Введение к работе
Актуальность проблемы. Изучение и практическое применение природных соединений имеют большое значение для укрепления здоровья и увеличения продолжительности жизни людей. Действительно, биомолекулы, химические структуры и биологические функции, которых изучает биоорганическая химия, используются в качестве биологически активных субстанций лекарств и ценных пищевых компонентов. На протяжении многих лет и до настоящего времени, основными источниками новых природных соединений были и остаются высшие наземные растения. Многие из них биосинтезируют метаболиты, обладающие выдающейся биологической активностью. Признано, что растения являются основным источником биологического материала при производстве лекарственных препаратов [Стоник В.А., 2004].
В последнее время доказано, что многие патологические состояния животных и человека вызываются нарушением нормального уровня свободных радикалов в их органах и тканях. Это в полной мере относится к естественному процессу старения, сердечно-сосудистым заболеваниям, воспалительным явлениям, ожогам и, прямо или косвенно, к онкологическим заболеваниям. В современной клинической практике коррекция подобных нарушений нередко выполняется применением экзогенных антиоксидантов полифенольной природы, благодаря чему полифенольные и хиноидные соединения природного происхождения стали в настоящее время важными объектами для изучения их структур и биомедицинских исследований. Весьма существенным является и то, что природные полифенольные антиоксиданты не только являются защитой организма от окислительного стресса, путем нейтрализации активных форм кислорода, но и могут регулировать окислительно-восстановительные свойства клеток, или ее компонентов и, таким образом, защищать клетки от старения. Повсеместное распространение полифенольных соединений в растениях, достаточно хорошая изученность некоторых из них, низкая токсичность и высокая фармакологическая активность привели к созданию ряда лекарственных препаратов на их основе [Rice-Evans С, 2001].
Природные ресурсы Российского Дальнего Востока предоставляют широкие возможности для получения разнообразных антиоксидантов и их композиций, прежде всего из лекарственных растений. Разработка новых лекарственных средств на основе дальневосточных растений, в первую очередь способных усиливать регенеративные процессы в печени, и внедрение их в широкую медицинскую практику приобрели особую социальную значимость. Сегодня большинство зарегистрированных в Российской Федерации препаратов данной группы являются импортными и, вследствие высокой стоимости, малодоступными для населения. В связи с чем, необходимо создание эффективных, малотоксичных отечественных гепатопротективных средств на основе природных антиоксидантов полифенольной природы, устраняющих основное звено патогенеза токсического гепатита - усиление перешеного окисления липидов, и улучшающих антитоксическую и экскреторную функции гепатоцитов печени.
С другой стороны, поскольку вследствие интенсивного и нерегулируемого сбора растительного сырья его запасы в природе истощаются, все большее значение приобретают биотехнологические способы получения ценных природных веществ, в том числе методы клеточной биотехнологии. Клетки растений можно выращивать в искусственных условиях на питательных средах неограниченно долго, при этом часть полученной биомассы используют для экстракции целевых продуктов, а другую часть пересаживают на свежую питательную среду для возобновления культуры. Независимость от влияния различных факторов окружающей среды (климат, сезон, погода, почвенные
условия, вредители), а нередко и более высокий выход и хорошее качество продукта делают эту технологию привлекательной. В настоящее время происходит развитие новых методов биотехнологии клеточных культур растений [Булгаков В.П. и соавт., 2004]. Одним из первых примеров практического применения такого подхода стал биосинтез в промышленном масштабе эфиров шиконина клеточными культурами Lithospermum erythrorhizon, осуществленный в Японии и в нашей стране.
Считается, что биотехнология клеточных культур растений поможет решить проблему сохранения в природе редких видов растений, а также создаст реальную возможность для разработок новейших методов получения наиболее ценных лекарственных веществ и, в конечном счете, новых медицинских препаратов. В условиях, когда постоянно падает доля лекарственных субстанций отечественного производства, представляется особенно важным развивать современные технологии, создающие надежную сырьевую базу для производства отечественных препаратов.
Объектами настоящего исследования явились редкие и ценные растения дальневосточной флоры. Выбор растений был произведен на основе литературных данных и личного опыта с учетом основного критерия -возможности их использовать для создания оригинальных отечественных препаратов. В итоге для углубленного исследования отобрано 5 перспективных видов растений - Lithospermum erythrorhizon Sieb. et Zucc. и Eritrichium sericeum (Lehm.) A. DC. сем. Boraginaceae, Maackia amurensis Rupr. et Maxim, сем. Fabaceae, Vitis amurensis Rupr. сем. Vitaceae, Taxus cuspidata Sieb. et Zucc. сем. Taxaceae. Для каждого вида осуществлен тщательный химический анализ его компонентов и вместе с сотрудниками Биолого-почвенного института ДВО РАН предприняты попытки получить активно-растущие клеточные культуры -воспроизводимые биотехнологические источники целевых хиноидных и/или полифенольных соединений. Большое внимание было уделено повышению продуктивности полученных клеточных культур растений и изучению фармакологической активности их метаболитов.
Цели и задачи исследования. Целью работы являлось выделение, установление строения и исследование биологической активности природных полифенольных и хиноидных соединений из экстрактов дальневосточных растений L. erythrorhizon (воробейник краснокорневои), Е. sericeum (незабудочник шелковистый), М. amurensis (маакия амурская), V. amurensis (виноград амурский), Т. cuspidata (тис остроконечный) и их клеточных культур, а также завершение разработки нового гепатопротективного лекарственного средства "Максар" на основе полифенольного комплекса из ядровой древесины маакии амурской.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
-
На основе полученных суммарных экстрактов из растений и их клеточных культур разработать методы выделения биологически активных соединений, выделить индивидуальные соединения и установить их химическое строение;
-
провести сравнительное изучение качественного состава и количественного соотношения полифенольных и хиноидных соединений в растениях и их клеточных культурах;
-
изучить биологическую активность препаратов из клеточных культур L. erythrorhizon, Е. sericeum и М. amurensis для определения перспективности их использования в косметике и медицине;
-
провести сравнительное изучение гепатопротективных, антиоксидантных и противовоспалительных свойств полифенольных комплексов из древесины М. amurensis и ее клеточной культуры;
-
определить антиоксидантную и антирадикальную активность полифенольных соединений из Т. cuspidata;
-
разработать с применением генно-инженерных методов и новых технологий подходы к увеличению биосинтеза биологически активных соединений культурами клеток;
-
разработать аналитические методы для установления подлинности и количественного определения активных компонентов в препаратах: "Маакии амурской древесина ангро", "Маакии амурской экстракт сухой", "Максар таблетки, покрытые оболочкой, 60 мг";
-
разработать нормативную документацию на сырье, субстанцию и лекарственную форму препарата "Максар";
-
осуществить регистрацию на территории Российской Федерации и промышленные выпуски препаратов: "Маакии амурской древесина ангро", "Маакии амурской экстракт сухой", "Максар таблетки, покрытые оболочкой, 60 мг".
Положения, выносимые на защиту:
-
Получены высокопродуктивные клеточные культуры из L. erythrorhizon, способные в течение длительного периода (20 лет) стабильно биосинтезировать изогексенилнафтазарины (ИГН) и изогексенилбензохинонилфураны (ИГБФ). Показано, что препарат "Масло шикониновое", приготовленный на основе ИГН и ИГБФ из биомассы клеток воробейника краснокорневого, обладает выраженным противовоспалительным действием при лечении рожистых воспалений.
-
Незабудочник шелковистый и его клеточные культуры Ег-1 и Е-4 содержат (-)-рабдозиин, розмариновую кислоту и новый полифенольный метаболит эритрихин. Воробейник краснокорневой и его клеточная культура ВК-39 синтезируют (+)-энантиомер рабдозиина и розмариновую кислоту. Содержание полифенолов в культурах клеток увеличено по сравнению с их содержанием в растениях.
-
Основными компонентами спиртовых экстрактов ядровой древесины маакии амурской, составляющими полифенольный комплекс препарата максар, являются 27 соединений, принадлежащих к разным классам природных полифенолов.
-
Клеточные культуры, полученные из побегов, черешков, цветковой кисти, почек и корней М. amurensis, способны синтезировать изофлавоны и птерокарпаны. Клеточная культура А-18 М. amurensis, полученная из проростков семян, продуцирует изофлавоноиды, представляющие собой моно-, ди- и малонилглюкозиды изофлавонов и птерокарпанов, и новый метаболит, структура которого установлена как 6'-0-малонил-3-0-/3-0-глюкопиранозил-6,6а-дегидромаакиаин. В отличие от растения, клеточные культуры маакии амурской не биосинтезируют мономерные и димерные стильбены.
-
Полифенольные комплексы, приготовленные из древесины М. amurensis и клеточной культуры А-18, обладают выраженным гепатопротективным и антиоксидантным действием.
-
Препарат максар снижает интенсивность процессов свободно-радикального окисления липидов, восстанавливает резервы эндогенных антиоксидантов в крови и печени животных, регулирует глутатионзависимые ферментативные антиоксидантные механизмы печени и способствует коррекции нарушений липидного обмена крови и липоидоза печени. Максар обладает противоопухолевым действием, характеризуется малой острой и хронической
токсичностью, не имеет мутагенного, эмбриотоксического, тератогенного, иммунотоксического и аллергизирующего эффектов.
-
Максар проявляет гепатопротективную активность у больных хроническим гепатитом вирусной и алкогольной этиологии; оказывает более выраженный по сравнению с карсилом терапевтический эффект. На основании результатов клинической апробации препарат максар рекомендован в качестве гепатопротективного средства для медицинского применения и промышленного выпуска.
-
Разработаны методы установления подлинности и стандартизации биологически активной субстанции и препарата максар, подготовлены следующие проекты фармакопейных статей предприятия (ФСП): "Маакии амурской древесина ангро", "Маакии амурской экстракт сухой", "Максар таблетки, покрытые оболочкой, 60 мг", которые прошли экспертизу ФГУ НЦ ЭСМП Росздравнадзора РФ.
-
Спиртовые экстракты стеблей V. amurensis содержат 6 мономерных и димерных стильбенов. Клеточная культура VB2 винограда амурского, трансформированная геном го/В, способна продуцировать только один транс-стильбен - резвератрол с выходом 3.15% на сухой вес клеток.
-
В состав экстракта из древесины Т. cuspidata входят четыре лигнана и два катехина, обладающие высокой антирадикальной и антиоксидантной активностью. Клеточная культура Т. cuspidata продуцирует три известных таксановых дитерпеноида и один новый, таксюнаннин-7(3-ол.
Научная новизна работы. Выполнено сравнительное изучение состава природных полифенольных и хиноидных соединений дальневосточных растений L. erythrorhizon, Е. sericeum, М. amurensis, V. amurensis, Т. cuspidata и их клеточных культур. Совместно с сотрудниками Биолого-почвенного института (БПИ ДВО РАН) получены высокопродуктивные культуры клеток L. erythrorhizon, Е. sericeum, М. amurensis, V. amurensis, Т. cuspidata и исследованы особенности накопления в них вторичных метаболитов. Из экстрактов 5 видов растений и их клеточных культур выделено и идентифицировано 74 природных метаболита. Установлено строение 8 новых природных соединений.
Изучена физиологическая активность целого ряда веществ и препаратов из указанных растений и созданных на их основе клеточных культур, в том числе показано, что косметическое средство "Масло шикониновое", полученное из клеточных культур воробейника, эффективно при лечении рожистых воспалений.
Впервые на основе клеточных культур L. erythrorhizon, Е. sericeum созданы два новых источника рабдозиина, причем в форме различных диастериомеров, (+)- и (-)-рабдозиина. Выявлено выраженное нефропротективное, диуретическое, противовоспалительное и антиоксидантное действие препаратов ПВ и ПН, приготовленных из клеточных культур L. erythrorhizon и Е. sericeum.
Впервые установлено, что основными компонентами спиртовых экстрактов ядровой древесины М. amurensis являются растительные полифенолы, составляющие полифенольный комплекс (ПФКД) препарата максар. В состав препарата входят: изофлавоны, птерокарпаны, мономерные стильбены, изофлаваны, изофлаваноны, халконы, олигомерные полифенолы и димерные транс-стильбены. В процессе выделения в кислых водно-спиртовых средах на сорбентах с обращенной фазой димерные транс-стильбены, при их облучении ультрафиолетовым светом, легко изомеризуются в димерные цус-стильбены. Доказано, что в процессе производства и хранения субстанции препарата максар такой изомеризации не происходит.
Показано, что, кроме выраженного гепатопротективного действия, препарат максар способствует коррекции нарушений липидного спектра крови и жировой
дистрофии печени, повышает активность системы антиоксидантной защиты организма и препятствует развитию алиментарной гиперлипопротеинемии у животных. Он оказывает антиоксидантное действие при экспериментальном сахарном диабете, индуцированном аллоксаном, снижает интенсивность образования в печени продуктов перекисного окисления липидов (ДК, МДА), регулирует систему антиоксидантной защиты организма животных преимущественно через глутатионзависимые ферментативные механизмы, улучшает детоксикацию гидропероксидных радикалов. Максар уменьшает коагуляционные свойства крови и препятствует формированию тромба в сосуде при его инициации раствором хлорида железа у крыс после овариоэктомии. Впервые показано, что максар обладает противоопухолевым действием -ингибирует рост колоний клеток рака кишечника человека DLD-1 и НТ-29.
Впервые из клеточной культуры А-18 М. amurensis выделено и структурно идентифицировано 20 изофлавоноидов и проведено полное отнесение сигналов протонов и углеродов в ЯМР спектрах гликозидной части этих соединений. Культура клеток А-18 является стабильным продуцентом и накапливает до 1.9% изофлавоноидов на сухую массу клеток.
Впервые была проведена сравнительная оценка гепатопротективных, антиоксидантных и противовоспалительных свойств полифенольных комплексов (ПФК), приготовленных из древесины и клеточной культуры М. amurensis. Показано, что оба фитокомплекса в разной степени обладали выраженным гепатозащитным действием и влиянием на активность свободно-радикального окисления. Выраженное противовоспалительное действие обнаружено только у ПФК из древесины М. amurensis.
Практическая значимость работы. Практическая ценность работы состоит в завершении разработки нового отечественного лекарственного средства - препарата "Максар". В частности, были разработаны аналитические методы определения его качества и подлинности, разработана нормативная документация и осуществлены регистрация на территории Российской Федерации, а также промышленные выпуски этого препарата. Препарат "Маакии амурской экстракт сухой" введен в государственный Реестр лекарственных средств как новая фармацевтическая субстанция, а растение маакия амурская внесено в государственный Реестр лекарственных растений России. Высокая гепатопротективная активность препарата "Максар" подтверждена результатами клинических испытаний.
Автор участвовал в создании перспективных для углубленного фармакологического изучения и последующего промышленного производства клеточных культур L. erythrorhizon, Е. sericeum, М. amurensis, V. amurensis, Т. cuspidata, являющихся воспроизводимыми источниками полифенольных и хиноидных соединений. Они могут быть объектами последующего внедрения.
Апробация работы и публикации. Результаты работы доложены: на 45th Arctic sci. conf. "Bridges of the science between North America and the Russian Far East", 25-27 Aug., 1994, Anchorage, Alaska, 29 Aug. - 2 Sept., 1994, Vladivostok, Russia; VII Междунар. съезд, Санкт-Петербург-Пушкин, 3-5 июля 2003 г.; The 8th Intern, congr. "Actual problems of creation of new medicinal preparations of natural origin" Phytopharm 2004, June 21-23, 2004, Mikkeli, Finland; 2nd Intern, conf. on natural products and physiologically active substances (ICNPAS-2004) and 3rd EuroAsian heterocyclic meet. "Heterocycles in organic and combinatorial chemistry" (EAHM-2004), Novosibirsk, Russia, Sept. 12-17, 2004; IX Междунар. съезд ФИТОФАРМ 2005 и конф. молодых ученых Европейского фитохим. о-ва "Растения и здоровье", Санкт-Петербург, 22-25 июня 2005; Междунар. науч.-практ. конф., посвящ. 70-летию кафедры фармакологии ДГМА и 70-летию проф. Ш.М. Омарова.
- Махачкала, 2006; III Всерос. конф., 23-27 апр. 2007 г.; Thirteenth intern, biotechnology symp. and exhibition, Oct. 12-17, 2008, Dalian, China; IV Всерос. конф., Барнаул, 21-23 апр. 2009 г.; Междунар. науч.-практ. конф. "Фармация Казахстана: интеграция науки, образования и производства" Шымкент, Казахстан, 2009. По материалам диссертации опубликовано 80 работ, из них 38 статей в рецензируемых журналах из списка ВАК и 6 патентов.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из Введения, Литературного обзора, посвященного строению, биогенезу, биологическим свойствам, функциям и распространению в растениях полифенольных и хиноидных соединений, Обсуждения результатов, где приведены и обсуждены полученные результаты экспериментов, Экспериментальной части, в которой описаны приборы, биологический материал, используемый в работе, а также основные методики и эксперименты. В конце диссертации приведены Выводы и Список цитируемой литературы. Работа изложена на 401 страницах, содержит 59 таблиц и 53 рисунка. Список литературы включает 670 цитируемых работ.
Благодарности. Автор благодарит к.х.н. В.А. Денисенко, к.ф.-м.н. В.П. Глазунова, к.х.н. П.С. Дмитренка за съемку ЯМР, КД, ИК, масс-спектров; член-корр. РАН В.П. Булгакова и к.б.н. К.В. Киселева за предоставленные клеточные культуры растений и помощь в работе с ними. Автор выражает благодарность профессору Я.Ф. Звереву и его сотрудникам (Алтайский государственный медицинский университет), профессору М.Б. Плотникову и его сотрудникам (ГУ НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН), д.б.н. B.C. Чучалину (Сибирский государственный медицинский университет) и к.б.н. В.И. Яньковой (Владивостокский филиал ДВНЦ физиологии и патологии дыхания СО РАМН -НИИ медицинской климатологии и восстановительного лечения) - за проведение фармакологических исследований препаратов.
Используемые сокращения: ИГН - изогексенилнафтазарины; ИГБФ -изогексенилбензохинонилфураны; ТСХ - тонкослойная хроматография; ВЭЖХ -высокоэффективная жидкостная хроматография высокого давления; ДФПГ - 1,1-дифенил-2-пикрилгидразил; КД - спектры кругового дихроизма; ЯМР 1Н и 13С -спектроскопия ядерного магнитного резонанса на протонах и ядрах углерода; с -синглет; д - дублет; м.д. - миллионные доли; COSY - корреляционная спектроскопия; HSQC - эксперимент ЯМР гетероядернои корреляции через одну связь; НМВС - эксперимент ЯМР гетероядернои корреляции через несколько связей; FABMS - масс-спектр бомбардировки быстрыми атомами с прямым вводом вещества; ПН - спиртовый экстракт клеточной культуры Е. sericeum ЕМ; ПВ - спиртовый экстракт клеточной культуры L. erythrorhizon ВК-39; ПФК -полифенольные комплексы; ПФКД, ПФКК - полифенольные комплексы из древесины и клеточной культуры М. amurensis; ACT -аспартатаминотрансфераза; АЛТ - аланинаминотрансфераза; ЩФ - щелочная фосфатаза; ГТФ - глутатионтрансфераза; ПОЛ - перекисное окисление липидов; ТБРП - продукты ПОЛ, реагирующие с тиобарбитуровой кислотой; ОПА - общая прооксидантная активность; СОД - супероксиддисмутаза; ГПО -глутатионпероксидаза; ОАА - общая антиоксидантная активность; ГЛП -гиперлипопротеинемия; ЛПНП - липопротеины низкой плотности; ЛПВП -липопротеины высокой плотности; ХС - холестерин; а-ТФ - а-токоферол; ДК -диеновые конъюгаты; АОС - антиоксидантная система организма; АОЗ -антиоксидантная защита в организме животных; ОВУ - относительные времена удерживания веществ; ГСО - государственный стандартный образец; МДА -малоновый диальдегид.
