Содержание к диссертации
Введение
1. Литературный обзор 8
1.1. Нуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы ВИЧ 8
1.2. Синтетические подходы к структурной модификации нуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы ВИЧ 10
1.2.1. Подход к созданию prodrug на основе нуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы ВИЧ 10
1.2.1.1. Липофильные производные анти-ВИЧ-активных нуклеозидов с гидрофобными соединениями 10
1.2.1.2. Пролекарственные производные анти-ВИЧ-активных нуклеозидов с активными транспортными системами 16
1.2.1.3. Липофильные анти-ВИЧ-активные пронуклеотидные производные 18
1.2.2, Подход к созданию double drug на основе нуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы ВИЧ с использованием комбинированной антивирусной терапии 22
1.2.2.1. Комбинированные системы нуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы и протеазы ВИЧ 23
1.2.2.2. Комбинированные системы нуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы ВИЧ с полисахаридами 25
1.2.2.3. Комбинированные системы нуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы ВИЧ с пептидами 27
1.2.2.4. Комбинированные системы нуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы ВИЧ с бицикламами 29
1.3. Полианионные соединения - ингибиторы вирусной адсорбции ЗI
1.3.1. Сульфатированные полисахариды 34
1.3.2. Синтетические полианионные производные полисахаридов 38
1.3.3. Полианионные соединения белковой природы 40
1.3.4. Полианионные ПАВ 41
1.3.5. Поликарбоксилатные аналоги козалана 42
1.4. Подходы к синтезу фосфоэфирных производных лшо-инозита 43
1.4.1. Н-фосфонатный метод 44
1.4.1.1 .Использование Н-фосфонатного метода для синтеза инозитсодержащих фосфолипидов 47
1.4.2. Амидофосфитный метод 49
1.4.2.1.Использование амидофосфитного метода для синтеза фосфоэфирных производных -имо-инозита 53
2. Результаты и их обсуждение 57
2.1. Синтез исходных соединений для конструирования новыхвеществ с потенциальной антивирусной активностью 57
2.1.1. Разработка метода синтеза производных частично замещенного фосфатидилинозита 57
2.1.2. Синтез липофильных а, о - диольных соединений 59
2.2. Синтез липофильных, в том числе инозитсодержащих, производных анти-ВИЧ-активных нуклеозидов 61
2.2.1. Синтез конъюгатов анти-ВИЧ-активных нуклеозидов и фосфатидилинозита 61
2.2.2. Синтез конъюгатов антивирусных нуклеозидов с липофильными а, ш - диольными соединениями 65
2.3. Синтез новых полианионных соединений с целью поиска эффективных ингибиторов вирусной адсорбции 69
2.3.1. Синтез димерного аналога фосфатидилинозита 69
2.3.2. Синтез различных полианионных производных на основе а, а - диольных соединений и димерного аналога фосфатидилинозита 71
2.3.2.1. Синтез сульфатных производных 71
2.3.2.2. Синтез фосфатных производных 73
2.3.2.3. Синтез карбоксиметильных производных 74
3. Экспериментальная часть 77
Выводы 91
- Подход к созданию prodrug на основе нуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы ВИЧ
- Комбинированные системы нуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы ВИЧ с пептидами
- Синтез липофильных, в том числе инозитсодержащих, производных анти-ВИЧ-активных нуклеозидов
- Синтез фосфатных производных
Введение к работе
Расширение знаний по молекулярной биологии различных вирусных инфекций и постоянный поиск эффективной химиотерапии для их лечения позволяют находить новые подходы к созданию лекарственных препаратов с высокой антивирусной активностью, действие которых направлено на специфические и критические процессы жизненного цикла вирусов, а также к улучшению фармакологических свойств применяемых в медицинской практике соединений,
Так, превращение неприродных нуклеозидов, таких как азидотимидин (AZT), 2\3Ч-дидезоксиинозин (tldl), 2",Зу-дидегидро-2\Зч-дидезокситимидин (d4T) и др., являющихся по механизму действия ингибиторами обратной транскриптазы вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), в их липофильные производные позволяет преодолеть недостатки данных нуклеозидов, связанные с их высокой токсичностью и слабой способностью к преодолению клеточных мембран и гематоэнцефалического барьера.
Наряду с работами в области противовирусных соединений нуклеозидной природы в последние годы широко развиваются исследования различных по структуре полианиоисодержащих веществ (сульфатов полисахаридов, попикарбоксилатов козалана, производных дистамицина и др.), выступающих в качестве ингибиторов адсорбции вирусной частицы на клеточной поверхности. Но такие соединения обладают рядом фармакокинетических и токсикологических недостатков, которые ставят под угрозу их клиническое использование. Поэтому необходим постоянный поиск новых полианионных соединений с целью получения препаратов с высокой антивирусной активностью и с улучшенными свойствами к биотранспорту.
Создание лекарственных препаратов на основе природного шестиатомного циклического спирта л/ш-инозита представляется перспективным направлением в конструировании и модификации фармакологически активных соединений. Интерес к химии производных лшо-инозита обуславливается их высокой биологической активностью. Установлено, что 1,4,5-трифосфат-^и-.иыо-инозита, являясь вторичным мессенджером, обеспечивает передачу и усиление клеточного сигнала в процессе высвобождения кальция из внутриклеточных источников. Известно также, что и сам миа-инозит обладает витаминной активностью и оказывает гиполипидемическое, липотропное, противоопухолевое действие. Кроме того, фосфоинозитиды являются минорными компонентами клеточных мембран и принимают активное участие в процессах клеточной регуляции. Поэтому, можно ожидать, что создание на их основе липофильных производных антивирусных нуклеозидов позволит улучшать фармакокинетические свойства, проницаемость через биологические мембраны, пролонгировать действие и способствовать направленному транспорту нуклеозидрв в клетки-мишени.
Кроме того, молекула лшо-инозита, в состав которой входят шесть гидроксильных групп, является удобной матрицей для введения различных ионогенных группировок при создании новых противовирусных полианионных соединений. При этом лшо-инозит может снижать отрицательное побочное воздействие препарата на организм, не изменяя его терапевтических свойств.
Таким образом, создание новых фармакологически активных соединений с улучшенным спектром терапевтического действия, в том числе и на основе „иыо-инозита, является актуальным направлением биоорганической и медицинской химии.
В связи с этим целью работы явилось исследование путей синтеза новых соединений нуклеозидной и ненуклеозидной природы на основе гидрофобных полиольных, в том числе ннозитсодержащих, молекулярных транспортных систем с целью поиска препаратов с потенциальной противовирусной активностью.
Подход к созданию prodrug на основе нуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы ВИЧ
Так как противовирусное действие нуклеозидных ингибиторов может зависеть от времени, то необходимо поддержание в организме их адекватной ингибирующей концентрации. Эта концентрация должна быть достаточной для проявления антивирусного эффекта, но не вызьгеать побочных явлений, таких как отравление костного мозга, связанного с избыточной концентрацией нуклеозида в плазме при оральном введении. Методом улучшения транспорта противовирусных веществ через липидные барьеры организма, и особенно из кишечника в лимфатическую систему, или в клетки из межклеточного пространства, или через ГЭБ служит создание пролекарственных соединений нуклеозидных ингибиторов, представляющих собой эфиры с гидрофобными соединениями по З -положению нуклеозида. Подобная химическая модификация антивирусных нуклеозидов направлена на получение более липофильных пролекарств с целью улучшения низкой проницаемости и быстрого выведения активных нуклеозидов из организма. Известно, что жирные кислоты обладают антивирусной и антимикробной активностью, механизмы действия которых различны. Отмечено, что они ннгибируют клеточное дыхание, а также участвуют в метаболизме углеводов и фосфолипидов [11]. Так, ацилированием 5"-гидроксильной группы А2Т хлорангидридами соответствуїощігх кислот, авторами [13-15] был синтезирован ряд сложноэфирных производных (8) (Рис.3) и изучен их ферментативный гидролиз в экспериментах in vitro и in vivo. Было показано, что скорость гидролиза и липофильность данных соединений возрастали с увеличением длины ацильных цепей. Так производные, содержащие 8-10 атомов углерода в цепи, показали самые высокие скорости распада в условиях ферментативного гидролиза. Однако при дальнейшем увеличении длины ацильных цепей (п 10) наблюдали снижение чувствительности полученных производных к гидролизу. Также в литературе описаны производные AZT с миристиновой кислотой и ее аналогами [16-18], антивирусное действие которых может быть направлено как на ингибирование обратной транскриптазы ВИЧ, так и на ингибирование миристоил-кофермента А — белка N-миристоилтрансферазы, ответственного за процесс миристоилирования в вирусах и грибах. Конъюгаты AZT с аналогами миристиновой кислоты. Структурно-функциональный анализ полученных производных показал четкую зависимость анти-ВИЧ-активности данных соединений от природы 5ч-заместителя.
Так 3"-азидо-2\3 -дезокси-5ч-0-(4-оксотетрадеканоил)тимидин (9а) (ЕС50 1.4 нМ), 3 -азидо-2\3 - дезокси-5 -0-( 12-бромдодеканоил)тимидин (96) (ECso 3.2 нМ) и Зч-азидо-2\3 -дезокси-5"-0-(тетрадеканоил)тимидин (9в) (ECso 3.8 нМ) (Рис.4) оказались наиболее эффективными анти-ВИЧ-1 агентами. Введение фенильной или феноксигруппы (производные (9д-ж)) значительно снижало антивирусную активность соединений. Высоколипофильные соединения оказались менее эффективными и селективными по сравнению с другими аналогами, Сложный эфир у линоленовой кислоты и AZT ингибировал репликацию вируса герпеса HSV-I, тогда как индивидуальные AZT и у-линоленовая кислота не обладают этим свойством [19]. Открытие еще одного нового цитозинового нуклеозида Р В-2\Зч-дидегидро-2",Зч-дидезокси-5-фторцитидина - потенциального агента против ВИЧ-инфекции - привело к созданию ряда его аналогов и производных [20], которые проявили по сравнению с исходным ингибитором схожую антивирусную активность, большую селективность, а также обладали повышенной стабильностью гликозидной связи в кислых условиях. Среди них следует выделить З О-ацилпроизводные p-D-2\3v-flHflerimpo-2\3v- дидезокси-5-фторцитидина (10а-в) (Рис.5) В качестве гидрофобных молекулярных транспортных систем для структурной модификации нуклеозидных ингибиторов наряду с жирными кислотами широко применяются различные классы липидов. Так были получены коньюгаты AZT с полярными липидами: лизофосфатидилэтаноламином и сфингозином, связующим звеном в которых выступал остаток адипиновой кислоты [21]. Исследования, проведенные на мышах in vivo, показали, что данные коньюгаты достигали мишеней намного лучше, чем исходный нуклеозид. В целях снижения токсичности и осуществления направленной доставки аналогов нуклеозидов в макрофаги получают различные фосфолипидные коньюгаты дидезоксинуклеозидов [22-24]. Хотя известен целый набор фосфатидовых производных различных антивирусных нуклеозидов, влияние природы фосфатидового остатка на анти-ВИЧ-активность остается неизученным.
Однако можно предположить зависимость антивирусной активности от природы ацильиых цепей. Прежде всего, от характера фосфатидовой части молекулы должна зависеть способность последней встраиваться в плазматическую мембрану и, следовательно, проникать в клетку. Кроме того, считается, что фосфатидилнуклеозиды в клетке гидролизуются эндогенными фосфолипазами и фосфатазами, образуя свободные антивирусные нуклеозиды и их фосфаты, а на специфичность действия этих ферментов строение фосфатидовой части влияет непосредственно. Фосфатидовые производные антивирусных нуклеозидов (AZT и ddl). Проведенные исследования противовирусной активности показали, что фосфатидовые производные нуклеозидов обоих типов имеют значительную анти-ВИЧ-активность, немного уступающую активности исходных AZT и ddl, По-видимому, фосфатидилнуклеозиды диалкильного и диацильного типов гидролизуются в клетках фосфодюстеразами (фосфолипазами), образуя соответствующие фосфаты нуклеозидов и (или) сами нуклеозиды, причем фосфатиды (13, 14) диалкильного типа расщепляются, видимо, несколько медленнее диацильных (11,12). Показано также, что фосфатидилнуклеозиды охотно образуют липосомы и включаются в фосфолипидный бислой. Липосомы, содержащие антивирусные липонуклеотиды, поглощаются в больших количествах макрофагами in vivo [25]. Именно это свойство, делает соединения данного класса многообещающими объектами, способными доставлять лекарственные формы в макрофаги - «хранилища» ВИЧ- инфекции, и, таким образом, уменьшать токсичность антивирусных нуклеозидов в отношении других клеток. Наиболее подробно внутриклеточный метаболизм нового анти-ВИЧ-активного тиоэфир-фосфолипид-AZT коныогата изучался в работе [26]. Для этого авторами был получен его Н-меченый аналог (15) (Рис.7) и исследовались продукты метаболизма в человеческих Т-лимфоцитарных клетках. Было показано, что конъюгат [эН]СР-102 расщепляется ферментами с высвобождением тиоэфирдиглицерида и AZT-монофосфата, который затем фосфорилируется до ди- или трифосфата, либо дефосфорилируется с образованием свободного нуклеозида. В последнее время в литературе появляются сообщения о конъюгатах неприродных нуклеозидов с синтетическими фосфолипидами [27]. Цитозинарабинозид (ага-С) и гемцитабин (dFdC) являются аналогами дезоксицитидина и эффективны против различных типов опухолей [27,28]. Подобно другим противовирусным нуклеозидам ага-С и dFdC фосфорилируются в клетках дезоксицитидинкиназой с образованием активной трифосфатной формы и ингибируют синтез ДНК. Для увеличения эффективности ага-С и dFdC были синтезированы конъюгаты данных нуклеозидов и фосфолипида, содержащего в С1 положении тиоэфир, а в положении С2 - простой эфир (Рис.8).
Комбинированные системы нуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы ВИЧ с пептидами
При предварительной оценке антивирусной активности производные AZT (42) и ddC (44) с более коротким пептидом показали значительное ингибирование ВИЧ-инфекции. Хемокины - это сравнительно небольшие полипептиды, биологическая роль которых состоит в привлечении лейкоцитов из кровотока к местам, где протекают воспалительные процессы или к местам скопления инфицированных клеток. Открытие хемокиновых рецепторов CXCR4 и CCR5 как корецепторов Т-клеток (Т-тропньгх) и макрофаготропных (М-тропных) штаммов ВИЧ-1, позволяет успешно применять различные пептидные аналоги хемокинов в комбинированной терапии с другими анти-ВИЧ-агентами для направленной доставки лекарства в инфицированные клетки и для увеличения антивирусной активности. Так исследователями [51,52] были получены бифункциональные анти-ВИЧ-соединения (47-49) (Рис,22), состоящие из ингибитора обратной транскриптазы (AZT) и пептидных антагонистов Т131 и Т140 хемокинового рецептора CXCR4. Все конъюгаты показали высокую антивирусную активность и высвобождали достаточное количество AZT в экспериментах in vitro. Кроме того, подобные комбинированные лекарства обладают рядом преимуществ: 1) эти соединения аффинны к CXCR4 корецептору ВИЧ и могут выступать транспортными системами для доставки лекарства к Т-клеткам; 2) эти конъюгаты являются бифункциональными агентами, действие которых направлено на различные процессы репликативного цикла ВИЧ-инфекции, Также был осуществлен синтез гибридных соединений эффективного противовирусного нуклеозида d4T с иммуноактивным дипептидом тимогеном [48]. Наличие в молекуле дипептида трех функциональных групп позволяет использовать несколько вариантов связывания с 5"-гидроксильной группой d4T. Таким образом, были получены конъюгаты, в которых антивирусный нуклеозид связан с карбоксильными группами как триптофанового, так и глутаминового фрагментов. Анализ противовирусной активности показал, что конъюгат тимогена с d4T, соединенный через карбоксильную группу триптофана, и конъюгат нуклеозида с триптофаном являются высокоактивными соединениями. Кроме того, оба конъюгата не обладали цитотоксичностью в концентрациях до 100 цг/мл в отношении МТ-4 клеток человека. Механизм действия бистетраазомакроциклов заключается в разрушении белковой оболочки вирусной частицы.
Они ингибируют репликацию ВИЧ 1 и 2 типов в пределах концентраций от 0.1 до 1 дг/мл, оставаясь нетоксичными для здоровых клеток при концентрациях до 1500 цг/мл. Известно, что воздействие бициклических соединений является промежуточной стадией между связыванием вируса с клеткой и процессом обратной транскрипции. Однако пока не установлено, с какими именно вирусными гликопротеинами или капсидными белками, а также молекулярными сайтами данные ингибиторы взаимодействуют, что делает их перспективными для дальнейших исследований с целью поиска эффективных противовирусных препаратов. Предполагают, что бицикламы взаимодействуют с рецептором хемокинов CXCR4, предотвращая таким образом слияние вируса с Т-клеткой [60]. Эти наблюдения позволили авторам [49] получить несколько серий комбинированных конъюгатов бицикламов с нуклеозидным ингибитором обратной транскриптазы (Рис.24). Интерес к созданию подобных соединений в первую очередь связан с возможностью их использования для эффективной направленной доставки лекарственных форм к инфицированным клеткам. Монопикламные аналоги оказались несколько менее активными, чем бицикламные. Конъюгат (55) был на порядок более активен, чем исходный AZT, тогда как производное (56) проявило схожую активность по сравнению AZT. Эти соединения оказались достаточно липофильиыми для проникновения через клеточные мембраны путем простой диффузии, что удовлетворительно подтверждает их противовирусная активность. Следует отметить, что на способность бициклам-АТТ-конъюгатов связываться с СХСЯЧ-рецептором влияют количество свободных атомов азота в цикламных фрагментах, которое должно быть максимальным, и структура спейсера. Спейсеры, содержащие ксилильный или алкильный фрагменты оказались наиболее эффективными. Показано также, что такие конъюгаты устойчивы в щелочных и кислых условиях, и слабо чувствительны к ферментам. Из литературных данных известно, что вирус иммунодефицита человека инфицирует главным образом С04(+)-лимфоцитарные клетки. Их узнавание и инфицирование происходит посредством связывания вирусного гликопротеина gpl20 с CD4, а затем с клеточным корецептором CXCR4 или CCR5. Однако, ВИЧ инфицирует и многие CD4(-) клетки, за счет связывания вирусного gpl20 с галактозшщерамидом клетки-мишени. Интерес исследователей [61] привлекла возможность разработать бифармакофорные противовирусные соединения (57а-б), в которых в качестве лигандов выступают аналоги бициклама AMD3100 и гагсактозилцерамида (Рис.25) Предполагалось, что полученный конъюгат сможет ингибировать сразу несколько стадий в каскаде вирус-клеточных взаимодействий. Такой подход к созданию double drug для ингибирования близких процессов вирус-клеточной адсорбции и вирус-клеточного слияния исследуется впервые. К сожалению, в результате проведенных биологических исследований антивирусная активность полученных конъюгатов оказалась намного ниже противовирусной активности AMD3100, Однако, по сравнению с галактозилцерамидом конъюгирование последнего с анти-ВИЧ-активным бицикламом привело к увеличению его антивирусной эффективности. К настоящему времени описано довольно большое количество различных по своей структуре полианионных соединений, которые блокируют репликацию ВИЧ посредством вмешательства в процесс адсорбции (реже в процесс слияния) вируса на клеточной поверхности.
Среди них можно выделить полисульфаты, полисульфонаты, поликарбоксилаты, полифосфаты, полифосфонаты и др. Данный класс противовирусных ингибиторов также включает в себя аналоги козалана, содержащие поликарбоксилатный фармакофор [62], а также сульфатированные полисахариды, выделенные из морских водорослей [63]. Процесс инфицирования клетки вирусом начинается с двух главных этапов: сначала происходит адсорбция вируса на поверхности клетки, затем слияние, т.е. проникновение инфекционного материала через мембрану клетки [64]. Адсорбция вируса (Рис.2б) начинается с взаимодействия вирусного гликопротеина gpl20 с первичным рецептором CD4 на поверхности клетки, а именно с той его областью, которая имеет сродство к белку gpI20 (стадия В), нековалентно связанному с вирусным белком gp41. Затем, в связанном с CD4 виде, белок gpl20 претерпевает изменение, и область V3 гликопротеина gpl20 приобретает способность связываться с рецепторами (на схеме coreceptor), расположенными на поверхности клетки - мишени (стадия С). После образования тройного комплекса CD4-gpI20-coreceptor, субъединица gp41 также конформационно изменяется, давая так называемый пре-шпилечный интермедиат, размещая с помощью шарнирного механизма пептид слияния с N-конца против поверхности мембраны клетки (стадия D). Складывание белка gp41 приводит к сближению мембран и проникновению вируса внутрь клетки (стадия Е). Механизм антивирусного действия всех полианионных соединений, как полученных синтетическим путем, так и природных, заключается непосредственно в экранировании положительно заряженных сайтов в УЗ-петле вирусного гликопротеина gpl20. Следует отметить также, что эти соединения не только ингибируют проникновение вируса в клетку, но и оказывают влияние на образование синциев (гигантских клеток), которое, как и процесс проникновения вируса в клетку, зависит от gpl20-CD4 взаимодействия. Наряду с ВИЧ-инфекцией, под сферу антивирусной активности полианионных соединений попадает и ряд других покрытых белковой оболочкой вирусов: вирус герпеса (HSV), цитомегаловирус (CMV), орто- и парамиксовирусы (вирус гриппа A, RSV), тога-, флави-, арановирусы - что потенциально позволяет широко использовать эти соединения для лечения вирусных инфекций [65]. В таблице 1 представлены данные по антивирусной активности различных классов полианионных соединений, некоторые из которых будут рассмотрены нами более подробно далее.
Синтез липофильных, в том числе инозитсодержащих, производных анти-ВИЧ-активных нуклеозидов
Фосфоинозитиды, являясь минорными компонентами клеточных мембран, принимают активное участие в процессах клеточной регуляции [92, 93, 141, 142]. За счет конъюгирования их с антивирусными аналогами нуклеозидов возможно ожидать появления у пролекарственных соединений способности проникать через клеточную мембрану и концентрироваться в клетках-мишенях. Кроме того, известно о существовании липидпереносящих белков, имеющих большое сродство к инозитсодержащим фосфолипидам [143, 144]. Следовательно, представляло интерес исследовать путь синтеза подобных конъюгатов с целью улучшения транспортных свойств фармакологически активных нуклеозидов и возможности их более эффективного проникновения в клетку (при расщеплении конъюгатов мембранными ферментами, либо за счет рецепторно-опосредовашгого транспорта этих веществ внутрь клетки). Для этого синтезированный ранее частично замещенный фосфатидилинозит (3) использовали для получения липофильного производного d4T по его свободной гидроксильной группе (Схема 4). Сначала остаток янтарной кислоты, выбранный нами в качестве удобного бифункционального и биодеградируемого спейсера между гидрофобной и гидрофильной частями целевого конъюгата (16), вводили действием янтарного ангидрида на соединение (3) в присутствии диметиламинопиридина. Полученное полностью замещенное производное лшо-инозита (10) было охарактеризовано с помощью 1Н-ЯМР-спектроскопии: в спектре соединения (10) появились сигналы метиленовых протонов в области 2.60-2.82 м.д. Последующую этерификацию сукцннильного эфира фосфатидилинозита (10) d4T (11) проводили при активирующем воздействии дициклогексилкарбодиимида. Продукт реакции (14), выделенный колоночной хроматографией на силикагеле, был получен с 67% выходом. Структуру соединения (14) подтверждали спектральными данными (Табл.1). Второй вариант синтеза фосфолипидного производного d4T (14) заключался во взаимодействии дикеталя фосфоинозитида (3) с синтезированным сукцинильным эфиром (13) нуклеозида. После проведения реакции в описанных для первого варианта условиях из реакционной смеси хроматографией выделяли с выходом 61% соединение (14), физико-химические характеристики которого совпадали с таковыми для аналогичного производного, синтезированного выше описанным способом.
На заключительном этапе синтеза фосфатидилинозитсодержащего конъюгата d4T (16) действием 50% водной уксусной кислоты проводили гидролиз изопропилиденовых групп в соединении (14). Целевой продукт (16) после обработки реакционной смеси и осаждения из смеси этанол-хлороформ выделяли в виде аммониевой соли, выход которой составил 45%. Структуру полученного коныогата (16) однозначно подтверждали данными Н-ЯМР-спектроскопии (Табл.1) и масс-спектрометрии. В масс-спектре наблюдали наличие сигнала, соответствующего молекулярному иону [М+Н]+ (m/z 1117.2). Сравнивая два изученных варианта синтеза конъюгата (16), можно отметить, что более мягкой процедурой является первоначальная обработка производного фосфатидилинозита (3) ацилируїощим агентом, позволяющая практически полностью заместить свободную гидроксильную группу на сукцинильный остаток, и последующее взаимодействие промежуточного сукцинильного эфира (10) с нуклеозидным компонентом (11). Последнее превращение с участием первичного гидроксила нуклеозида (11) протекает быстрее и с большей степенью конверсии, нежели по второму варианту конъюгирования, где моносукцинат нуклеозида (13) реагирует по вторичному, пространственно затрудненному гидроксилу защищенного лшо-инозита (3). Поэтому для синтеза липофильного инозитсодержащего производного AZT (17) мы использовали стратегию, основанную на взаимодействии нуклеозида (12) и сукцинильного производного фосфатидилинозита (10) в условиях, аналогичных получению соединения (14) по первому варианту конъюгирования. При этом достигался 34% выход защищенного конъюгата (15). Последующий гидролиз изопропилиденовых групп в соединении (15) осуществляли в мягких условиях нагреванием при 50С со смолой Dowex 50wx2. После обработки реакционной смеси и колоночной хроматографии на силикагеле выход целевого фосфолипидного производного AZT (17) составил 38%. Структуру полученного соединения подтверждали спектральными данными (Табл.1). На следующем этапе исследования мы предложили использовать молекулу фосфатидилинозита (5), имеющую в своей структуре три свободных гидроксильных группы, в качестве удобной матрицы для одновременного введения нескольких остатков AZT. Взаимодействие монокетального производного фосфатидилинозита (5) (Схема 5) с 6-кратным избытком сукцинильного эфира AZT (18) при активирующем воздействии дициклогексилкарбодиимида приводило к образованию дипуклеозидсодержащего фосфоинозитида (19), выход которого после выделения колоночной хроматографией составил 98%. Данные Н-ЯМР-спектроскопии (ТаблД) подтвердили структуру полученного соединения (19). В Н-ЯМР-спектре наблюдали требуемое соотношение протонов фосфолипидного фрагмента и двух нуклеозидных остатков. Удаление і/мс-кетальной защитной группы соединения (19) осуществляли мягким кислотным гидролизом - нагреванием при 50С со смолой Dowex 50wx2.
Динуклеозидфосфолипид (20) выделяли из реакционной смеси колоночной хроматографией на силикагеле с выходом 30%, и структуру которого подтверждали Н-ЯМР-спектроскопией (Табл.1). Таким образом, на данном этапе работы нами были разработаны подходы н осуществлен синтез новых липофильных инозитсодержащих производных анти-ВИЧ-активных нуклеозидов (AZT и d4T). Показано, что антивирусная эффективность соединения зависит не только от способности лекарственного препарата ингибировать действие фермента, но также от концентрации активного вещества внутри клетки-мишени [44]. Поэтому при использовании полигидроксильных соединений в качестве липофильных молекулярных транспортных систем для одновременной доставки нескольких остатков антивирусных нуклеозидов в инфицированные клетки возможно ожидать увеличения внутриклеточной концентрации и антивирусной эффективности фармакологически активного соединения за счет улучшения транспортных свойств вследствие структурной аффинности липофильного компонента к липидному матриксу клеточных мембран. Таким образом, одним из перспективных направлений структурной модификации антивирусных нуклеозидов является получение их липофильных биоконъюгатов, содержащих различное количество остатков активного соединения. В результате на данном этапе работы мы синтезировали пять новых нуклеозидных конъюгатов, в которых два остатка анти-ВИЧ-активного нуклеозида связаны одним гидрофобным фрагментом. Структурная модификация и синтез пролекарственных форм фармакологически активных соединений предполагает высвобождение лекарства в результате внутриклеточной биотрансформации, поэтому связь между фармакофорным фрагментом и гидрофобным транспортным звеном должна быть биодеградируемой. Применение сложноэфирной связи для соединения молекулярных фрагментов при синтезе подобных производных возможно, так как последняя легко разрушается эстеразами с высвобождением лекарства [145, 146]. Поэтому в качестве связующего спейсера между гидрофобной и гидрофильной частями динуклеозидсодержащих производных (21-24) (Схема 6) нами был выбран OBzl OBzl остаток янтарной кислоты.
Синтез фосфатных производных
В последнее время в биоорганической химии для синтеза различных фосфорсодержащих соединений все чаще применяются методы фосфорилирования с использованием соединений трехвалентного фосфора. Поэтому для синтеза дифосфатного производного теграбензилового диола (35) (Схема 10) мы использовали фосфиттриэфирный метод фосфорилирования. В качестве несложно получаемого и удобного в применении реагента трёхвалентного фосфора мы предложили использовать ди(2-цианэтил)хлорфосфит (33) [108]. Его синтезировали первоначальным взаимодействием 3-гидроксипропионитрила с триметилхлорсиланом в присутствии триэтштамина. Далее проводили реакцию взаимодействия 3-(триметилсилилокси)пропионитрила с трихлоридом фосфора в ацетонитриле. Целевой хлорфосфит (33), содержащийся в полученной смеси в количественном соотношении 75% согласно данным 31Р-ЯМР-спектроскопии, использовали далее без дополнительной очистки. Реакцию фосфитилирования гидроксильного соединения (б) хлорфосфитом (33) проводили в пиридине при активирующем воздействии /Я-тетразола, Окисление промежуточного дифосфиттриэфира до соответствующего дифосфаттриэфира (34) осуществляли раствором mpem-бутилгидроперекиси в декане. Обработка реакционной смеси и очистка защищенного дифосфата (34) колоночной хроматографией на силикагеле приводили к 38% выходу целевого дифосфатного производного (34). Структура полученного дифосфата (34) была подтверждена тН-ЯМР-спектроскопией: в спектре наряду с сигналами протонов бензильных групп и протонов углеводородной цепи спирта наблюдали сигналы метиленовых протонов четырех цианэтильных групп в областях 3.97-4.15 и 2.47-2.63 м.д. Удаление цианэтильных зашит с фосфорных центров соединения (34) проводили в условиях исчерпывающего аммонолиза действием 25%-ного водного аммиака в метаноле при нагревании до 56С в течение 48 ч. Однако определенные трудности возникли на стадии выделения свободного дифосфата (35), связанные в первую очередь с его высокой гидрофильностью, что сильно сказалось на выходе этого соединения. В результате выделения и очистки полученного дифосфата (35) методом препаративной ТСХ выход целевого соединения в виде аммониевой соли составил 30%. Структуру дифосфата (35) подтверждали данными ГН- и 31Р-ЯМР-спектроскопии. 31Р-ЯМР-спектр содержал характерный для фосфатной группы сигнал в области -2.75 м.д. 2.3.2.3. Синтез карбоксиметильных производных. Следующей задачей нашей работы являлось исследование подходов к синтезу карбоксиметилъных производных с использованием диолов (б) и (9) в качестве исходных соединений.
Реакцию получения карбоксиметильных производных спиртов предпочтительнее проводить с использованием галогенпроизводных сложных эфиров уксусной кислоты с последующим омылением сложных эфиров, так как применение галогенпроизводных самой уксусной кислоты приводит к образованию большого количества побочных продуктов. Введение карбоксиметильных групп осуществляли с использованием двух алкилирующих реагентов: этилхлорацетата (36) и трет-бутилбромацетата (41) (Схема 11). В результате реакции гидроксильных компонентов (6) и (9), активированных предварительно гидридом патрия, с этилхлорацетатом происходило образование соответствующих ди- (37, 39) и монозамещенных (38, 40) ацильных производных. Выходы моно- (38) и диацильного (37) производных тетрабензилидита составили 64% и 25% соответственно, а моно- (40) и дизамещенного (39) сложноэф ирных производных 1,12-додекандиола - 48% и 36%. Строение полученных соединений (37-40) было доказано данными Н-ЯМР-спектроскопии. Спектры производных тетрабензилового спирта (37,38) содержали наряду с сигналами протонов четырех бензильных групп и углеводородной цепи идита в случае дизамещенного производного (37) сигналы четырех протонов двух хлорацетатных групп в области 4.12-4.41 м.д., а в случае монозамещенного производного (38) - двух протонов хлорацетати ой группы в области 4.30-4.40 м.д. В Н-ЯМР-спектрах производных алифатического диола (39, 40) кроме сигналов метиленовых групп спирта в сильной области спектра наблюдался синглет четырех протонов в случае дизамещенного (39) и двух протонов в случае монозамещенного производного (40) хлорацетатных групп в области 4.37 м.д.
При использовании алкилирующего реагента с более объемным заместителем карбоксильной группы (41) нам удалось сместить направление реакции в сторону образования простых эфирных производных. Так при действии на тетрабензилидит (6) в аналогичных условиях 10-кратным избытком /ире/и-бутилбромацетата (41) получали дизамещешюе производное (42), выход которого составил 15%, и монозамещенное производное (43) с выходом 34%. Структуры полученных соединений однозначно подтверждали данными Н-ЯМР-спектроскопии: в спектрах наблюдали требуемое соотношение сигналов гидрофобного фрагмента, сигналов метиленовых протонов (3.97 м.д.) и протонов треm-бутильной группы (1.40 м,д.) для моно- и дизамещенного продуьстов соответственно-Последующее омыление сложных эфиров соединений (42) и (43) осуществляли водно-этанольным раствором щелочи. Монокарбоксиметильное производное (45) было вьщелено колоночной хроматографией на силикагеле с выходом 68%, а дикарбоксиметильное соединение (44) - препаративной ТСХ с выходом 61%. Данные Н-ЯМР-спектроскопии дикарбоксиметильного производного (44) показали отсутствие в спектре синглета протонов, соответствующих /w/wm-бутильной группе в области сильного поля и наличие синглета протонов метиленовой группы в области 3.97 м.д. Таким образом, на данном этапе работы нами были разработаны подходы и осуществлен синтез новых полианионных соединений, в том числе на основе димерного аналога фосфатидилинозита. Все эти производные могут выступать потенциальными ингибиторами адсорбции различных вирусов на клеточной поверхности, обладая улучшенной биодоступностью за счет сложного баланса их гидрофобно-гидрофильных свойств. Интересно отметить также, что синтезированные нами новые полианионные соединения (30, 32, 35, 44), содержащие липофильный шестиатомный фрагмент, представляют собой потенциальные антивирусные агенты, действие которых может быть направлено еще и на ингибирование протеазы ВИЧ. С целью изучения биологической активности и закономерности структура-противовирусная эффективность все синтезированные соединения были переданы нами для дальнейших исследований.
