения о строении, физических и химических свойствах гемицеллюлоз. Однако подробно изучены лишь те полисахариды, которые содержатся в значительном количестве [5].
Камеди и слизи экстрагируются из растительного сырья водой и водно- солевыми растворами в виде вязких растворов [19].
Камеди образуются в виде стекловидной массы в местах повреждения коры многих растений. Способность образовывать камеди широко распространена в природе и связана с патологическим состоянием растения - механическими или инфекционными повреждениями, неблагоприятными условиями существования [5]. Например, камедь «brea» бобового дерева Cerciclum australe Jonhst, произрастающего в сухих областях центральных, западных и северо-западных регионов Аргентины, образуется наиболее интенсивно в сухую и жаркую погоду в местах порезов коры ствола или основных ветвей дерева. А при достаточной влажности образование камеди значительно сокращается [64].
Слизи, в отличие от камедей, присутствуют в неповрежденных растениях [65]. Главным источником их получения служат семена, в значительно меньших количествах они присутствуют в коре, корнях и листьях растений. В семенах слизи представлены галактоманнанами, их главная угледевод- ная цепь состоит из Р-1,4-связанных остатков маннозы, часть из которых замещена единичными или а-1,4-связанными остатками D-галактозы [5,22, 66]. Главным источником галактоманнанов являются семена. Соотношение D-маннозы и D-галактозы в галактоманнанах из различных растительных источников варьирует в широких пределах [66-68]. Нельзя, руководствуясь химическим строением, провести четкую границу между камедями и слизя- ми. Но многочисленные исследования позволяют сказать, что камеди отличаются более сложным строением углеводной цепи. Они всегда представлены разветвленными гетерополисахаридами, в состав которых входят несколько кислых и нейтральных моносахаридных остатков. В состав слизей, наряду с гетерополисахаридами, входят гомополисахариды.
Сложность структуры камедей и слизей является причиной того, что известно немного представителей этой группы растительных полисахаридов с полностью установленным строением, несмотря на простоту их выделения, высокие выходы и практическую ценность [2, 9, 19, 22].
По строению главной углеводной цепи камеди можно разделить на четыре класса\ галактаны, глюкурономаннаны, галактуронаны и ксиланы [22].
Большая часть известных ныне камедей относится к галактановому типу. Так, например, к этому типу камедей принадлежит хорошо известный гумиарабик (gum arabic), представляющий камедь аравийского дерева Acacia Senegal, которая производится в промышленном масштабе и находит широкое применение [69]. Продуцентами камедей являются и другие виды растений рода Acacia, число которых доходит до 1000 [70].
Макромолекулы полисахаридов данной группы камедей, равно как и всех остальных групп, сильно разветвлены и очень сложны по структуре. Несмотря на то, что исследованиям гуммиарабика посвящено множество работ, строение полисахаридов, входящих в его состав, полностью к настоящему времени не установлено, а лишь подробно исследованы физико- химические свойства основного галактана и сделаны предположения о его возможной структуре [69-73]. Главная углеводная цепь камедей галактановой группы состоит из остатков D-галактопиранозы, связанных между собой 1.3- и р-1,6-связями. На терминальных, невосстанавливающих концах или по соседству с ними находятся остатки D-галактуроновой кислоты или ее метилового эфира [74]. В состав боковых цепей чаще всего входят остатки L- арабинофуранозы, связанные а-1,3-связью, a в ряде случаев содержатся а 1.4- связанные остатки L-рамнопиранозы [75]. По своей структуре камеди галактановой группы часто напоминают арабиногалактаны хвойных [5].
Камеди рода Prunus, к которому принадлежат персик и вишня, относятся к группе глюкурономаннанов [22]. Установлено [22, 68], что полисахариды этой группы содержат в составе главной углеводной цепи остатки глюкуроновой кислоты и маннопиранозы: Man Боковые цепи присоединены к остаткам маннозы и состоят из остатков L-арабинофуранозы, D-галактопиранозы, а в ряде случаев и D-ксилопиранозы [22, 68].
Сравнительно небольшое число камедей и слизей относится к ксиланоеой группе: основу их главной углеводной цепи составляют остатки D-ксилопиранозы [22]. К этой группе принадлежат полисахариды семенных коробочек Watsonia sp. и дерева сапота Calocarpum sapote сем. Sapotaceae. И хотя по свойствам эти полисахариды близки камедям, однако по своей структуре они значительно ближе к гемицеллюлозам [22].
Близким по строению углеводной цепи к нейтральным гемицеллюлозам является арабиногалактан, содержащий, кроме L-арабинозы и D-галактозы, небольшие количества L-рамнозы и D-галактуроновой кислоты. Сюда же принадлежит и один из двух полисахаридов трагакантовой камеди, выделенной из астрагала Astragalus gummifer и других представителей этого рода.
Второй полисахарид трагакантовой камеди имеет кислую природу, относится к широко распространенной группе рамногалактуронана и представляет собой трагакантовую кислоту [22]. В состав ее боковых цепей, наряду с D-ксилозой, входят остатки D-галактозы и L-фукозы. Совокупность всех накопленных сведений позволила предположить для трагакантовой кислоты следующую структуру [76]:
Разветвленные области пектиновых полисахаридов
Иногда для экстракции пектиновых полисахаридов используют ферменты. Этот способ не требует применения высоких температур [79, 113, 114]. Однако пектины, полученные с помощью ферментативной экстракции, отличаются низкой молекулярной массой, что связано с существенным разрушением гликозидных связей. Этот метод непригоден, если необходимо выделить пектины для структурных исследований. В то же время использование специфических ферментов при экстракции позволяет получить определенные участки макромолекулы пектина, что имеет существенное значение именно для структурных исследований. Например, RG-II, высокоразветвленный участок макромолекул пектиновых полисахаридов первичной клеточной стенки, выделяют обработкой растительного сырья а-1,4-эндо-полигалактуроназой [115,79]. Использование рамногалактуроназы позволяет выделить фрагмент макромолекулы пектина с высоким содержанием нейтральных моносахаридов и с низким молекулярным весом, а другие пектинолитические ферменты дают возможность получать участки галактуронана с высокой молекулярной массой [116]. Часто ферменты используют совместно с раствором EDTA, связывающим катионы двухвалентных металлов [117].
Для предварительного фракционирования полисахаридов растений применяют последовательную экстракцию холодной, затем горячей водой, раствором кислоты и хелатирующими агентами [82, 83]. Этот подход не отличается достаточной эффективностью и приводит к получению полисахаридных смесей, требующих дальнейшего фракционирования.
Для нас представляет значительный интерес рассмотреть разделение выделяемой из растения смеси пектиновых веществ, которая включает пектиновые полисахариды в виде полимергомологов и сопутствующие им нейтральные полисахариды, главным образом, арабиногалактаны, в меньшей степени, галактаны и арабинаны. Остальные полисахариды, как правило, отделяются от пектиновых веществ в процессе выделения последних [79]. Для структурного изучения полисахаридов очень важное значение имеет гомогенность исследуемого образца. Но даже отдельные пектины в виде полимергомологов различаются по молекулярной массе и нередко по количественному моносахаридному составу, что обусловлено блочным и нерегулярным строением пектиновых полисахаридов. Жестких критериев гомогенности не существует. Полисахарид считают индивидуальным, если в результате различных способов очистки его моносахаридный состав и физико-химические характеристики остаются неизменными [5]. Разделение смеси полисахаридов часто является сложной задачей, что зависит от числа полисахаридов в разделяемой смеси и степени сходства их химической структуры.
Методы разделения полисахаридов очень разнообразны. В частности, для разделения смеси пектиновых веществ, полученных в результате экстракции, необходимо учитывать особенности входящих в её состав пектиновых полисахаридов. Например, гельхроматография, столь успешно используемая для разделения многих смесей, имеет лишь ограниченное применение к высокомолекулярным пектиновым полисахаридам с высоким содержанием остатков Б-галактуроновой кислоты. Практически все они проходят через колонки с молекулярными ситами без задержки и элюируются сразу за свободным объемом колонки, не разделяясь и не давая возможности оценить их молекулярную массу даже на самых высоких марках гелей с наибольшим размером пор.
Широко используется для разделения кислых и нейтральных компонентов пектиновых веществ ионообменная хроматография, в основе которой лежит динамический процесс замещения ионов, связанных с неподвижной фазой (матрицей), ионами элюента, поступающего на колонку [118]. Ионообменная хроматография позволяет разделить смеси пектиновых веществ на нейтральные и кислые, а последние фракционировать в соответствии с содержанием в них остатков Э-галактуроновой кислоты и в зависимости от степени метоксилирования карбоксильных групп этих остатков [119, 120], поскольку противоионы удерживаются на матрице за счет электростатического взаимодействия. Чем больше заряженных групп, тем сильнее полисахарид связан с матрицей и тем выше должна быть концентрация элюента. Поскольку суммарный заряд молекулы зависит от кислотности среды, то раньше в качестве элюента использовали растворы щелочей с возрастающей концентрацией [85]. Но, как отмечалось выше, в щелочной среде полисахариды, содержащие остатки гликуроновых кислот, подвергаются заметной деградации, поэтому в настоящее время элюирование проводят растворами солей (например, хлорида, ацетата натрия), которые изменяют ионную силу раствора, а ионы элюента конкурируют с ионами компонентов смеси [109, 121].
Хорошего разделения смеси кислых и нейтральных полисахаридов удается достичь при использовании анионитов, представляющих собой диэтиламиноэтильные (БЕЛЕ) производные целлюлозы, сефарозы, тойоперла [109, 122, 123].
Другим методом, позволяющим разделить смеси кислых и нейтральных полисахаридов, входящих в состав пектиновых веществ, является фракционирование с помощью солей таких металлов, как Си, Са, М [124, 125], разделение с образованием боратных комплексов при наличии моносахаридных остатков с а-цис-гликольными группировками (маннозы, рамнозы и т.п.) [5], с использованием четвертичных аммониевых солей таких, как цетилтриметиламмоний бромид (цетавлон) и цетилпиридиний хлорид [123, 126], имеющих в структуре длинные углеводородные радикалы. С солями вышеуказанных металлов кислые полисахариды дают нерастворимые в воде и водных растворах производные и легко отделятся от оставшихся в растворе нейтральных полисахаридов [5, 127]. Так, например, обработкой экстракта молодых стеблей Rosa glauca 7%-ным водным раствором ацетата меди удалось достичь разделения смеси кислого галактуронана и нейтрального арабинана [128]. Среди солей металлов наиболее часто используются комплексообразующие свойства фелинговой жидкости (раствор Фелинга), которая представляет собой раствор C11SO4 и тартрата калия-натрия (сегнетовой соли) в 10%-ном водном растворе NaOH. Прием широко применяется для осаждения и отделения сопутствующих полисахаридов, содержащих значительное число а-1,4-связанных остатков D-маннопиранозы [127, 129].
Четвертичные аммониевые соли, производные цетильного радикала, очень часто применяются для отделения кислых полисахаридов, в частности, пектинов от сопутствующих нейтральных. Этот очень мягкий и эффективный метод очистки пектиновых полисахаридов довольно долго применялся в углеводной химии [5, 127]. Так, например, в результате обработки водного экстракта 5%-ным водным раствором цетавлона и 0.05 М раствором тетрабората натрия (буры) удалось отделить кислые полисахариды от нейтральных и успешно разделить смесь двух кислых полисахаридов [130].
Апиогалактуронан - основной фрагмент разветвленной области лемнана
Функциональные полисахариды растений: пектиновые вещества, камеди и слизи, - обеспечивают все основные процессы жизнедеятельности растений [8, 10, 19, 22]. Например, камеди играют важнейшую защитную роль при механическом повреждении растений, обеспечивая быструю ликвидацию пораженных участков и препятствуя проникновению фитопатогенов внутрь растения [9, 19]. Слизи и, в первую очередь, слизи семян создают ту вязкую среду, в которой протекают процессы жизнедеятельности клетки, включая прорастание семян и развитие проростков [9, 19].
Много разнообразных и важных функций выполняют пектиновые вещества. Они обеспечивают тургор растений, препятствуют увяданию, обусловливают зимостойкость и засухоустойчивость растений, играют существенную роль в водносолевом обмене растительных клеток, в их взаимодействии друг с другом, чрезвычайно важно их значение в прорастании семян и созревании плодов, предохранении растений от поражения фитопатогенами и т.д. [8, 9, 22, 23, 40, 172, 187, 188]. Выяснение влияния структурных элементов пектиновых веществ на их биологичекую функцию является одной из принципиальных задач современной биоорганической химии [9, 21]. Мы уже говорили ранее о многообразной физиологической активности пектиновых веществ [8, 103]. При этом уже сейчас ясно, насколько большое значение имеет не только общая архитектоника пектиновых макромолекул, но и особенно тонкая структура этих сложнейших биополимеров, в частности, велика роль моносахаридных остатков, локализующихся на невосстанавливающих, терминальных концах главной и боковых цепей [10-13, 77, 79].
Более того, известно [189], что растительные полисахариды являются одним из необходимых компонентов питания. Какое влияние оказывают поступающие с пищей полисахариды на процессы, проходящие в организме животных и человека? По существующим ныне представлениям целлюлоза, гемицеллюлозы и пектиновые вещества не утилизируются организмом, а в качестве «пищевых волокон» участвуют в деятельности пищеварительного тракта, в частности, в образовании гелеобразных структур, в стимуляции иммунной системы организма [189]. Недостаток полисахаридов ведет к серьезным заболеваниям как пищеварительной системы, так и организма в целом. Поэтому для выяснения процессов трансформации растительных полисахаридов в организме животных и человека необходимо прежде всего исследовать их структуру, в том числе тонкие элементы строения макромолекул. В свою очередь, эта проблема ведет к постановке другой, не менее важной и сложной задачи, заключающейся в выделении полисахаридов из растительных тканей в нативном состоянии, в котором они присутствуют в живых растениях и участвуют во всех их жизненных процессах. На сегодняшний день решение этих двух задач является наиболее важным в исследовании растительных полисахаридов. В отношении пектиновых веществ по-прежнему принципиальной проблемой остается прямое доказательство наличия ковалентных связей между пектиновыми полисахаридами и сопутствующими им галактанами, арабинанами и арабиногалактанами пектиновых веществ. Эта проблема решается исследователями в каждом конкретном случае для пектиновых веществ любого растения. При этом в процессе выяснения взаимосвязи структуры и функции пектиновых веществ необходимо устанавливать, насколько при возникновении ковалентных связей в результате биосинтеза пектиновых полисахаридов изменяются биологические функции и физиологическая активность галактуронана, 1Ш и сопутствующих полисахаридов: арабиногалактанов, галактанов, арабинанов, каждый из которых обладает определенной биологической активностью [10, 33, 44, 106].
Ряска малая Lemna minor L., широко распространенное пресноводное цветковое растение, произрастает в водоемах со стоячей водой по всей территории России. Семейство рясковые Lemnaceae включает 6 родов и около 30 видов. Рясковые относятся к числу ботанических курьезов или растений, до сих пор мало изученных в отношении их биологии [190]. Это уникальное растение - чрезвычайно ценный экспериментальный объект не только для морфогенетических, но и для физиологических и биохимических исследований.
Ряска в качестве пищевой добавки издавна использовалась в народной медицине как жаропонижающее, противовоспалительное, желчегонное средство. Лекарственная ценность растений сем. рясковых обусловливает интерес к их химическому составу. Ранее из ряски малой был выделен пектиновый полисахарид, в составе которого обнаружен редко встречающийся разветвленный моносахарид апиоза [182-184]. D-апиоза, 3-С- гидроксиметил-Б-г/шг/еро-тетроза, впервые была выделена из апиина, гликозида петрушки Apium petroselinum, откуда и произошло название данного необычного, разветвленного моносахарида [Цит. по: 191]. Ранее отмечалось, что наличие остатков D-апиозы в растительных полисахаридах увеличивает устойчивость растений к поражению фитопатогенами, препятствует природным процессам гниения и разложения [8, 85]. Известно, что поражение растения начинается с деградации пектиновых веществ пектинолитическими ферментами фитопатогенов [39].
В 1968 г. [85] было показано, что в состав зостерана, пектинового полисахарида морских трав сем. Zosteraceae, входит апиогалактуронан, устойчивый к действию пектиназ, что и обусловливает резистентность этого водного растения к природным процессам гниения [8, 85]. Позднее [182 - 185], было показано, что апиогалактуронан входит в состав ряски малой L. minor L. Наши предварительные исследования показали, что в ряске присутствует более сложный пектин, содержащий, наряду с основным фрагментом - апиогалактуронаном, еще и фрагмент гетерогликаногалактуронана [192,193]. D-апиоза уже давно в небольших количествах была обнаружена в составе многих растительных полисахаридов [Цит. по: 194]. Впоследствии было найдено, что апиоза является одним из компонентов RG-II [186], который выделяется из первичных клеточных стенок растений при обработке эн()о-а-1,4-0-полигалактуроназой [157-159] и в котором апиоза играет важную структурную роль: две цепи RG-II сшиваются друг с другом с образованием димеров в виде боратных диольных эфиров, связывающих между собой остатки апиозы в двух разных углеводных цепях [160, 161, 164]. Поскольку RG-II является важным структурным элементом первичных клеточных стенок большинства растений, поиски путей выделения и идентификации D-апиозы представляют несомненный принципиальный и прикладной интерес.
Препаративное выделение моносахаридов методом ВЭЖХ
Для выбора оптимального варианта использовали сравнение результатов экстракции воздушно-сухого, свежесобранного и замороженного растительного материала. Было установлено, что образцы лемнана, выделенные из воздушно-сухого и свежесобранного сырья, практически идентичны, но во втором случае выход лемнана был существенно выше. Образец, выделенный из замороженного сырья, отличается от первых двух значительным содержанием ксилозы, что может свидетельствовать о разрушении клеточной стенки растения в процессе замораживания- оттаивания и об освобождении гемицеллюлоз. На основе полученных данных для дальнейшего исследования в качестве сырья для выделения лемнана использовали свежесобранную ряску.
За основу был взят ранее разработанный метод выделения зостерана - пектинового полисахарида из морских трав семейства Zosteraceae [180, 181]. Данный выбор связан с тем, что для экстракции зостерана используется свежесобранное растительное сырьё, а в самом методе выделения отсутствует стадия экстракции водой и водными растворами кислот и для извлечения зостерана применяется водный раствор оксалата аммония. Во всех биологических объектах, в том числе и в растениях, помимо полисахаридов, присутствует ряд таких соединений, как олигосахариды, сопутствующие белки, белки-ферменты, липиды, фенольные производные и другие окрашенные и неокрашенные соединения, которые также растворимы в воде [5, 7, 9, 43]. Для того, чтобы предотвратить ферментативное разрушение полисахаридов в растительном сырье и удалить сопутствующие им низкомолекулярные вещества, в том числе и неуглеводной природы, проводят предварительную обработку органическими растворителями [8183]. Отсутствие в ряске водорастворимых полисахаридов позволило нам исключить эту обработку и сразу использовать водный раствор формальдегида для дезактивации ферментов, удаления части низкомолекулярных веществ и связывания полифенольных соединений, не опасаясь при этом потерь лемнана в процессе водной обработки. Хорошо известно [5], что на последней стадии выделения и очистки зостерана и других полисахаридов используют осаждение их этиловым спиртом из полученных водных растворов.
Принимая во внимание вышеизложенное, для выделения лемнана нами была разработана методика [193], схема которой представлена на рис. 7.
Концентрацию экстрагента - водного оксалата аммония - варьировали от 0.5% до 2.0%, установив при этом, что увеличение концентрации приводит лишь к незначительному увеличению количества экстрагируемого полисахарида. Но так как щавелевокислый аммоний осаждается этиловым спиртом, то при увеличении концентрации экстрагента наблюдается рост загрязнения оксалатом аммония осажденного полисахарида, требуется дополнительная более длительная очистка выделенного полисахарида. Исходя из этого, мы установили, что оптимальной является обработка подготовленного сырья 0.7%-ным водным оксалатом аммония при 70С.
При подборе времени контакта растворителя с сырьем учитывали, что длительное температурное воздействие на растительный материал, как известно, приводит к значительной деградации полисахаридов [92, 95-97, 99]. В результате нами было найдено, что исчерпывающая экстракция лемнана достигается при 4-х часовой экстракции на каждой стадии трехкратной обработки сырья 0.7%-ным водным оксалатом аммония. Для сокращения времени экстракции, мы сделали попытку обрабатывать сырьё сразу трехкратным объемом экстрагента в течение 6 ч. В результате практически полная экстракция лемнана была достигнута при двухкратном сокращении времени температурного воздействия на растительный материал.
Известно, что содержание пектиновых полисахаридов в растениях зависит от стадии развития клеток, т.е. от периода вегетации растения [81, 86]. Показано, что максимальное накопление полисахаридных фракций в цветковых растениях происходит в фазу цветения [81, 86]. Наиболее ярко зависимость количественных и качественных характеристик полисахаридов от фазы роста клеток показана на примере суспензионных культур [199, 200]. Максимальный биосинтез пектиновых полисахаридов наблюдается в экспоненциальную фазу роста клеток, во время которой происходит наиболее интенсивный рост клеток [201, 202]. Во время стационарной фазы и деградации клеток наблюдается снижение выхода пектинов [201, 202]. При изучении зависимости количественных и качественных характеристик полисахаридов от месяца сбора растительного материала было выяснено, что подобные изменения происходят и в ряске малой. Предварительное исследование моносахаридного состава, содержания белка, вязкости и молекулярной массы образцов лемнана из ряски, собранной с поверхности озер в период с июня по октябрь, показало, что биосинтез пектинового полисахарида заканчивается к октябрю [194]. К октябрю повышается содержание галактуроновой кислоты, растет вязкость водных растворов, количество моносахаридных остатков остается практически неизменным на фоне снижения содержания лемнана в растении (табл.2). На основании этих данных для дальнейшего исследования в качестве растительного материала использовали ряску, собранную в октябре.
Как уже отмечалось нами ранее (стр. 23), в последние годы в процессе выделения полисахаридов стали широко использоваться ультрафильтрационные волоконные аппараты [86, 87, 94]. В этой связи мы провели сравнение образцов лемнана, выделенных с использованием вышеприведенной схемы (рис. 7) и с применением ультрафильтрации. В результате было найдено, что аналитические характеристики образцов, полученных обоими методами, близки друг другу (табл. 2) и, следовательно, оба метода являются взаимозаменяемыми. Однако следует указать, что при применении ультрафильтрационных колонок отмечается быстрое концентрирование водных растворов лемнана с одновременным диализом и удалением низкомолекулярных примесей, что приводит к заметной экономии времени выделения очищенного лемнана. Одновременно существенно сокращаются расходы этанола в процессе осаждения лемнана. Для определения гомогенности выделенного лемнана, которая является чрезвычайно важной характеристикой для дальнейшего структурного исследования, использовали метод ионообменной хроматографии на БЕАЕ- целлюлозе, которая позволяет разделить смеси полисахаридов в зависимости от содержания в них остатков Э-галактуроновой кислоты и степени метоксилирования карбоксильных групп этих остатков [119, 120].
